Name: Visualisation des effets des dommages oxydatifs sur les chambres d and apos;oeufs Drosophila à l and apos;aide de l and apos;imagerie en direct (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Découvrez l'imagerie en direct des ovaires de Drosophila melanogaster pour visualiser les effets des dommages oxydatifs sur les mitochondries et les particules Clu. Ce protocole permet d'induire un stress oxydatif contrôlé.

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Nous tenons à remercier le Dr Jeremy Smyth pour son soutien à l'imagerie et Ann C. Shenk pour ses illustrations, sa production et sa vidéographie. Ces travaux ont été soutenus par les National Institutes of Health (1R01GM127938 à R.T.C.).

1. Préparation de la dissection et des supports d'imagerie
REMARQUE : Les supports les mieux adaptés à cette expérience d'imagerie en direct contiennent les supports Drosophila de Schneider contenant 15 % de sérum bovin fœtal inactivé par chaleur, 0,6 x Pen-Strep et 200 μg/mL d'insuline bovine, appelée ci-après les médias de Complete Schneider.
<ol><li>Effectuer la préparation des médias dans des conditions stériles pour s'assurer qu'il ne soit pas contaminé. Les médias ont été développés pour soutenir Drosophila ovarioles pendant de longues périodes de temps9.</li>
	<li>Ajouter 15 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur, 0,6 x Pen-Strep et 200 μg/mL d'insuline bovine aux médias du Schneider.</li>
	<li>Bien mélanger le contenu et le conserver à 4 °C toute la nuit. REMARQUE : L'insuline ne se dissout pas complètement dans les médias de Complete Schneider, et vous remarquerez qu'un précipité s'installe au fond du tube.</li>
	<li>Faites des aliquots des médias, en étant sûr de quitter le précipité car il interférera avec l'imagerie. REMARQUE : Cette solution peut être utilisée dans un délai d'un mois si elle est stockée dans des aliquots à 4 °C.</li>
</ol>2. Collection de Drosophile pour la dissection
REMARQUE : Des procédures détaillées de collecte et de dissection de Drosophila peuvent également être trouvées dans Weil et coll.10 et Parker et coll.11.
<ol><li>Pour une imagerie optimale des cellules germinales féminines, préparez d'abord un flacon contenant des aliments standard pour la mouche de la semoule de maïs et une touche de pâte de levure humide qui est la consistance du beurre d'arachide. Cela garantit que les mouches femelles sont bien nourries et produiront tous les stades de développement des follicules pour l'imagerie.</li>
	<li>Pour les mouches en parfaite santé, recueillir les femelles de 0-1 jour et transférer avec les mâles dans un flacon de nourriture mouche contenant de la pâte de levure humide. REMARQUE : Assurez-vous que les mouches endormies ne contactent pas la pâte de levure car elles peuvent s'y tenir.</li>
	<li>Nourrir les mouches 3-7 jours, en changeant le flacon et la pâte de levure tous les jours. REMARQUE : Assurez-vous que la pâte de levure entre en contact avec les aliments à la mouche afin qu'ils ne se dessèchent pas.</li>
</ol>3. Dissection de l'ovaire Drosophila
REMARQUE : Il est important de préparer les solutions multimédias fraîches parce que le peroxyde d'hydrogène est sensible à l'oxydation et que tmre se dégrade avec le temps.
<ol><li>Juste avant la dissection, dans les médias de Complete Schneider, préparez un aliquot frais de 2 μM H2O2 solution, un aliquot frais de 46 nM tétramethylrhodamine, ester éthylique (TMRE), et un aliquot frais d'une solution TMRE de 46 nM contenant 2 μM H2O2.
