Name: Incubateur de plateformes avec Movable XY Stage: Une nouvelle plate-forme pour la mise en œuvre de l’oxydation photochimique rapide en cellule des protéines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 50 s
Description: Découvrez l'oxydation photochimique rapide de protéines (FPOP) in-cell automatisée sur plateforme six-puits avec incubateur PIXY. Cette méthode réduit le temps d'analyse à 20 secondes par échantillon et améliore la couverture protéique pour l'étude des interactions et dynamiques structurales cellulaires.

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Ces travaux ont été appuyés par une subvention des NIH R01 GM128983-01.

<ol><li>Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+%28FPOP%29%3A+A+powerful+mass+spectrometry+based+structural+proteomics+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (32), 11969-11979 (2019).</li>
<li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-Based+Protein+Footprinting+for+Higher-Order+Structure+Analysis%3A+Fundamentals+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications.</a> Chemical Reviews. 120 (10), 4355-4454 (2019).</li>
<li>Li, J., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+coupled+with+mass+spectrometry+in+protein+therapeutics+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">The use of fast photochemical oxidation of proteins coupled with mass spectrometry in protein therapeutics discovery and development.</a> Drug Discovery Today. 24 (3), 829-883 (2019).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+Labeling+with+an+%CE%B1%2C%CE%B2-Unsaturated+Carbonyl+Scaffold+for+Studying+Protein+Structure+and+Interactions+by+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Covalent Labeling with an α,β-Unsaturated Carbonyl Scaffold for Studying Protein Structure and Interactions by Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 92 (9), 6637-6644 (2020).</li>
<li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Flash+Photolysis+of+Hydrogen+Peroxide+to+Oxidize+Protein+Solvent-Accessible+Residues+on+the+Microsecond+Timescale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Laser Flash Photolysis of Hydrogen Peroxide to Oxidize Protein Solvent-Accessible Residues on the Microsecond Timescale.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li>
<li>Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-Based+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+%28FPOP%29+for+Higher+Order+Structure+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).</li>
<li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+generated+by+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+reflect+the+native+conformations+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Modifications generated by fast photochemical oxidation of proteins reflect the native conformations of proteins.</a> Protein Science. 27 (6), 1047-1056 (2018).</li>
<li>Hambly, D., Gross, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+flash+photochemical+oxidation+to+locate+heme+binding+and+conformational+changes+in+myoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Laser flash photochemical oxidation to locate heme binding and conformational changes in myoglobin.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 259 (1), 124-129 (2007).</li>
<li>Yan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+%28FPOP%29+maps+the+epitope+of+EGFR+binding+to+adnectin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) maps the epitope of EGFR binding to adnectin.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 25 (12), 2084-2092 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., Wecksler, A. T., Molina, P., Deperalta, G., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Binding+Interface+of+VEGF+and+a+Monoclonal+Antibody+Fab-1+Fragment+with+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+%28FPOP%29+and+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Mapping the Binding Interface of VEGF and a Monoclonal Antibody Fab-1 Fragment with Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) and Mass Spectrometry.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (5), 850-858 (2017).</li>
<li>Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Cell+Footprinting+Coupled+with+Mass+Spectrometry+for+the+Structural+Analysis+of+Proteins+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry for the Structural Analysis of Proteins in Live Cells.</a> Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).</li>
<li>Rinas, A., Mali, V. S., Espino, J. A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Microflow+System+for+In-Cell+Footprinting+Coupled+with+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of a Microflow System for In-Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 88 (20), 10052-10058 (2016).</li>
<li>Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+In-Cell+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+in+a+Platform+Incubator+with+a+Movable+XY+Stage%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage.</a> Analytical Chemistry. 92 (2), 1691-1696 (2019).</li>
<li>Bangel-Ruland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator-mRNA+delivery%3A+a+novel+alternative+for+cystic+fibrosis+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis gene therapy.</a> The Journal of Gene Medicine. 15 (11-12), 414-426 (2013).</li>
<li>Gau, B. C., Chen, H., Zhang, Y., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfate+Radical+Anion+as+a+New+Reagent+for+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sulfate Radical Anion as a New Reagent for Fast Photochemical Oxidation of Proteins.</a> Analytical Chemistry. 82 (18), 7821-7827 (2010).</li>
<li>Xu, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyl+Radical-Mediated+Modification+of+Proteins+as+Probes+for+StructuralProteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews.+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Hydroxyl Radical-Mediated Modification of Proteins as Probes for StructuralProteomics.</a> Chemical Reviews. American Chemical Society. 107 (8), 3514-3543 (2007).</li>
<li>Espino, J. A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+Biological+Interactions+with+In+Vivo+Protein+Footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Illuminating Biological Interactions with In Vivo Protein Footprinting.</a> Analytical Chemistry. 9 (10), 6577-6584 (2019).</li>
<li>Gau, B. C., Sharp, J. S., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Photochemical+Oxidation+of+Protein+Footprints+Faster+than+Protein+Unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fast Photochemical Oxidation of Protein Footprints Faster than Protein Unfolding.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6563-6571 (2009).</li>
<li>Kaur, U., Johnson, D. T., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+Applicability+of+In-Cell+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+across+Multiple+Eukaryotic+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Validation of the Applicability of In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins across Multiple Eukaryotic Cell Lines.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1372-1379 (2020).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent. La recherche présentée ci-dessous est associée à la demande de brevet ci-dessous référencée : Numéro de demande de brevet non provisoire des États-Unis : 17/042 565 Titre: « Device and Method for Determining Protein Folding » Numéro de dossier UMB: LJ-2018-104 UMass Réf: UMA 18-059.

