Name: Ciblage de l’ARN omniprésent et spécifique aux tissus chez Drosophila Melanogaster à l’aide de CRISPR/CasRx (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Découvrez le ciblage d'ARN omniprésent et spécifique aux tissus chez Drosophila melanogaster à l'aide du système CRISPR/CasRx. Ces protocoles permettent une réduction programmable efficace des transcrits in vivo avec évaluation des phénotypes.

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Ce travail a été soutenu en partie par un financement provenant d’une subvention du programme DARPA Safe Genes (HR0011-17-2-0047) et de prix NIH (R21RAI149161A, DP2AI152071) décernés à O.S.A.

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O.S.A est l’un des fondateurs d’Agragene, Inc., détient une participation au capital et siège au conseil consultatif scientifique de la société. Les termes de cet arrangement ont été examinés et approuvés par l’Université de Californie à San Diego conformément à ses politiques en matière de conflits d’intérêts. Tous les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Avec trois conceptions d’application différentes du système CasRx, ce travail a démontré le ciblage in vivo de l’ARN programmable chez les mouches. Les différentes stratégies répondent à différents besoins du projet, tels que le ciblage des gènes endogènes par rapport aux gènes exogènes et le ciblage de l’ARN omniprésent par rapport à l’ARN spécifique aux tissus. Les effets du ciblage de l’ARN comprenaient des changements phénotypiques spécifiques au gène cible, une réduction du transcript de l’ARN cible et des phénotypes de létalité occasionnels associés à une expression élevée de la protéine CasRx et à une activité collatérale. Dans l’ensemble, ces résultats ont montré que le système CasRx est capable de cibler la réduction des transcriptions d’ARN au niveau de l’organisme de manière programmable et efficace.
L’un des facteurs clés de la personnalisation réussie du système CasRx est la conception des ARNg. Plus précisément, les conseils suivants doivent être pris en compte: la séquence cible est d’environ 30 nucléotides de longueur, la longueur des étirements poly-U dans la séquence cible est de 4 paires de bases ou moins, la teneur en GC de la séquence cible est comprise entre 30% et 70%, la séquence cible ne devrait pas former de fortes structures en épingle à cheveux d’ARN et la séquence cible contient une structure secondaire ou tertiaire minimale prédite5.
En plus des conceptions d’ARNg, l’étape de la génétique des mouches dans chaque protocole est également essentielle à une mise en œuvre réussie. La présence ou l’absence des phénotypes définis transmis par les parents dans les progénitures est importante pour identifier et quantifier les phénotypes induits par le système CasRx dans les progénitures transhétérozygotes. En outre, la mise en place de croisements de contrôle à l’aide des mouches dCasRx en parallèle est également utile pour exclure les phénotypes non spécifiques dans les progénitures transhétérozygotes.
Il convient de noter que ces résultats ont révélé un problème de toxicité introduit par l’expression omniprésente de casrx et de protéines dCasRx chez la mouche, une limitation du système CasRx. L’expression omniprésente de CasRx ou dCasRx sous le promoteur Ubiq seul, sans aRNg, entraînait des coûts de remise en forme non triviaux, car ni les mouches Ubiq-CasRx ni Ubiq-dCasRx ne pouvaient être établies comme des lignées homozygotes. Au contraire, les mouches UASt-CasRx et UASt-dCasRx peuvent être établies comme des stocks homozygotes sains, bien qu’en raison de la conception du schéma croisé, elles aient été conservées en tant que stocks à double équilibre, un fait qui soutient l’existence d’une toxicité induite par l’expression omniprésente de la protéine CasRx. Une autre preuve à l’appui est que dans les expériences de contrôle impliquant dCasRx, qui est catalytiquement inactif, les pourcentages de mouches porteuses à la fois de dCasRx et de constructions d’ARNg sur le nombre total de mouches de la génération F1 étaient systématiquement inférieurs à 50%, le rapport attendu sur la base de la génétique mendélienne si aucune toxicité associée à dCasRx n’était présente. Cela indique que l’expression omniprésente de dCasRx, ainsi que des ARNg, induit une toxicité chez la mouche, ce qui entraîne un rapport d’hérédité inférieur à celui prévu. Les rapports d’hérédité des mouches transhétérozygotes UASt-dCasRx, arno gRNA, GAL4 ont suivi la génétique mendélienne, ce qui suggère à nouveau la toxicité induite spécifiquement par l’expression omniprésente des protéines CasRx et dCasRx. La toxicité dans le système CRISPR/Cas n’est pas nouvelle. Il a été démontré que de grandes quantités de protéine Cas9 sont toxiques chez plusieurs organismes, y compris les mouches29,30,31,32. Une étude récente a développé un système GAL4/UAS personnalisé qui peut régler la quantité de protéine Cas9 exprimée chez les mouches en ajoutant un cadre de lecture ouvert de longueur variable entre la séquence UAS et la séquence Cas9 dans la construction UAS-Cas933. Par conséquent, il vaut la peine d’explorer des moyens de réduire la toxicité induite par CasRx en ajustant le niveau d’expression de la protéine CasRx.