</li>
	<li>Pour la dissection des ovaires, utilisez deux paires de forceps fins et une paire d'aiguilles de tungstène électrolytiquement aiguisées12. Pour disséquer les ovaires, remplissez 2-3 puits d'un plat de dissecting de fond de verre (verre de montre) avec le Schneider complet qui a été réchauffé à la température ambiante.</li>
	<li>Anesthésier le flacon de mouches engraissées avec du dioxyde de carbone et séparer le nombre désiré de mouches femelles à disséquer. Placez une seule mouche dans les médias à l'aide de forceps.</li>
	<li>Sous un microscope disséquant, saisissez doucement la mouche par le thorax à l'aide d'une paire de forceps fins. Avec l'autre paire de forceps, saisir le postérieur, et tirer doucement pour enlever les ovaires. REMARQUE: si les ovaires ne sortent pas en douceur en utilisant cette méthode, l'abdomen entier peut également être retiré de la mouche, et les ovaires peuvent être doucement pressés de chaque extrémité de l'abdomen à l'aide de forceps.</li>
	<li>Enlevez toute cuticule ou tissu extraneous, puis transférez les ovaires à un nouveau puits contenant des médias frais. Les ovaires devraient encore se déplacer de la gaine musculaire environnante.</li>
</ol>4. Préparation des ovarioles à l'imagerie
<ol><li>À l'aide d'aiguilles de tungstène aiguisées, taquiner délicatement les ovarioles, en prenant soin d'enlever la gaine musculaire environnante (figure 1).</li>
	<li>Taquinez doucement toute gaine musculaire et fibres nerveuses attachées aux ovarioles isolés (Figure 2). REMARQUE : Si la gaine musculaire n'est pas enlevée, l'ovariole se contracte et se déplace, causant des problèmes d'acquisition d'image (Vidéo 1).</li>
	<li>Si les structures subcellulaires d'intérêt sont étiquetées de façon endogène, passez à l'étape 4.4. Si les structures d'intérêt sont étiquetées avec un colorant fluorescent, passez à l'article 5.</li>
	<li>Une fois que les ovarioles ont été disséqués proprement, à l'aide d'une micropipette, transférez-les dans une goutte de 100 μL du média d'imagerie complete Schneider dans la dépression de verre d'un plat de fond en verre. Les ovarioles individuels descendront au fond de la gouttelette.</li>
	<li>Passez à la section 6 pour l'imagerie. REMARQUE : Pour l'imagerie des mitochondries et des particules de bonheur Clu, pas plus de cinq à dix minutes devraient s'écouler du début de la dissection à l'imagerie.</li>
</ol>5. Coloration des mitochondries avec TMRE
REMARQUE : D'autres procédures détaillées sur la coloration vivante des mitochondries avec des colorants fluorescents peuvent être trouvées dans Parker et coll. 2017.
<ol><li>Après l'étape 4.3, transférez les ovarioles isolés dans une baisse de 100 μL de 46 nM TMRE médias dans la dépression de verre d'un plat de fond en verre. Les ovarioles individuels descendront au fond de la gouttelette.</li>
	<li>Incuber à température ambiante pendant 20 minutes. Placez le couvercle sur le plat à fond de verre et placez le plat dans une boîte couverte pendant toute la durée de l'expérience pour vous protéger de la lumière. REMARQUE : Après l'incubation, les échantillons peuvent être photographiés directement sans lavage.</li>
	<li>Répétez les étapes 5.1-5.2 pour préparer au moins deux plats d'ovarioles étiquetés TMRE, l'un pour servir de groupe expérimental et l'autre pour servir de contrôle.</li>
</ol>6. Acquisition d'images en direct
<ol><li>Une fois que les ovarioles sont montés, placez l'une des plats de fond en verre sur le microscope et configurez les paramètres d'imagerie au besoin. Les longueurs d'onde optimales excitation/émission pour le TMRE utilisé ici sont 549 nm/574 nm.</li>
	<li>Après avoir localé le champ de vision désiré, acquérir des images fixes ou de brèves vidéos d'un ou plusieurs ovarioles comme souhaité comme un enregistrement des conditions de pré-traitement.</li>
</ol>7. Ajout de peroxyde d'hydrogène pendant l'imagerie
<ol><li>Mettez en pause l'imagerie en direct, retirez le couvercle du plat inférieur en verre et ajoutez soigneusement 100 μL de solution H 2 O2 μMau plat à l'aide d'une micropipette si l'imagerie est étiquetée de façon endogène. Si l'imagerie mitochondrie, ajouter soigneusement 100 μL de 46 nM TMRE avec 2 μM H2O2 solution au plat à l'aide d'une micropipette (Vidéo 2).<ol>
<li>Évitez de casser la surface de la gouttelette multimédia existante ou d'ajouter la solution trop rapidement afin de ne pas déplacer les ovarioles reposant sur le fond du plat (Vidéo 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remplacer le couvercle du plat (couvercle de plat), déplacer et recentrer le champ de vision désiré si nécessaire, et reprendre l'imagerie (Vidéo 3, Vidéo 4, Figure 3, Figure 4).<ol>
<li>Prenez soin de reprendre l'imagerie le plus rapidement possible aprèsl'ajout deH 2 O2 car le traitement expérimental est sensible au temps (Vidéo 5).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Obtenez des images fixes ou de brèves vidéos d'un ou plusieurs ovarioles comme vous le souhaitez. Cela servira d'enregistrement des conditions post-traitement.</li>
	<li>Pour le contrôle, placez le deuxième plat de fond en verre sur le microscope et répétez la section 6.</li>
	<li>Répétez l'étape 7.1, cette fois en ajoutant 100 μL de médias TMRE uniquement au plat. Si l'imagerie est étiquetée de façon endogène, ajoutez 100 μL de la solution multimédia de Complete Schneider.</li>
	<li>Répétez les étapes 7.2 et 7.3 pour acquérir des données pour le groupe témoin. REMARQUE : Pour les mitochondries d'imagerie et les particules de bonheur Clu, pas plus de trois-cinq minutes devraient s'écouler de l'ajout de peroxyde d'hydrogène à l'imagerie.</li>