Les protéines effectuent une grande partie du travail dans les cellules vivantes. Compte tenu de cette importance, des données détaillées sur la fonction protéique et la structure de l’ordre supérieur (HOS) dans l’environnement cellulaire sont nécessaires pour approfondir la compréhension des subtilités dans les grands complexes et les réactions enzymatiques dans les cellules par opposition aux systèmes purifiés. Pour ce faire, une méthode d’impression de pieds de protéine radicale hydroxyle (HRFP) a été adoptée intitulée Oxydation photochimique rapide des protéines (IC-FPOP). La plupart des études FPOP ont été faites in vitro dans des systèmes protéiques relativement purs, ce qui contraste nettement avec l’environnement moléculaire surpeuplé qui affecte les interactions contraignantes et la dynamique conformationnelle des protéines. En conséquence, il y a un gouffre entre les résultats des expériences in vitro 18 et ceux qui seraient obtenus dans un environnement cellulaire réel. Pour combler le fossé entre les conditions idéalisées d’une expérience FPOP in vitro et la nature complexe de la cellule, une nouvelle plate-forme automatisée à six puits à base de plaques cellulaires-FPOP a été développée. Cette nouvelle technologie FPOP est capable d’identifier et de caractériser ces espèces moléculaires et de retracer leurs interactions moléculaires dynamiques dans des états sains et maladies. Cette nouvelle plate-forme s’appelle Platform Incubator avec Movable XY stage (PIXY).
FPOP a été utilisé avec succès pour caractériser l’information structurelle dans le protéome. Cependant, chaque technique biologique a certaines limites qui nécessitent une amélioration supplémentaire. Des réagencés spécifiques sont nécessaires lors de la photolyse laser et pour étancher efficacement les radicaux hydroxyles non réagis. La séparation des peptides digérés peut nécessiter de grandes quantités de temps pour maximiser l’information structurelle. Cette mine d’informations peut également nécessiter une quantitation approfondie lors de l’analyse des donnéespost-SP 1. L’incubateur de plate-forme, y compris les machines périphériques nécessaires à la culture cellulaire et IC-FPOP à la plate-forme laser, est livré avec un coût élevé qui peut ne pas être réalisable pour certains laboratoires. Au fur et à mesure que des progrès continuent d’être réalisés, des logiciels et des outils d’analyse robustes devraient faire progresser la technique; dont certains sont présentés dans cette étude. Des études actuelles dans cet incubateur de plate-forme ont été réalisées sur les cellules HEK293T et dans C. elegans. La méthode IC-FPOP s’est montrée compatible avec une grande variété de lignées cellulaires, y compris l’ovaire hamster chinois (CHO), Vero, MCF-7, et mcf10-A cellules19. Puisque la méthode générale d’IC-FPOP est traduisible à cette plate-forme statique, ces lignes cellulaires devraient être aimables pour l’étude utilisant PIXY aussi bien.