Outre la toxicité induite par l’expression omniprésente des protéines CasRx et dCasRx, les résultats ont également montré une létalité liée aux effets collatéraux non spécifiques hors cible du système CasRx, une caractéristique de nombreux systèmes CRISPR1,2,7,34. Chez certaines des mouches transhétérozygotes double ou triple exprimant l’ARN gRx et le gène non essentiel, par exemple lors du ciblage de Notch, les mouches CasRx transhétérozygotes ont un taux de survie significativement inférieur à celui des mouches dCasRx transhétérozgyes. Dans l’analyse de séquençage de l’ARN de ces mouches transhétéérozygotes exprimant CasRx et gRNA, la réduction des niveaux de transcription des gènes cibles et la réduction des transcriptions des gènes non cibles ont été observées. Ces effets collatéraux étaient dépendants de CasRx et dépendants de la cible, car ils n’ont été observés que chez les mouches transhétérozygotes exprimant à la fois la protéine CasRx et l’ARNg. Il convient de souligner que l’un des gènes cibles, le blanc, n’a montré qu’une réduction limitée et non statistiquement significative des transcriptions lorsque le gène blanc était ciblé par CasRx, ce qui contrastait avec le phénotype de réduction pigmentaire claire. On suppose que cela peut être dû au fait que 1) le moment de la collecte de l’échantillon d’ARN-seq n’était pas bien aligné avec le moment où le gène blanc atteint son apogée d’expression au début du développement, et 2) l’expression localisée du gène blanc dans les yeux rend difficile la collecte des tissus pertinents au début de la phase de développement lorsque seule la collecte d’échantillons du corps entier est possible. Pour réduire l’activité collatérale dans le système CasRx, des études futures sont nécessaires pour bien comprendre les mécanismes sous-jacents au système de phénomène hors cible au niveau de l’organisme.
Fait intéressant, une étude récente35 décrivant des outils Cas13 ciblant l’ARN chez les mouches semblait améliorer la toxicité générale associée à l’expression de CasRx, pour plusieurs raisons possibles. Tout d’abord, les auteurs ont recodé les transgènes Cas13 pour optimiser l’expression chez la drosophile et ont utilisé un promoteur plus faiblement exprimant (actine 5C) par rapport au promoteur de l’ubiquitine utilisé dans la présente étude, conduisant probablement à des niveaux plus faibles d’expression de Cas13 et donc moins de toxicité. En effet, cela est corroboré par les observations selon lesquelles l’expression de CasRx et de dCasRx pilotée par UASt n’était pas, en soi, toxique, car cette étude (et les auteurs dans 35) n’a observé aucune létalité évidente chez les mouches UASt-CasRx. De plus, ces auteurs ont codé leurs ARNg différemment par rapport à cette étude, ce qui pourrait avoir affecté leur expression et réduit la toxicité du système chez les mouches transhétérozygotes Cas13/ ARNg. Par exemple, dans leur étude, deux ARNg ont été exprimés à l’aide du promoteur U6:3 et flanqués d’ARNt pour permettre le traitement de l’ARNg lors de la maturation de l’ARNt sans nécessiter CasRx35. Inversement, dans cette étude, les ARNg ont été codés comme des réseaux ciblant jusqu’à 4 emplacements par gène et imitant la structure endogène du réseau Cas13 trouvée dans les bactéries, ce qui nécessite l’enzyme Cas13 pour traiter chaque ARNg. Ces différentes approches peuvent avoir conduit à des différences dans les niveaux d’expression de l’ARNg et d’autres facteurs qui peuvent avoir des effets inhérents sur la toxicité de l’ensemble du système. Enfin, Huynh et al. ont ciblé des gènes différents de ceux ciblés dans la présente étude, ce qui entraîne des différences dans l’interaction cible-Cas/ARNg et l’activité collatérale et peut avoir des effets sur les niveaux de létalité observés. Ces différences dans la toxicité observée justifient des recherches plus approfondies afin de déterminer les moyens d’améliorer l’ensemble des systèmes.
Dans l’ensemble, cette étude est la première démonstration d’un système Cas fonctionnel ciblant l’ARN programmable génétiquement codé chez D. melanogaster, bien qu’une optimisation supplémentaire du système CasRx (conformément à ce qui est rapporté35) sera nécessaire pour réduire davantage la létalité associée hors cible et augmenter l’efficacité du clivage CasRx sur cible. Le ciblage de l’ARN avec les enzymes Cas est un domaine en évolution rapide avec de nombreuses applications potentielles allant de la lutte contre les insectes vecteurs aux utilisations thérapeutiques1,2,3,4,5,6,7, et ce protocole offre un package de démarrage pour toute personne intéressée par la conception de son premier système CasRx chez les mouches, tout en étant compatible avec la personnalisation et l’optimisation ultérieure du système. Les exemples présentés ici démontrent une gamme de résultats que l’on peut rencontrer lors de la mise en œuvre de ce système in vivo et peuvent servir de références pour d’autres utilisateurs dans l’évaluation des performances du système CasRx dans leurs applications.

