Ciblage de l’ARN omniprésent et spécifique aux tissus chez Drosophila Melanogaster à l’aide de CRISPR/CasRx

Cet article décrit un protocole détaillé pour l’utilisation de l’enzyme Cas13D ciblant l’ARN (RfxCas13D) chez les mouches.

Comme le montre notre protocole, les technologies CRISPR CasRx peuvent être utilisées pour obtenir des réductions de transcriptions génétiques omniprésentes et spécifiques aux tissus chez les mouches des fruits. Notre technique offre un package de démarrage pour tous ceux qui sont intéressés par l’utilisation de la réduction de transcription génétique basée sur CRISPR chez les mouches des fruits tout en étant compatible avec une personnalisation et une optimisation supplémentaires. Pour mettre en place un ciblage in vivo de l’ARN in vivo omniprésent à l’aide d’un système CasRx à deux composants, collectez 10 mouches femelles adultes vierges de la ligne d’intérêt homozygote de l’ARNg gARN homozygote et cinq mouches mâles adultes de l’hétérozygote équilibré Ubiq CasRx CurlyO.

Placez les mouches parentales dans un flacon complété par 100 microgrammes de levure sèche en poudre et élevez les flacons pendant 48 heures à 26 degrés Celsius. Observez les flacons tous les jours pour voir si de nouvelles progénitures adultes ont émergé du pubis de la génération F1 et anesthésiez l’un des adultes avec du dioxyde de carbone pendant 10 secondes. Une fois que les mouches deviennent immobiles, videz le flacon sur un coussinet de mouche connecté au réservoir de dioxyde de carbone avec du dioxyde de carbone continu et utilisez une caméra couleur connectée à un stéréomicroscope fluorescent pour marquer et imager les phénotypes des mouches.

Ensuite, comptez le nombre de descendants avec différents phénotypes, en fonction de l’expression du signal fluorescent. Sur la base de la génétique mendélienne, 50% de la progéniture devrait exprimer l’ARN ciblé. Notez que la toxicité du système Ubiq CasRx peut réduire le rapport de la descendance exprimant l’ARN ciblé à moins de 50% Pour mettre en place un ciblage exogène in vivo omniprésent à l’aide d’un système CasRx à trois composants, collecter huit à 10 mouches femelles adultes vierges d’une ligne exprimant la double luciférase et quatre à cinq mouches mâles adultes de l’hétérozygote équilibré Ubiq CasRx Curly plus TM6, Ligne STB qui présente simultanément des yeux blancs, des ailes bouclées et une fluorescence rouge ds.

Placez la première étape parentale dans un flacon complété par 100 microgrammes de levure sèche et élevez cette croix pendant 48 heures à 26 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, retirez toutes les mouches parentales de chaque flacon et retournez les flacons dans l’incubateur à 26 degrés Celsius pendant au moins 14 jours. Au cours de 14 jours, comme mentionné précédemment, collectez huit à 10 vierges femelles de la luciférase homozygote luciférase ciblant la lignée d’ARNg trois fois.

Observez les flacons croisés de la première étape tous les jours pour voir si de nouvelles progénitures adultes ont émergé des nymphes, anesthésiant avec du dioxyde de carbone pour permettre la collecte de quatre à cinq mouches mâles exprimant à la fois l’Ubiq CasRx et le double reporter luciférase selon la disponibilité. Placez les mouches dans un nouveau flacon avec 10 femelles vierges de la luciférase de la mouche des fruits ciblant la ligne d’ARNg, et placez ces croisements de l’étape deux à 26 degrés Celsius pendant 48 heures. Recueillez cinq autres mâles d’un jour exprimant à la fois l’Ubiq CasRx et le double rapporteur de luciférase à partir des flacons croisés de la première étape et incubez les mouches pendant deux à quatre jours seules à 26 degrés Celsius avant de les transférer dans une centrifugeuse de 1,5 millilitre pour un stockage de moins 80 degrés Celsius.

À la fin de l’incubation, retirez tous les flacons parentaux de chacun des flacons croisés de l’étape deux. Et retournez les flacons dans l’incubateur à 26 degrés Celsius pendant au moins 20 jours. Observez les flacons croisés de l’étape deux tous les jours pour voir si de nouvelles progénitures adultes ont émergé du pubis, anesthésiant les mouches avec du dioxyde de carbone à mesure qu’elles deviennent disponibles, et notant et imaginant leurs phénotypes comme démontré.

La génétique mendélienne suggère que, si toutes les mouches sont viables, 25% de la progéniture devrait exprimer l’ARN ciblé. Pour effectuer un test de luciférase, générez les triples mouches trans hétérozygotes ainsi que les mouches témoins comme démontré. Recueillir les mouches mâles à la naissance et les faire vieillir jusqu’à l’âge de trois jours.

Transférez les mouches de trois jours dans des tubes centrifuges de 1,5 millilitre et lysez-les à l’aide d’un tampon dans le tampon de lyse de la luciférase d’un kit de dosage de la luciférase disponible dans le commerce. Ensuite, utilisez cinq microlitres de tissu lysé de chaque échantillon et luminomètre pour mesurer à la fois les mouches des fruits et l’activité de la luciférase, conformément aux protocoles de test de luciférase standard. F1, Trans heterozygous CasRx, ont des taux de survie significativement plus faibles que les mouches trans hétérozygotes dCasRx.

Confirmant la toxicité du système Ubiq CasRx des trois gènes cibles, les mouches hétérozygotes U6 gRNA Y ne sont pas viables et ne se développent pas au-delà du deuxième stade larvaire. Les mouches hétérozygotes Ubq CasRx et U6 gRNA W survivantes, démontrent un phénotype distinct aux yeux écarquillés. En outre, une réduction significative des transcriptions des gènes cibles pour trois gènes cibles est également observée.

Des preuves d’activité hors cible induite par CasRx sont également observées lorsque des transcriptions exprimées différentielles entre des échantillons de mouches exprimant CasRx et des échantillons de mouches exprimant dCasRx sont comparées. Dans le croisement en deux étapes, seule la combinaison des trois gènes trans donne une létalité de 100%. Lorsque le ciblage de l’ARN spécifique des tissus à l’aide d’une conception de système CasRx à trois composants est utilisé, le niveau de toxicité est réduit lorsque l’expression globale de CasRx est réduite à l’aide du promoteur UAST par rapport à celle du promoteur Ubiq.

Il est important de mettre en place correctement le processus génétique en utilisant des mouches de sexe correct et des phénotypes corrects.