IC-FPOP utilise H2O2 pour modifier oxydativement les chaînes latérales accessibles aux solvants d’acides aminés, puis discerner davantage les interactions protéiques, la structure et les effets métaboliques dans les cellules viables, ce qui est important dans la fourniture de contexte biologique. Il est essentiel avant une expérience IC-FPOP de confirmer que les cellules sont viables après l’ajout de H2O2. Les études de viabilité cellulaire ont démontré que les cellules étaient viables en présence des concentrations de H2O2 jusqu’à 200 mM 13. Il est également important de s’assurer que H2O2 est infusé à une concentration finale de 200 mM directement sur les cellules après l’enlever des supports. L’omission d’enlever complètement les médias de culture cellulaire causera des concentrations variables de H2O2. Par rapport aux conditions standard, l’augmentation du temps d’incubation à 10 secondes ainsi que l’augmentation de la concentration de H2O2 ont conduit à un plus grand nombre de protéines modifiées par IC-FPOP dans l’incubateur de plate-forme. Il est impératif d’amorcer les pompes périssaltiques avant utilisation pour s’assurer que les pompes fonctionnent correctement et que le liquide est dispersé. Si vous ne le faites pas, vous risquez de provoquer des bulles d’air dans le tube, un volume insuffisant de H2O2 pour immerger les cellules et/ou un volume insuffisant de solution d’assaisons.
Un autre problème qui peut survenir est les retards indésirables dans le système. Un exemple de ceci est le processus de vérification des commandes reçues pour les systèmes de pompe qui ajoute des retards significatifs de l’ordre de 1000 millisecondes ou plus utilisant le logiciel d’intégration. Ce problème peut être résolu en minimisant autant que possible la communication avec les pompes pendant l’expérience et en utilisant des commandes prédéfigurées à l’avance.
À l’avenir, l’objectif de PIXY est de produire un système entièrement automatisé et intégré. En plus des pompes périssaltiques, le déclenchement de l’impulsion laser sera automatisé. Un nouveau système de positionnement sera également utilisé pour le mouvement rapide de l’incubateur de plate-forme afin d’améliorer la vitesse et la précision. Tous les composants du système continueront d’être programmés à l’aide du logiciel d’intégration afin d’augmenter encore le débit.

Les techniques d’empreinte protéique peuvent révéler des informations approfondies sur l’organisation des protéines. Ces techniques essentielles de biologie structurale basées sur la SP sont un composant de la boîte à outils de spectrométrie de masse. Ces méthodes sondent la structure des états supérieurs des protéines (HOS) et la synergie par l’étiquetage covalent1,2,3,4. L’oxydation photochimique rapide des protéines (FPOP) emploie des radicaux hydroxyles pour modifier oxydativement les chaînes latérales accessibles aux solvantsd’acides aminés 5,6 (tableau 1). La méthode utilise un laser excimère à 248 nm pour la photolyse du peroxyde d’hydrogène (H2O2) pour produire des radicaux hydroxyles. Théoriquement, 19 des 20 acides aminés peuvent être modifiés oxydativement avec Gly étant la seule exception. Cependant, en raison des taux variables de réactivité des acides aminés avec des radicaux hydroxyles, la modification d’un sous-ensemble seulement de ces derniers a été observée expérimentalement. Pourtant, la méthode a le potentiel d’analyse sur la longueur d’une séquence protéique5. FPOP modifie les protéines sur l’échelle de temps de microseconde, ce qui le rend utile dans l’étude des interactions faibles avec des taux de temps rapides. L’accessibilité des solvants change lors de la liaison ligand ou d’un changement dans la conformation des protéines, de sorte que la puissance de la méthode réside dans la comparaison du modèle d’étiquetage d’une protéine dans plusieurs états (c.-à-ligand-libre par rapport à ligand-bound). En conséquence, FPOP a réussi à identifier les sites d’interaction protéine-protéine et protéine-ligand et les régions de changement conformationnel7,8,9,10. La méthode FPOP a été étendue de l’étude des systèmes protéiques purifiés à l’analyse en cellule. Le FPOP in-cell (IC-FPOP) peut modifier oxydativement plus d’un millier de protéines dans les cellules pour fournir des informations structurelles à travers le protéome11,12. La plate-forme IC-FPOP conventionnelle utilise un système d’écoulement pour faire passer les cellules d’un seul fichier au-delà du faisceau laser. Le développement de ce système a permis aux cellules individuelles d’avoir une exposition égale à l’irradiation laser. Cela a conduit à une augmentation de 13 fois le nombre de protéines oxydativement étiquetées12. Toutefois, une limitation du système d’écoulement est la longueur d’une expérience d’échantillon unique composée d’un intervalle d’irradiation de 10 minutes au cours duquel la modification a lieu et d’un cycle de lavage supplémentaire de 10 minutes. Les contraintes de temps de l’IC-FPOP le rendent impropre à l’étude des intermédiaires de pliage des protéines de courte durée ou des changements qui existent entre les réseaux d’interaction dans les cascades biochimiques de signalisation. Cette limitation temporelle a inspiré la conception d’une nouvelle plate-forme IC-FPOP équipée d’un débit plus élevé.