Depuis l’avènement des technologies CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), l’accent a été mis en grande partie dans ce domaine sur l’édition de l’ADN, qui offre des applications transformatrices en médecine et en biotechnologie1. Cependant, l’altération permanente des séquences d’ADN n’est pas toujours souhaitée pour des raisons éthiques. À la lumière de cela, des études récentes ont commencé à développer des outils basés sur CRISPR pour cibler l’ARN et ont démontré que les technologies CRISPR peuvent effectivement être utilisées pour le ciblage de l’ARN dans une variété de systèmes biologiques2,3,4,5,6,7. Dans bon nombre de ces systèmes testés, l’approche actuelle largement utilisée pour cibler la réduction de l’ARN et des transcriptions est l’interférence ARN (ARNi), qui est loin d’être parfaite, présentant souvent une efficacité variée et une activité hors cible élevée lorsqu’elle est utilisée in vivo8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Par conséquent, compte tenu de l’état de ces technologies, il convient d’explorer davantage les potentiels des outils basés sur CRISPR pour le ciblage de l’ARN.
Une étude récente notable a rapporté que la ribonucléase CasRx, un membre de la classe Cas13d, peut réduire efficacement les niveaux de transcription des gènes dans la culture cellulaire humaine et possède un profil hors cible attrayant4. Cette découverte a conduit à la question de savoir si cette nouvelle ribonucléase peut maintenir son efficacité et son faible taux hors cible pour le ciblage de l’ARN au niveau de l’organisme. Une étude récente a abordé cette question en montrant que le système CasRx peut être utilisé pour obtenir une réduction du transcript génique omniprésente et spécifique aux tissus chez Drosophila melanogaster5.
Pour rationaliser la convivialité de cette approche récemment publiée, ce protocole détaille les méthodes de ce travail récent, qui se compose de trois parties principales: 1) ciblage in vivo omniprésent de l’ARN à l’aide d’un système CasRx à deux composants; 2) ciblage in vivo de l’ARN exogène omniprésent à l’aide d’un système CasRx à trois composants; et 3) le ciblage de l’ARN in vivo spécifique aux tissus à l’aide d’un système CasRx à trois composants.
Des ARN guides (ARNg) ciblant différents gènes cibles sous le contrôle d’un promoteur omniprésent ont été conçus et des lignées de mouches exprimant ces constructions contenant de l’ARNg ont été générées. Des constructions CasRx sous le contrôle d’un promoteur omniprésent ou d’un promoteur de séquence d’activation conditionnelle en amont (UASt) activable par le facteur de transcription GAL4 ont également été conçues et des lignes de vol hébergeant ces constructions contenant CasRx générées. Les constructions CasRx catalytiquement inactives, dCasRx, ont été conçues et utilisées comme témoins négatifs. Le ciblage de l’ARN omniprésent chez les mouches est réalisé en croisant des lignées de mouches exprimant l’ARNg avec des lignes de mouches exprimant CasRx de manière omniprésente. La progéniture exprimant à la fois la construction de l’ARNg ciblant un transcrit de gène spécifique et la protéine CasRx a une réduction omniprésente des transcriptions de gènes ciblés. Le ciblage de l’ARN spécifique aux tissus chez les mouches est réalisé en croisant d’abord des mouches exprimant l’ARNg avec des mouches exprimant UASt-CasRx, obtenant des mouches transhétérozygotes portant à la fois des constructions d’ARNg et d’UASt-CasRx. Ces mouches sont à leur tour croisées avec des mouches exprimant GAL4 spécifiques aux tissus, ce qui entraîne la génération d’expression de CasRx spécifique aux tissus et le ciblage de l’ARN chez les mouches.
La nature programmable du système CasRx offre la possibilité de personnalisation et d’optimisation pour aider à atteindre une efficacité élevée et une faible activité hors cible pour le ciblage in vivo de l’ARN. Les applications potentielles du ciblage de l’ARN à base de CRISPR sont nombreuses, notamment le remplacement de l’ARNi en laboratoire et la contribution à la lutte contre les insectes vecteurs dans la nature. Parmi ces derniers, l’un des besoins mondiaux non satisfaits est le développement d’outils efficaces pour lutter contre les infections par les virus à ARN transmis par les moustiques. De nombreux virus à ARN, tels que la dengue, le Zika et le chikungunya, sont transmis par les moustiques, ce qui affecte la santé humaine et contribue à la mortalité. De nombreuses propositions visant à concevoir des populations de moustiques résistantes aux virus pour la prévention des maladies ont été faites; cependant, aucune technologie actuelle n’est capable de rendre les moustiques simultanément résistants à tous les virus à ARN importants18,19,20,21,22,23. Les systèmes Cas ciblant l’ARN peuvent fournir un point de départ pour une telle technologie en permettant une plate-forme programmable pour cibler tous les virus à ARN transmis par les moustiques.