</ol>

<ol><li>Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+iron+and+hydrogen+peroxide%3A+the+Fenton+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Toxicity of iron and hydrogen peroxide: the Fenton reaction.</a> Toxicology Letters. 82-83, 969-974 (1995).</li>
<li>Cox, R. T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Balbiani+body+and+the+fusome+mediate+mitochondrial+inheritance+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis.</a> Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).</li>
<li>Cox, R. T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clueless%2C+a+conserved+Drosophila+gene+required+for+mitochondrial+subcellular+localization%2C+interacts+genetically+with+parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Clueless, a conserved Drosophila gene required for mitochondrial subcellular localization, interacts genetically with parkin.</a> Disease Models & Mechanisms. 2 (9-10), 490-499 (2009).</li>
<li>Sen, A., Kalvakuri, S., Bodmer, R., Cox, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clueless%2C+a+protein+required+for+mitochondrial+function%2C+interacts+with+the+PINK1-Parkin+complex+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Clueless, a protein required for mitochondrial function, interacts with the PINK1-Parkin complex in Drosophila.</a> Disease Models & Mechanisms. 8 (6), 577-589 (2015).</li>
<li>Sheard, K. M., Thibault-Sennett, S. A., Sen, A., Shewmaker, F., Cox, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clueless+forms+dynamic%2C+insulin-responsive+bliss+particles+sensitive+to+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Clueless forms dynamic, insulin-responsive bliss particles sensitive to stress.</a> Developmental Biology. 459 (2), 149-160 (2020).</li>
<li>Sen, A., Cox, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clueless+is+a+conserved+ribonucleoprotein+that+binds+the+ribosome+at+the+mitochondrial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Clueless is a conserved ribonucleoprotein that binds the ribosome at the mitochondrial outer membrane.</a> Biology Open. 5 (2), 195-203 (2016).</li>
<li>Parton, R. M., Valles, A. M., Dobbie, I. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Drosophila+egg+chambers+for+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of Drosophila egg chambers for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (4), 5402(2010).</li>
<li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li>
<li>Prasad, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3679(2012).</li>
<li>Parker, D. J., Moran, A., Mitra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+Mitochondrial+Structure+and+Function+in+Drosophila+Ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54989(2017).</li>
<li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+making+fine%2C+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">A simple technique for making fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li>
<li>Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mononuclear+muscle+cells+in+Drosophila+ovaries+revealed+by+GFP+protein+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps.</a> Developmental Biology. 314 (2), 329-340 (2008).</li>
<li>Wang, S., Hazelrigg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+for+bcd+mRNA+localization+from+spatial+distribution+of+exu+protein+in+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Implications for bcd mRNA localization from spatial distribution of exu protein in Drosophila oogenesis.</a> Nature. 369 (6479), 400-403 (1994).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Ce protocole pourrait être un ajout utile comme un contrôle pour les artefacts en raison de la dissection des ovaires et l'incubation des tissus pour toute expérience d'imagerie en direct. Les étapes critiques sont similaires à celles trouvées pour d'autres protocoles d'imagerie en direct. Apprendre à disséquer des ovaires entiers de Drosophila prend la pratique; cependant, cette compétence peut généralement être apprise assez rapidement avec les outils de dissection appropriés. Plus difficile à maîtriser est d'enlever le muscle enveloppant les ovaires et chaque ovariole13. Cela doit être fait pour s'assurer que les contractions musculaires n'interfèrent pas avec l'acquisition d'images. Si l'utilisation d'aiguilles de tungstène aiguisées pour ce faire ne s'avère pas réussie, le germarium à la pointe de l'ovariole peut être saisi avec des forceps et l'ovariole tiré de la gaine musculaire. Toutefois, cette technique est problématique si l'on veut examiner les premiers stades de développement parce qu'ils peuvent être endommagés. Une autre étape clé est de ne pas déloger les ovarioles reposant sur le fond du plat lors de l'ajout de H2O2. Un autre aspect important est partagé par toutes les images en direct : le chercheur doit s'assurer que la structure d'intérêt est bien étiquetée avant le traitement. Les plats utilisés ici (Tableau des matériaux) sont couramment utilisés pour l'imagerie en direct; cependant, n'importe quel plat ou glissière avec un coverslip en verre sur le fond ou même un grand coverslip en verre devrait fonctionner aussi longtemps que la baisse des médias peut être couverte pour empêcher l'évaporation des médias. Alors que nous utilisons un microscope particulier, tout microscope inversé avec un objectif de grossissement suffisant pour voir la structure subcellulaire en question et une caméra attachée qui a une résolution suffisante et le taux de capture d'image devrait fonctionner.