Pour mesurer avec précision la structure des protéines de plus haut ordre dans l’environnement cellulaire indigène, la nouvelle conception permet d’accomplir la culture cellulaire directement à la plate-forme laser, ce qui permet à IC-FPOP d’être à haut débit. Cette configuration permet également de minimiser les perturbations de l’environnement cellulaire, contrairement à IC-FPOP en utilisant le flux où les cellules adhérentes doivent être retirées du substrat. La nouvelle plate-forme permet à IC-FPOP de se produire dans un système d’incubation stérile à l’aide d’un CO2 et d’une chambre supérieure à scène à température contrôlée tout en utilisant l’optique miroir configurée pour le guidage du faisceau laser, un système de positionnement pour le mouvement XY, et des pompes périssaltiques pour l’échange chimique. La nouvelle plate-forme de conduite d’IC-FPOP s’intitule Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY) (Figure 1). Dans PIXY, IC-FPOP est réalisé sur des cellules humaines cultivées en plaques de six puits dans la chambre d’incubateur de plate-forme. Pour cette configuration, le faisceau laser est réfléchi vers le bas sur la plaque en utilisant des miroirs compatibles faisceau comme une étape de positionnement qui détient l’incubateur est déplacé, dans le plan XY, de sorte que le faisceau laser est stratégiquement aligné pour irradier un seul puits à la fois. Les études de validation montrent que l’IC-FPOP peut être exécuté plus rapidement dans PIXY que dans le système de flux et conduit à des modifications accrues des acides aminés par protéine. Le développement de cette nouvelle plate-forme IC-FPOP exposera les connaissances qui peuvent être acquises à partir d’expériencescellulaires 13.

<table><tbody><tr><td>Ismatec Reglo ICC Pompes péristaltiques</td><td>Cole-Palmer</td><td>122270050</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Support de miroir cinématique pour & Oslash ; 2" Optique</td><td>Thor Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X trypsin&minus ; EDTA</td><td>Corning</td><td>AB00490-00005</td><td></td></tr><tr><td>50.0mm 248nm 45&deg ;, Excimer Laser Line Mirror</td><td>Edmond Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acétone, Grade HPLC</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scientific Acetonitrile avec 0.1 % d’acide formique (v/v), LC/MS Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100&Aring ;, 5 & micro ; m, 180 et micro ; m x 20 mm, 2G, V/M, 1/pqt</td><td>Waters</td><td>23275</td><td>d’autres instruments haute résolution (par exemple Q exactive Orbitrap ou Orbitrap Fusion) peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC M-Class System</td><td>Waters</td><td>A53225</td><td></td></tr><tr><td>Afinia H480 Imprimante 3D</td> (<td>Innovation Space Université du Maryland Baltimore Campus Library)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pompe à air</td><td>OKOlabs</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium</td><td>Fisher Stock Scientifique</td><td>#63-120</td><td></td></tr><tr><td>Aqua 5 & micro ; m C18 125 et Aring ; matériau d’emballage</td> Unité de dioxyde de <td>carbone Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>OKOlabs</td><td>MadMotor&reg ;-UHV</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Connecteurs Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Y PP 1/16 » et 1/16x1/8 »)</td><td>Cole-Palmer</td><td>116891000</td><td></td></tr><tr><td>Delicate Task Wipers</td><td>Fisher Scientific</td><td>022625501</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreiotol (DTT)</td><td>AmericanBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Anhydrus</td><td>Invitrogen</td><td>LS118-500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s solution saline tamponnée au phosphate (DPBS)</td><td>Corning</td><td>SK-78001-82</td><td></td></tr><tr><td>EX350 laser excimer</td><td>GAM Laser PI89900</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Corning</td><td>SK-12023-78</td><td></td></tr><tr><td>Acide formique, grade LC/MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929-4</td><td>4 quantité de 4 L n’est pas nécessaire</td></tr><tr><td>HEK293T cellules</td><td>Paul Shapiro Lab (Université du Maryland, Baltimore)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>humidificateur</td><td>OKOlabs</td><td>Nano-LPMW stage</td><td></td></tr><tr><td>HV3-2 VALVE</td><td>Hamilton</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène</td><td>Fisher Scientific</td><td>LS120-500</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacétamide (IAA)</td><td>ACROS Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LABVIEW Professional 2018</td><td>National Instruments</td><td>86728</td><td></td></tr><tr><td>MadMotor Système de positionnement et contrôleurs</td><td>Mad City Labs</td><td>W6-4</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol, grade LC/MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td>n’importe quelle marque suffit</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Thermo