<table><tbody><tr><td>Jus de raisin à 100 %</td><td>Welch Foods Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Levure sèche active (908g)</td><td>Red Star Yeast Company, LLC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Caméra couleur DMC4500</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMC4500</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>GAL4-GMR mouches</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>29967</td><td></td></tr><tr><td>GAL4-y mouches</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>44373</td><td></td></tr><tr><td>Glomax 20/20 Luminomètre</td><td>Promega</td><td>E5331</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq2500 Séquenceur</td><td>Illumina, Inc.</td><td>HiSeq2500</td><td></td></tr><tr><td>M165FC Stéréomicroscope fluorescent</td><td>Leica Microsystems</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop OneC Spectrophotomètre UV-vis</td><td>ThermoFisher</td><td>NDONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Kit de préparation de bibliothèque d’ARN</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>Plasmide E7770</td><td></td></tr><tr><td># 112686</td><td>Addgene</td><td>112686</td><td></td></tr><tr><td>plasmide # 112688</td><td>Addgene</td><td>112688</td><td></td></tr><tr><td>plasmide # 132416</td><td>Addgene</td><td>132416</td><td></td></tr><tr><td>plasmide # 132417</td><td>Addgene</td><td>132417</td><td></td></tr><tr><td>plasmide # 132419</td><td>Addgene</td><td>132419</td><td></td></tr><tr><td>plasmide # 132420</td><td>Addgene</td><td>132420</td><td></td></tr><tr><td>plasmide # 132421</td><td>Addgene</td><td>132421</td><td></td></tr><tr><td>plasmide # 132422</td><td>Addgene</td><td>132422</td><td></td></tr><tr><td>plasmide # 132425</td><td>Addgene</td><td>132425</td><td></td></tr><tr><td>plasmide # 132426</td><td>Addgene</td><td>132426</td><td></td></tr><tr><td>plasmide # 133304</td><td>Addgene</td><td>133304</td><td></td></tr><tr><td>plasmide # 164586</td><td>Addgene</td><td>164586</td><td></td></tr><tr><td>plasmide #132418</td><td>Addgene</td><td>132418</td><td></td></tr><tr><td>plasmide pJFRC81</td><td>Addgene</td><td>36432</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Restriction endonucléases AscI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0558L</td><td></td></tr><tr><td>Restriction endonucléases NotI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>Restriction endonucléases PacI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0547L</td><td></td></tr><tr><td>Restriction endonucléases PstI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0140L</td><td></td></tr><tr><td>Restriction endonucléases SwaI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0604L</td><td></td></tr><tr><td>Restriction endonucléases XbaI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0145L</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico Kit pour bioanalyseur</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-Fluc mouches</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84125</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-GFP ; OpIE2-GFP mouches</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84986</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-N mouches</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84122</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-w mouches</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84124</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-y mouches</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84123</td><td></td></tr><tr><td>UASt-CasRx mouches</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84121</td><td></td></tr><tr><td>UASt-dCasRx mouches</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84120</td><td></td></tr><tr><td>Ubiq-CasRx mouches</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84118</td><td></td></tr><tr><td>Ubiq-dCasRx mouches</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84119</td><td></td></tr><tr><td>Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla mouches</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84127</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean Gel Kits de récupération d’ADN</td><td>Zymo Research Corporation</td><td>D4007</td><td></td></tr></tbody></table>