Tandis que notre laboratoire s'intéresse principalement à la fonction mitochondrique, cette méthode pourrait être utile examinant la dynamique et la localisation de n'importe quelle structure subcellulaire ou organelle, telle que le noyau, le cytosquelette ou le réticulum endoplasmique. Toutefois, cette méthode a des limites. Afin d'ajouter du peroxyde d'hydrogène, le tissu doit être dans un média aqueux. Une autre méthode pour l'imagerie vivante est d'utiliser l'huile d'halocarbone, qui a joué un rôle déterminant dans la description de nombreux processus importants dans les ovarioles Drosophila, y compris le premier exemple de mouvement dynamique de GFP dans un organismemodèle 7,14. En outre, l'ajout de peroxyde d'hydrogène au média provoque des dommages oxydatifs à grande échelle qui peuvent être une insulte trop générale au tissu pour être instructif pour le processus cellulaire d'intérêt, en particulier pour les expériences plus longues examinant le développement. Bien qu'il puisse ne pas être possible d'effectuer des expériences qui nécessitent la visualisation de la cellule sur de longues périodes de temps en raison de ces dommages oxydatifs rapides, étendus et probablement irréversibles, nous avons vu que le traitement aigu au peroxyde d'hydrogène que nous avons décrit est applicable à la plupart des stades de l'oogenèse que nous sommes en mesure de voir les mêmes effets dans la plupart des étapes dans la période de temps d'imagerie. Compte tenu du faible coût et de la facilité du protocole, il peut être un contrôle utile pour les dommages et peut être utilisé comme un traitement avant la fixation et l'étiquetage des anticorps ainsi.
Dans nos mains, le traitement H2O2 imite les changements dans la mauvaise localisation mitochondriale et la dispersion des particules Clu bliss que nous voyons chez divers mutants drosophiles. Il imite également les résultats que nous voyons pour les nouveaux chercheurs dans les techniques de dissection d'apprentissage en laboratoire. Par conséquent, cette méthode a clairement indiqué que la préparation d'échantillon et le stress cellulaire général peuvent mener aux changements inattendus et précédemment inexpliqués à la mauvaise localisation mitochondrique et à la présence des particules de bonheur. En avançons dans cette technique, les concentrations de peroxyde d'hydrogène pourraient être modulées à l'aide d'une concentration plus ou moins élevée. Si un effet cellulaire est observé à l'aide d'une concentration plus faible, il est possible que le phénotype de stress puisse être réversible en remplaçant le média par celui de Complete Schneider. Différents facteurs de stress cellulaire tels que le carbonyl cyanure m-chlorophényle hydrazone (CCCP), arsenite ou simple choc thermique pourraient s'avérer utiles pour le stress cellulaire général pour d'autres structures subcellulaires. Puisque l'imagerie vivante des tissus ex vivo exige la manipulation manuelle et l'incubation dans différents médias, ce contrôle devrait être un ajout utile pour s'assurer que toutes les observations sont aussi proches de la physiologie normale que possible.

Plusieurs facteurs de stress cellulaires différents peuvent survenir au cours de la culture expérimentale et de la manipulation des tissus ex vivo, y compris le choc thermique, le stress oxydatif, le stress osmotique, le stress nutritionnel et les conditions de toxicité. L'imagerie en direct est un outil puissant utilisé pour visualiser les changements en temps réel dans les tissus ex vivo après un traitement expérimental et une manipulation. Les dissections et la manipulation des tissus fins prennent de la pratique, et le temps entre la dissection et l'imagerie peut varier selon l'expérience. La raison d'être du développement de cette méthode est basée sur la préoccupation que la préparation des tissus à l'imagerie vivante peut causer un stress cellulaire pendant la dissection et la préparation à l'imagerie. Cela pourrait être particulièrement problématique pour les processus sensibles aux changements du métabolisme cellulaire et les niveaux d'oxygène disponibles, tels que la fonction mitochondrique. Bien qu'avoir un échantillon parallèle de type sauvage soit un contrôle important, il est toujours possible que certains ou tous les changements observés dans les structures subcellulaires puissent être dus à des dommages ou à un stress cellulaire dû à la dissection et ne reflètent pas la physiologie normale ou le traitement ou la mutation à l'étude.