Scientific</td><td>H301-T Unit-BL-PLUS</td><td></td></tr><tr><td>N,N&prime ;-Dimethylthiourea (DMTU)</td><td>ACROS Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanopositioing stage</td><td>Mad City Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-tert-Butyl-&alpha ;-phénylnitrone (PBN)</td><td>ACROS Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OKO Système de surveillance tactile</td><td>OKOlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>7Z02936</td><td></td></tr><tr><td>PE50-C Compteur d’énergie pyroélectrique</td><td>Ophir Optronics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce Dosage colorimétrique quantitatif des peptides</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce Rapid Gold BCA Kit de dosage des protéines</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce Trypsine Protéase, MS Grade</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002436</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Nucléase universelle pour la lyse cellulaire</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Manomètre</td><td>OKOlabs</td><td>Filtre PTFE OKO-AIR-PUMP-BL</td><td></td></tr><tr><td></td><td>OKOlabs</td><td>CO2-UNIT-BL</td><td></td></tr><tr><td>Six anneaux de filament PLA de 33 mm</td><td>(Innovation Space, University of Maryland, Baltimore Campus Library)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubateur stérile</td><td>OKOlabs Unité de température OKOlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>OKO-TOUCH</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>TiNKERcad</td><td>(Innovation Space Université du Maryland Baltimore Campus Library)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-100</td><td>tout peroxyde d’hydrogène à 30 % est un</td></tr><tr><td>tube suffisant (Tygon 3.18 et 1.59 ID)</td><td>Cole-Palmer</td><td>177350250</td><td></td></tr><tr><td>Eau avec 0,1 % d’acide formique (v/v), LC/MS Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454SK-4</td><td>4 L quantité n’est pas nécessaire</td></tr><tr><td>Eau, LC/MS Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>88702</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>90058</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>KM200</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>186007496</td><td></td></tr></tbody></table>

incubateur de plateformes avec movable xy stage: une nouvelle plate-forme pour la mise en œuvre de l’oxydation photochimique rapide en cellule des protéines

Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

L’oxydation photochimique rapide des protéines (FPOP) couplée à la spectrométrie de masse (SEP) est devenue un outil précieux dans la protéomique structurale pour interroger les interactions protéiques, la structure et la dynamique conformationnelle des protéines en fonction de l’accessibilité des solvants. Ces dernières années, la portée de FPOP, une technique d’impression de pieds de protéine radicale hydroxyle (HRPF), a été étendue à l’étiquetage des protéines dans les cultures cellulaires vivantes, fournissant les moyens d’étudier les interactions protéiques dans l’environnement cellulaire alambiqué. Les modifications des protéines dans les cellules peuvent donner un aperçu des changements structurels induits par la ligand ou des changements conformationnels accompagnant la formation complexe protéique, le tout dans le contexte cellulaire. L’empreinte protéique a été réalisée à l’aide d’un système coutumier basé sur le débit et d’un laser excimère KrF de 248 nm pour produire des radicaux hydroxyles par photolyse de peroxyde d’hydrogène, nécessitant 20 minutes d’analyse pour un échantillon de cellules. Pour faciliter les expériences FPOP résolues dans le temps, l’utilisation d’une nouvelle plate-forme IC-FPOP à base de plaques à 6 puits a été lancée. Dans le système actuel, une seule impulsion laser irradère un puits entier, ce qui tronque le délai expérimental FPOP, ce qui entraîne 20 secondes de temps d’analyse, soit une diminution de 60 fois. Ce temps d’analyse considérablement réduit permet de rechercher des mécanismes cellulaires tels que des cascades biochimiques de signalisation, le pliage des protéines et des expériences différentielle (c.-à-d. sans drogue par rapport aux médicaments) d’une manière dépendante du temps. Cette nouvelle instrumentation, intitulée Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY), permet à l’utilisateur d’effectuer la culture cellulaire et IC-FPOP directement sur le banc optique à l’aide d’un incubateur de plate-forme avec la température, le CO2 et le contrôle de l’humidité. La plate-forme comprend également une étape de positionnement, des pompes périssaltiques et une optique miroir pour le guidage du faisceau laser. Les conditions IC-FPOP telles que la configuration optique, les débits, les pasfections transitoires et la concentration de H2O2 dans PIXY ont été optimisées et évaluées par les pairs. L’automatisation de tous les composants du système réduira la manipulation humaine et augmentera le débit.