ciblage de l’arn omniprésent et spécifique aux tissus chez drosophila melanogaster à l’aide de crispr/casrx

Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx

CasRx, un membre de la famille Cas13 ciblant l’ARN, est un nouvel ajout prometteur des technologies CRISPR / Cas dans la réduction efficace des transcriptions géniques avec un profil hors cible attrayant aux niveaux cellulaire et organisationnel. Il a récemment été rapporté que le système CRISPR/CasRx peut être utilisé pour obtenir une réduction ubiquitaire et spécifique du transcript génique tissulaire chez Drosophila melanogaster. Cet article détaille les méthodes issues des travaux récents, composés de trois parties: 1) ciblage in vivo omniprésent de l’ARN endogène à l’aide d’un système CasRx à deux composants; 2) ciblage in vivo de l’ARN exogène omniprésent à l’aide d’un système CasRx à trois composants; et 3) le ciblage in vivo de l’ARN in vivo spécifique aux tissus à l’aide d’un système CasRx à trois composants. Les effets du ciblage de l’ARN observés comprennent des changements phénotypiques spécifiques aux gènes ciblés, une réduction ciblée des transcriptions de l’ARN et des phénotypes de létalité occasionnels associés à une expression élevée de la protéine CasRx et à une activité collatérale. Dans l’ensemble, ces résultats ont montré que le système CasRx est capable de cibler la réduction des transcriptions d’ARN au niveau de l’organisme de manière programmable et efficace, démontrant que le ciblage in vivo du transcriptome et l’ingénierie sont réalisables et jettent les bases de futures technologies de ciblage de l’ARN in vivo basées sur CRISPR.

Cet article décrit un protocole détaillé pour l’utilisation de l’enzyme Cas13D ciblant l’ARN (RfxCas13D) chez les mouches.

Ciblage de l’ARN omniprésent et spécifique aux tissus chez Drosophila Melanogaster à l’aide de CRISPR/CasRx

CasRx, a member of the RNA-targeting Cas13 family, is a promising new addition of the CRISPR/Cas technologies in efficient gene transcript reduction with ...