Pour résoudre ce problème potentiel, nous utilisons l'ajout de peroxyde d'hydrogène pendant l'imagerie en direct afin d'induire des dommages oxydatifscellulaires 1. Le but de cette méthode est d'induire des dommages aux tissus afin de surveiller l'effet sur les structures subcellulaires. Ce protocole est utile à deux fins : 1) déterminer si les changements dans la localisation subcellulaire de la structure d'intérêt sont dus au stress causé par la dissection inexpérimentée et 2) une fois que le chercheur est confiant avec les techniques de dissection décrites pour surveiller l'effet du stress contrôlé sur la structure d'intérêt. Ici, nous montrons deux exemples de la façon dont l'augmentation des dommages oxydatifs provoque des changements dans deux structures subcellulaires, mitochondries et particules de bonheur Clu. Pour ce faire, nous utilisons l'ovaire Drosophila qui est un modèle commun pour les études d'imagerie en direct. Le premier exemple examine la localisation mitochondrique. D'après notre expérience, la localisation mitochondrique normale dans les cellules germinales femelles est très sensible aux perturbations et peut agir comme un signe avant-coureur du stress cellulaire. Les mitochondries dans les cellules germinales femelles de Drosophila sont normalement dispersées uniformément dans tout le cytoplasme2. L'ajout de peroxyde d'hydrogène amène les organites à se délocaliser rapidement et à se regrouper de la même manière que diverses mutations3,4,5. Le deuxième exemple sont les particules de bonheur formées par Clueless (Clu). Clu est une ribonucléoprotéine qui est diffuse dans tout le cytoplasme; cependant, il forme également des particules mitochondries-associées dans des conditions cellulaires optimales5. Puisque la présence des particules de Clu dépend des conditions cellulaires saines, nous les avons appelées particules de « bonheur» 3,5,6. L'ajout de peroxyde d'hydrogène provoque la dispersion rapide de ces particules et leur homogénéité dans lecytoplasme 5. Au cours de nos études, nous avons observé des changements dans la localisation de ces deux structures subcellulaires, mais ce n'est qu'après avoir effectué des études d'imagerie en direct que nous avons pu apprécier pleinement l'effet du stress cellulaire et des dommages oxydatifs sur la localisation et la dynamique des mitochondries et des particules de bonheur.
L'utilité de ce protocole en tant qu'ajout à des méthodes déjà établies ou alternatives dépend de plusieurs facteurs. Tout d'abord, le protocole d'imagerie doit être utile à l'ajout de médicaments. Si l'échantillon est monté sous un coverslip et dans l'huile d'halocarbone, cette méthode ne serait pas possible7. H2O2 addition provoque une augmentation rapide des dommages oxydatifs, par conséquent, cette échelle de temps peut ne pas être approprié. Les dommages oxydatifs peuvent être considérés comme un proxy pour l'hypoxie ; cependant, il peut être trop dur ou trop généralisé pour fonctionner comme un contrôle approprié pour les dommages pour certains composants subcellulaires. Enfin, pour les expériences d'imagerie qui durent des heures comme celles qui suivent un processus de développement, h2O2 addition peut être trop forte (par exemple8). L'essai d'une courbe de concentration peut surmonter cette limitation.

<table><tbody><tr><td>Levure sèche active</td><td>Red Star&reg ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gaz CO2 pureté</td><td></td><td></td><td>99,9 %</td></tr><tr><td>Tampon CO2 Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de dissection, modèle</td><td></td><td></td><td></td>Nikon SMZ645</tr><tr><td>Aiguilles de dissection - Aiguilles PrecisionGlide</td><td>BD</td><td>305165</td><td>B-D 21G1 taille</td></tr><tr><td>Aiguilles de dissection - Seringues PrecisionGlide</td><td>BD</td><td>309657</td><td>Pointe Luer-Lok, format 3 mL</td></tr><tr><td>Aiguilles de dissection - fil de tungstène</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>73800</td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont #5 (2 paires)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>NI-150 Illuminateur haute intensité</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal de bovin Gibco, inactivé par la chaleur</td><td>Fisher Scientific</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Schneider’s Drosophila Media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Solution de peroxyde d’hydrogène, 30 % (p/p) dans H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Insuline du pancréas bovin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Disque rotatif microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>Des lunettes équivalentes peuvent également être utilisées</td></tr><tr><td>Lonza BioWhittaker Antibiotiques : mélanges de pénicilline-streptomycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>MatTek Corporation Plats à fond de verre, 35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp ; </td><td></td>NC9344527</tr><tr><td>Micropipettes et pointes de taille appropriée</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtubes à centrifuger, 1,7 mL</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Tétraméthylrhodamine, ester éthylique, perchlorate (TMRE)</td><td>AnaSpec</td><td>AS-88061</td><td></td></tr><tr><td>w[1118]</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>5905</td><td>Mouches de type sauvage</td></tr><tr><td>y w ; clu[CA06604]</td><td></td><td>Disponible sur demande.</td><td>Clu ::GFP mouches pièges</td></tr></tbody></table>