Pour confirmer que les conditions de l’incubateur de plate-forme sont suffisantes pour la culture cellulaire à la plate-forme laser, GCaMP2 a été transitoirement transposé en HEK293T et l’efficacité de transfection pour les deux plaques a été évaluée par imagerie par fluorescence (figure 4A). GCaMP2 est une protéine fluorescente de détection de calcium utilisée comme indicateur de calcium intracellulaire génétiquement codé. Il s’agit d’une fusion de protéines fluorescentes vertes (GFP) et de la protéine liant le calcium, la calmoduline. Un essai de luciferase a été exécuté sur hek 293 cellules transfectées avec le prl-TK plasmide afin de quantifier l’efficacité de transfection (figure 4B). Ces résultats montrent que l’incubateur de plate-forme a dépassé les performances de l’incubateur standard, avec une augmentation de 1,13 fois l’efficacité de la transfection, fournissant une référence quantitative pour l’environnement optimal de culture cellulaire.
Les modifications FPOP dans les cellules HEK293T étiquetées dans le système d’écoulement ont été comparées à celles étiquetées dans l’incubateur de plate-forme et ont montré que l’incubateur de plate-forme surpasse le système de flux à la fois dans le nombre de protéines modifiées (figure 5) et la couverture totale FPOP dans ces protéines. Le nombre de protéines modifiées FPOP acquises dans l’incubateur de plate-forme était d’environ 1051, soit 2,2 fois plus que ceux acquis dans le cadre d’une expérience typique. Des modifications ont été combinées entre deux répliques biologiques pour chaque expérience. En outre, PIXY offre un débit plus élevé.
Pour démontrer l’avantage d’une couverture de modification plus élevée à travers une protéine, les modifications IC-FPOP ont été localisées sur le niveau de peptide et l’étendue de la modification a été quantifiée pour distinguer les différences dans les résultats entre les systèmes pour l’actine, une protéine d’acide aminé de 375. Dans le système d’écoulement, deux peptides modifiés ont été détectés, fournissant des renseignements structurels limités( figure 6A). Cependant, cinq peptides modifiés couvrant la séquence d’actine ont été détectés dans l’incubateur de plate-forme. Les spectres de masse tandem indiquent que les résidus Pro322 ont été modifiés et détectés dans chaque expérience( figure 6B). Les cinq peptides modifiés dans les échantillons de l’incubateur de la plate-forme contenaient douze résidus modifiés, tandis que seulement quatre résidus ont été modifiés avec le système d’écoulement (figure 6C). L’augmentation de la couverture d’oxydation fournit plus d’informations structurelles à travers la protéine.
Espino et coll. ont démontré la capacité de FPOP à être exécuté in vivo (IV-FPOP) au sein de C. elegans, un modèle de ver pour les états de maladie humaine17. Alors que IV-FPOP est également effectué via un système de flux, le système PIXY a été testé pour la compatibilité avec les vers. Environ 10 000 vers ont été incubés dans chaque puits de l’incubateur de plate-forme à 20 °C. LC−MS/MS analyse a révélé que 792 protéines ont été modifiées par IV-FPOP dans l’incubateur de plate-forme par rapport aux 545 protéines modifiées avec le système d’écoulement (figure 7). Ces résultats démontrent qu’en plus de la culture cellulaire 2D, cette nouvelle méthodologie est également compatible avec l’étude d’autres systèmes biologiques tels que C. elegans.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig01.jpg"> Figure 1. Schéma du système PIXY. Composants du système : (A) incubateur de dessus de scène, (B) système de positionnement , (C) pompes périssaltiques, et (D) lignes de perfusion. Les supports de culture cellulaire sont retirés de chaque puits par l’intermédiaire de pompes avant h2O2 et les solutions d’étanchéation sont infusées à des points de temps calculés. Chemin laser pour irradiation présenté en blanc. Réimprimé avec la permission de Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Chimie analytique, 92(2), 1691-1696 2019. Droit d’auteur 2020 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig01large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig02.jpg"> Figure 2. Système PIXY entièrement assemblé. (A) Système de surveillance tactile, (B) unité de dioxyde