Comme le montre notre protocole, les technologies CRISPR CasRx peuvent être utilisées pour obtenir des réductions de transcriptions génétiques omniprésentes et spécifiques aux tissus chez les mouches des fruits. Notre technique offre un package de démarrage pour tous ceux qui sont intéressés par l’utilisation de la réduction de transcription génétique basée sur CRISPR chez les mouches des fruits tout en étant compatible avec une personnalisation et une optimisation supplémentaires. Pour mettre en place un ciblage in vivo de l’ARN in vivo omniprésent à l’aide d’un système CasRx à deux composants, collectez 10 mouches femelles adultes vierges de la ligne d’intérêt homozygote de l’ARNg gARN homozygote et cinq mouches mâles adultes de l’hétérozygote équilibré Ubiq CasRx CurlyO.Placez les mouches parentales dans un flacon complété par 100 microgrammes de levure sèche en poudre et élevez les flacons pendant 48 heures à 26 degrés Celsius. Observez les flacons tous les jours pour voir si de nouvelles progénitures adultes ont émergé du pubis de la génération F1 et anesthésiez l’un des adultes avec du dioxyde de carbone pendant 10 secondes. Une fois que les mouches deviennent immobiles, videz le flacon sur un coussinet de mouche connecté au réservoir de dioxyde de carbone avec du dioxyde de carbone continu et utilisez une caméra couleur connectée à un stéréomicroscope fluorescent pour marquer et imager les phénotypes des mouches.Ensuite, comptez le nombre de descendants avec différents phénotypes, en fonction de l’expression du signal fluorescent. Sur la base de la génétique mendélienne, 50% de la progéniture devrait exprimer l’ARN ciblé. Notez que la toxicité du système Ubiq CasRx peut réduire le rapport de la descendance exprimant l’ARN ciblé à moins de 50% Pour mettre en place un ciblage exogène in vivo omniprésent à l’aide d’un système CasRx à trois composants, collecter huit à 10 mouches femelles adultes vierges d’une ligne exprimant la double luciférase et quatre à cinq mouches mâles adultes de l’hétérozygote équilibré Ubiq CasRx Curly plus TM6, Ligne STB qui présente simultanément des yeux blancs, des ailes bouclées et une fluorescence rouge ds.Placez la première étape parentale dans un flacon complété par 100 microgrammes de levure sèche et élevez cette croix pendant 48 heures à 26 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, retirez toutes les mouches parentales de chaque flacon et retournez les flacons dans l’incubateur à 26 degrés Celsius pendant au moins 14 jours. Au cours de 14 jours, comme mentionné précédemment, collectez huit à 10 vierges femelles de la luciférase homozygote luciférase ciblant la lignée d’ARNg trois fois.Observez les flacons croisés de la première étape tous les jours pour voir si de nouvelles progénitures adultes ont émergé des nymphes, anesthésiant avec du dioxyde de carbone pour permettre la collecte de quatre à cinq mouches mâles exprimant à la fois l’Ubiq CasRx et le double reporter luciférase selon la disponibilité. Placez les mouches dans un nouveau flacon avec 10 femelles vierges de la luciférase de la mouche des fruits ciblant la ligne d’ARNg, et placez ces croisements de l’étape deux à 26 degrés Celsius pendant 48 heures. Recueillez cinq autres mâles d’un jour exprimant à la fois l’Ubiq CasRx et le double rapporteur de luciférase à partir des flacons croisés de la première étape et incubez les mouches pendant deux à quatre jours seules à 26 degrés Celsius avant de les transférer dans une centrifugeuse de 1,5 millilitre pour un stockage de moins 80 degrés Celsius.À la fin de l’incubation, retirez tous les flacons parentaux de chacun des flacons croisés de l’étape deux. Et retournez les flacons dans l’incubateur à 26 degrés Celsius pendant au moins 20 jours. Observez les flacons croisés de l’étape deux tous les jours pour voir si de nouvelles progénitures adultes ont émergé du pubis, anesthésiant les mouches avec du dioxyde de carbone à mesure qu’elles deviennent disponibles, et notant et imaginant leurs phénotypes comme démontré.La génétique mendélienne suggère que, si toutes les mouches sont viables, 25% de la progéniture devrait exprimer l’ARN ciblé. Pour effectuer un test de luciférase, générez les triples mouches trans hétérozygotes ainsi que les mouches témoins comme démontré. Recueillir les mouches mâles à la naissance et les faire vieillir jusqu’à l’âge de trois jours.Transférez les mouches de trois jours dans des tubes centrifuges de 1,5 millilitre et lysez-les à l’aide d’un tampon dans le tampon de lyse de la luciférase d’un kit de dosage de la luciférase disponible dans le commerce. Ensuite, utilisez cinq microlitres de tissu lysé de chaque échantillon et luminomètre pour mesurer à la fois les mouches des fruits et l’activité de la luciférase, conformément aux protocoles de test de luciférase standard. F1, Trans heterozygous CasRx, ont des taux de survie significativement plus faibles que les mouches trans hétérozygotes dCasRx.Confirmant la toxicité du système Ubiq CasRx des trois gènes cibles, les mouches hétérozygotes U6 gRNA Y ne sont pas viables et ne se développent pas au-delà du deuxième stade larvaire. Les mouches hétérozygotes Ubq CasRx et U6 gRNA W survivantes, démontrent un phénotype distinct aux yeux écarquillés. En outre, une réduction significative des transcriptions des gènes cibles pour trois gènes cibles est également observée.Des preuves d’activité hors cible induite par CasRx sont également observées lorsque des transcriptions exprimées différentielles entre des échantillons de mouches exprimant CasRx et des échantillons de mouches exprimant dCasRx sont comparées. Dans le croisement en deux étapes, seule la combinaison des trois gènes trans donne une létalité de 100%. Lorsque le ciblage de l’ARN spécifique des tissus à l’aide d’une conception de système CasRx à trois composants est utilisé, le niveau de toxicité est réduit lorsque l’expression globale de CasRx est réduite à l’aide du promoteur UAST par rapport à celle du promoteur Ubiq.Il est important de mettre en place correctement le processus génétique en utilisant des mouches de sexe correct et des phénotypes corrects.

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