visualisation des effets des dommages oxydatifs sur les chambres d&apos;oeufs drosophila à l&apos;aide de l&apos;imagerie en direct

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

L'imagerie vivante des ovaires de Drosophila melanogaster a joué un rôle déterminant dans la compréhension d'une variété de processus cellulaires de base pendant le développement, y compris le mouvement des particules ribonucléoprotéines, la localisation de l'ARNm, le mouvement des organelles et la dynamique cytosquelettique. Plusieurs méthodes d'imagerie en direct ont été mises au point. En raison du fait que chaque méthode consiste à disséquer les ovarioles individuels placés dans les médias ou l'huile d'halocarbone, des dommages cellulaires dus à l'hypoxie et/ou à la manipulation physique se produiront inévitablement au fil du temps. Un effet en aval de l'hypoxie est d'augmenter les dommages oxydatifs dans les cellules. Le but de ce protocole est d'utiliser l'imagerie en direct pour visualiser les effets des dommages oxydatifs sur la localisation et la dynamique des structures subcellulaires dans les ovaires de Drosophila après l'induction des dommages cellulaires contrôlés. Ici, nous utilisons du peroxyde d'hydrogène pour induire des dommages oxydatifs cellulaires et donner des exemples des effets de tels dommages sur deux structures subcellulaires, les mitochondries et les particules de bonheur Clu. Toutefois, cette méthode s'applique à toute structure subcellulaire. Les limites sont que le peroxyde d'hydrogène ne peut être ajouté à des médias aqueux et ne fonctionnerait pas pour l'imagerie qui utilise de l'huile d'halocarbone. Les avantages sont que le peroxyde d'hydrogène est facilement disponible et peu coûteux, agit rapidement, ses concentrations peuvent être modulées, et les dommages oxydatifs est une bonne approximation des dommages causés par l'hypoxie ainsi que les dommages généraux des tissus dus à la manipulation.

Les protocoles décrits peuvent être utilisés pour étudier les effets du peroxyde d'hydrogène lors de l'imagerie en direct des ovaires de Drosophila. Comme le montre la figure 3, la figure 4, la vidéo 3 et la vidéo 4, cette procédure fournit un moyen efficace de visualiser les changements et la dynamique des tissus après un traitement expérimental en temps réel. Fait important, ce protocole est spécifique pour l'ajout de H2O2 aux ovarioles lors de l'imagerie; cependant, il peut être adapté pour l'ajout exogène d'autres drogues ou reagents d'intérêt. De plus, les follicules peuvent être étiquetés avec des colorants fluorescents d'intérêt (p. ex., tétramethylrhodamine (TMRE), LysoTracker) avant l'imagerie (Vidéo 3). Les étapes les plus critiques pour obtenir des résultats d'imagerie clairs sont 1) la dissection et l'isolement appropriés des ovarioles simples avec tous les éléments contractiles enlevés(figure 1 et figure 2) et 2) la vitesse à laquelle l'imagerie est redémarrée après l'ajout de peroxyde d'hydrogène. La vidéo 4 est une illustration d'un follicule correctement disséqué qui reste stable tout au long de la durée de l'imagerie par rapport à la vidéo 1, qui illustre un follicule mal disséqué sortant du champ de vision pendant l'imagerie. La vidéo 5 est une illustration dans laquelle les effets H2O2 sur les mitochondries étiquetées TMRE ont déjà progressé avant le début de l'imagerie en raison de trop de temps écoulé. Par rapport à la vidéo 3 dans laquelle l'imagerie a été redémarrée immédiatement après l'ajout de peroxyde d'hydrogène (temps 0) et intacte, les mitochondries dispersées sont encore visibles, les mitochondries de la vidéo 5 ont déjà commencé à s'agglutiner visiblement et à perdre leur potentiel membranaire lors du redémarrage de l'imagerie. Ce problème est principalement attribué à la perturbation des positions de l'échantillon pendantl'ajout deH 2 O2 et peut être atténué en suivant la technique pour garder le média d'imagerie et la position de l'échantillon intacts (Vidéo 2). Il convient de noter que dans les expériences de contrôle réalisées sans H2O2 ajouté aux médias, les mitochondries dans les follicules restent correctement dispersées, et le colorant TMRE reste séquestré dans les mitochondries.