decarbone,( C ) unité de température, (D) pompe à air, (E) humidificateur, (F) miroirs optiques, (G) incubateur de plate-forme, (H) stade de positionnement, (I) 248nm KrF excimer laser, et (J) pompes périssaltiques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig02large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig03.jpg"> Figure 3. Automatisation des pompes périsaltiques. (A) Exemple de script de commande dans LABVIEW. Les options de commande incluent le volume, le débit, les pauses, la direction du flux. La vitesse, la distance de l’étape et l’emplacement sont actuellement automatisés. (B) Lecteur de script dans LABVIEW. Ici, les scripts de commande sont téléchargés puis exécuter la séquence et START sont pressés d’initier des pompes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig03large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig04.jpg"> Figure 4. Efficacité de transfection de cellules HEK. (A) Intensité fluorescente moyenne de la comparaison de transfection GCaMP2 entre l’incubateur standard (Control) et l’incubateur de scène (PIXY). Les points et les carrés représentent chaque point dans un puits où une mesure a été prise. (B) Efficacité de transfection quantitée et validée avec un plasmide vecteur différent, pRL-TK. Valeur P&lt; 0,005. Réimprimé avec la permission de Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Chimie analytique, 92(2), 1691-1696 2019. Droit d’auteur 2020 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig04large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig05.jpg"> Figure 5. Comparaison des protéines modifiées dans le système d’écoulement cellulaire unique et PIXY. Diagramme venn de protéines modifiées à l’aide du système d’écoulement (violet) et dans PIXY (vert). Réimprimé avec la permission de Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Chimie analytique, 92(2), 1691-1696 2019. Droit d’auteur 2020 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig05large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig06.jpg"> Figure 6. Localisation des modifications IC-FPOP. Comparaison des modifications IC-FPOP entre les systèmes. (A) Graphique à barres de peptides modifiés oxydatifs dans l’actine du système d’écoulement (violet) vs incubateur de plate-forme (vert). (B) Spectres tandem MS de l’actine (peptide 316-326) avec proline modifiée dans les deux systèmes et peptide d’actine non modifié (C) Résidus modifiés FPOP d’actine (PDB : 6ZXJ, chaîne A 11 résidus modifiés dans l’incubateur de plate-forme (vert), 3 résidus modifiés dans le système d’écoulement (violet), 1 résidu modifié se chevauchant (jaune). Réimprimé avec la permission de Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Chimie analytique, 92(2), 1691-1696 2019. Droit d’auteur 2020 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig06large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62153/62153fig07.jpg"> Figure 7. Comparaison des protéines modifiées FPOP dans C. elegans par flux vs PIXY. Il y a une augmentation de 1,5 fois des protéines oxydativement modifiées utilisant PIXY par rapport au système d’écoulement. Réimprimé avec la permission de Johnson, D. T., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L.M., Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins in a Platform Incubator with a Movable XY Stage. Chimie analytique, 92(2), 1691-1696 2019. Droit d’auteur 2020 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/62153fig07large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Tableau 1. Distribution de modification de flux de travail et décalages de masse (Da). Veuillez <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62153/Table%201.docx" target="_blank">cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

Une nouvelle plate-forme statique est utilisée pour caractériser la structure protéique et les sites d’interaction dans l’environnement cellulaire indigène en utilisant une technique d’empreinte protéique appelée oxydation photochimique rapide des protéines (IC-FPOP).

Incubateur de plateformes avec Movable XY Stage: Une nouvelle plate-forme pour la mise en œuvre de l’oxydation photochimique rapide en cellule des protéines

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate ...