<img alt="Schéma d’anatomie de l’ovule et images au microscope ; Étude détaillée de la structure ovarienne et des gaines musculaires." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62157/62157fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1: Isolement des ovarioles simples des ovaires de Drosophila. (A) Dessin animé indiquant une paire d'ovaires, un ovariole unique (flèche) avec le germarium à la pointe (pointe de flèche) et les deux gaines musculaires qui entourent l'ovariole (brun, épithélial) et l'ovaire (brun, péritonéal). (B) Ovaire disséqué Drosophila. (C) Séparation subséquente de l'ovaire taquiné en ovarioles individuels (flèche). Barre d'échelle = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/62157fig01large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Comparaison de la morphologie des cellules de levure, image microscope, deux panneaux, analyse de l’intégrité de la paroi cellulaire." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62157/62157fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figure 2: Ablation des fibres nerveuses et des éléments contractiles des ovarioles simples. (A) Ovariole simple avec des restes de tissu nerveux et de la gaine musculaire encore attachée (flèche). (B) Enlèvement doux de tous les tissus restants attachés à l'ovariole en A (flèche). Barre d'échelle = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/62157fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Effet du peroxyde sur les tissus au fil du temps ; série d’images de microscopie à fluorescence ; Analyse de la réaction oxydative." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62157/62157fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figure 3: H2O2 provoque une mauvaise localisation mitochondriale. (A-A") Images vivantes d'un follicule cluCA06604 (Clu:::GFP flies). L'ajout de H2O2 provoque l'agglutinage des mitochondries pendant toute la durée de l'imagerie. L'étiquetage TMRE des mitochondries indique que les mitochondries sont d'abord dispersées au moment 0 (A), et que les mitochondries commencent à s'agglutiner après h2O2 addition (A′) À un moment ultérieur, l'étiquetage TMRE devient inégale en raison de mitochondries perdre leur potentiel membrannaire et donc leur capacité à séquestrer le colorant (A). Blanc = TMRE (A-A"). Barres d'échelle: 10 μm in (A) pour A-A"5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/62157fig03large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Microscopie time-lapse de cellules avec traitement H2O2 montrant un stress oxydatif sur 10 minutes." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62157/62157fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figure 4: H2O2 disperse Clu. (A-A") Images vivantes d'un follicule cluCA06604 bien nourri. L'ajout de H2O2 provoque la dispersion des particules et l'homogénéité du cytoplasme pendant toute la durée de l'imagerie. Blanc = Clu::GFP (A-A"). Barre d'échelle: 40 μm in (A) pour A-A"5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/62157fig04large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Vidéo 1: Follicule d'une femelle cluCA06604. Tel que décrit dans la figure 2,l'omission d'enlever les éléments contractiles de fibre nerveuse des ovarioles simples causera la dérive et le mouvement marqués des ovarioles pendant l'imagerie et l'incapacité suivante d'analyser des données d'imagerie. Blanc = Clu::GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/Video%201%20-%20Failure%20to%20remove%20contractile%20elements.mov" target="_blank">S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.</a>
Vidéo 2 : Ajout approprié de H2O2à l'échantillon de plat. Le peroxyde d'hydrogène doit être ajouté à la vaisselle de l'échantillon à l'aide d'une micropipette de taille appropriée. Distribution H2O2 sans casser la surface du média. On prend soin d'éviter de briser la surface du média d'imagerie afin de minimiser la dérive de l'échantillon lors de l'ajout de peroxyde d'hydrogène. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/Video%202%20-%20Proper%20Addition%20of%20H2O2%20to%20Sample%20Dish.mp4" target="_blank">S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.</a>
Vidéo 3 : Ajout de H2O2 pendant l'imagerie des follicules étiquetés TMRE. Follicule d'un cluCA06604 femelle souillée avec TMRE. H2O2 provoque une mauvaise localisation mitochondrique dans les follicules de Drosophila. Blanc = colorant TMRE. Imaged un cadre par 15 s pendant 20 min, et la vidéo est de 10 images par seconde5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/Video%203%20-%20H2O2%20stresses%20mitochondria.avi" target="_blank">S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.</a>
Vidéo 4: H2O2 addition pendant l'imagerie de Clu::GFP follicules. Follicule d'une femelle cluCA06604. H2O2 disperse les particules de Clu telles que décrites dans la figure 4. Blanc = Clu::GFP. Imaged un cadre par 15 s pendant 15 min, et la vidéo est de 10 images par seconde. 5<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/Video%204%20-%20H2O2%20disperses%20particles.avi" target="_blank">S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.</a> 
Vidéo 5 : Imagerie retardée après l'ajoutde H 2O2. Follicule d'une femelle cluCA06604. L'ajout de peroxyde d'hydrogène aux follicules est un traitement sensible au temps. Le redémarrage de l'imagerie a été retardé dans cette vidéo en raison du déplacement de l'échantillon pendantl'ajout de H 2O2. Les mitochondries ont déjà commencé à s'agglutiner visiblement et à perdre leur potentiel membrannaire lors du redémarrage de l'imagerie au moment 0 (par rapport au temps 0 dans la vidéo 3). Le fait de ne pas reprendre l'imagerie rapidement après le traitement entraînera des résultats inexacts et inutilisables, car les premiers effets expérimentaux seront manqués avant l'imagerie. Blanc = TMRE. Imaged un cadre par 15 s pendant 20 min, et la vidéo est de 10 images par seconde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/Video%205%20-%20Delayed%20imaging%20after%20H2O2%20addition.mov" target="_blank">S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.</a>

L'objectif de ce protocole est d'utiliser l'imagerie vivante pour visualiser les effets des dommages oxydatifs sur la localisation et la dynamique des structures subcellulaires dans les ovaires de Drosophila.