Cette méthode fournit des solutions aux questions biologiques exigeantes d’aujourd’hui. À partir d’une expérience FPOP en cellule, nous pouvons étudier les interactions protéine-ligand, les sites d’interaction protéine-protéine et les régions de changement conformationnel. L’avantage de cette technologie est l’utilisation d’une plate-forme IC-FPOP automatisée à six puits à base de plaques qui permet de cultiver des cellules et d’effectuer des études FPOP en cellule directement au laser.Cette méthode peut être utilisée dans les industries pharmaceutiques et biotechnologiques, ainsi que dans les principaux instituts de recherche universitaires et cliniques, en particulier par les chercheurs biologiques des universités qui étudient la dynamique des protéines. Pour commencer, dévissez l’incubateur de la plate-forme du stade de positionnement et déconnectez les lignes de température, de gaz et d’humidificateur. Vaporiser l’incubateur de 70% d’éthanol et le placer dans le capot de culture cellulaire.Retirez la plaque de six puits de l’incubateur de la plate-forme, fixez le couvercle d’origine de la plaque et confirmez la confluence cellulaire à l’aide d’un microscope, puis placez la plaque de six puits avec des cellules confluentes dans l’incubateur de la plate-forme à l’intérieur du capot de culture cellulaire. Insérez trois tubes Tygon prédéprimés dans chaque puits via les ports intégrés en rinçant les tubes vers les murs du puits et fixez-les avec des anneaux imprimés 3D personnalisés. Préparez un script logiciel d’intégration pour le retrait de la pompe.Utilisez une pompe périssaltique pour retirer complètement les médias cellulaires des six puits. Les solvants de premier choix dans chaque canal des trois autres pompes périssaltiques, puis infusent le peroxyde d’hydrogène et le tampon de désaltérant dans leurs tubes alternatifs respectifs jusqu’à ce que les reagents atteignent les ports de l’incubateur. Confirmez que le faisceau laser a été incliné correctement et atteint l’incubateur décomplexé.Vérifiez l’énergie laser à l’aide d’un capteur externe. Préparez le script logiciel d’intégration pour l’infusion de la pompe après confirmation de l’alignement du faisceau. Infuser du peroxyde d’hydrogène de 200 millimlaires à 35 millilitres par minute dans le premier puits.Appuyez sur le bouton de démarrage sur le logiciel laser à la marque de cinq secondes pour déclencher l’impulsion à la marque de 11 secondes sur la mise à jour. Infuser la solution Quench de 125 millimlaires à 35 millilitres par minute dans le premier puits immédiatement après l’impulsion laser. Déplacez manuellement l’étape de positionnement pour aligner le puits suivant avec le faisceau laser et répéter le processus pour tous les puits.Dans un capot de culture cellulaire, utilisez un grattoir cellulaire pour transférer les cellules de chaque puits en tubes coniques individuels de 15 millilitres. Cellules centrifugeuses à 1200 fois G pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et résuspendez les cellules dans 100 microlitres de tampon de lyse RIPA.Transférer les cellules vers des tubes individuels de polypropylène de 1,2 millilitre. Congelez tous les échantillons dans de l’azote liquide et placez-les dans un congélateur à moins 80 degrés jusqu’à utilisation. Pour localisér les modifications FPOP, analyser le lysate de cellules digéré à l’aide de l’analyse de spectrométrie de masse tandem chromatographie liquide, puis calculer l’étendue de la modification.Pour confirmer que les conditions de l’incubateur de plate-forme sont suffisantes pour la culture cellulaire à la plate-forme laser, GCaMP2 a été transitoirement transposé en HEK293T et l’efficacité de transfection pour les deux plaques a été évaluée par imagerie par fluorescence. Un essai de luciferase a été exécuté pour quantifier l’efficacité de transfection. Les modifications FPOP dans les cellules HEK293T étiquetées dans le système d’écoulement ont été comparées à celles étiquetées dans l’incubateur de plate-forme.L’incubateur de plateformes a surpassé le système de flux tant dans le nombre de protéines modifiées que dans la couverture totale de FPOP dans ces protéines. Dans le système d’écoulement, deux peptides modifiés ont été détectés, fournissant des informations structurelles limitées. Cependant, cinq peptides modifiés couvrant la séquence d’actine ont été détectés dans l’incubateur de plate-forme.Les spectres tandem ms de l’actine avec proline modifiée dans les deux systèmes et peptide d’actine non modifié sont montrés ici. Les résidus modifiés FPOP dans les échantillons de l’incubateur de la plate-forme contenaient 12 résidus modifiés, trois résidus modifiés dans le système d’écoulement et un résidu modifié qui se chevauchait. L’analyse de la SP LC-MS a révélé que 792 protéines ont été modifiées par in vivo FPOP dans l’incubateur de plate-forme par rapport aux 545 protéines modifiées avec le système d’écoulement.Il est impératif de maintenir les cellules dans des conditions stériles. Apportez toujours l’incubateur de plate-forme dans le capot stérile de culture cellulaire pour insérer toutes les plaques, tubes et anneaux nécessaires de six puits. Cela garantit l’intégrité de l’expérience.

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