Visualisation des effets des dommages oxydatifs sur les chambres d&apos;oeufs Drosophila à l&apos;aide de l&apos;imagerie en direct

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...

Notre laboratoire utilise Drosophila melanogaster pour identifier et caractériser les gènes et les voies qui régulent la fonction mitochondriale pendant le développement et l’homéostasie physiologique. Le protocole présenté ici utilise l’imagerie en direct avec l’ajout de peroxyde d’hydrogène pour visualiser les effets des dommages oxydatifs sur la localisation et la dynamique des structures subcellulaires dans l’ovaire adulte Drosophila. Nous utilisons fréquemment des protocoles d’imagerie pour étudier comment les mutations modifient la localisation et le mouvement mitochondriques normaux dans les cellules germinales femelles.Au cours de nos études, nous avons constaté que le stress introduit par la dissection ou d’autres facteurs de stress cellulaire avait un impact profond sur la localisation mitochondriale. Comme un contrôle pour identifier si oui ou non le stress général, par opposition au traitement expérimental, est la cause de tout changement à la localisation ou le comportement des structures subcellulaires. Nous avons développé ce protocole pour introduire le stress de contrôle à l’aide du peroxyde d’hydrogène.Dans cette vidéo, nous démontrerons comment les dommages oxydatifs induits par le peroxyde d’hydrogène modifient la distribution des mitochondries et du clu ribonucleoprotéine. Les médias les mieux adaptés à cette technique d’imagerie en direct contenaient les supports Drosophila de Schneider contenant 15 % de sérum bovin fœtal inactivé à chaleur, 0,6 X Pen-Strep et 200 microgrammes par insuline bovine microliter, appelée ci-après les médias complets de Schneider. Effectuer la préparation des médias dans des conditions stériles permettra de s’assurer qu’il ne soit pas contaminé.Bien mélanger le contenu et le conserver toute la nuit à quatre degrés. L’insuline ne se dissout pas complètement dans les médias complets de Schneider et vous remarquerez un précipité s’installer dans le fond du tube. Faire des aliquots, en étant sûr de laisser ce précipité car il interférera avec l’imagerie.Cette solution peut être utilisée pendant un mois si elle est stockée en aliquots à quatre degrés. Pour une imagerie optimale des cellules germinales féminines, préparez d’abord un flacon contenant une touche de pâte de levure humide qui est la consistance du beurre d’arachide. Cela garantit que les femelles sont bien nourries et produira tous les stades de développement follicule pour l’imagerie.Pour des mouches en parfaite santé, recueillir de zéro à un jour les femelles et transférer avec les mâles dans un flacon de nourriture mouche contenant de la pâte de levure humide. Assurez-vous que les mouches endormies ne contactent pas la pâte de levure car elles peuvent s’y tenir. Nourrir les mouches de trois à sept jours, en changeant la pâte de levure tous les jours.Assurez-vous que la pâte de levure entre en contact avec les aliments à la mouche, de sorte qu’elle ne se dessèche pas. Pour induire des dommages oxydatifs, nous utiliserons une solution de stock de peroxyde d’hydrogène à 30% et pour visualiser les mitochondries, nous utiliserons une solution de stock de 100 millimolar TMRE. Il est important de préparer les solutions médiatiques fraîches parce que le peroxyde d’hydrogène est sensible à l’oxydation et tmre se dégrade au fil du temps.Juste avant la dissection, dans les médias complets de Schneider, préparer un aliquot frais de deux peroxyde d’hydrogène micromolaire, un aliquot frais de 46 nanomolaire TMRE, et un aliquot frais de 46 nanomolaire TMRE plus deux peroxyde d’hydrogène micromolaire. Pour la dissection des ovaires, vous aurez besoin de deux paires de forceps fins et d’une paire d’aiguilles de tungstène électrolytiquement aiguisées. Pour disséquer les ovaires remplir un verre de montre avec les médias complets de Schneider qui a été réchauffé à température ambiante, puis placer une seule mouche dans les médias à l’aide de forceps.Saisissez doucement la mouche par le thorax à l’aide d’une paire de forceps fins. Avec les autres forceps, saisir le postérieur et tirer doucement pour enlever les ovaires. Enlevez toute cuticule ou tissu extraneous, puis transférez l’ovaire à un nouveau puits contenant des médias frais.Les ovaires devraient encore se déplacer de la gaine musculaire environnante. À l’aide des aiguilles de tungstène aiguisées, taquiner doucement les ovarioles, en prenant soin d’enlever la gaine musculaire environnante. Si la gaine musculaire n’est pas enlevée, comme démontré ici, les ovaires trembleront, causant des problèmes avec l’acquisition d’image.Une fois que les ovarioles ont été disséqués proprement, transférez-les dans une goutte de 100 microlitres de médias dans un plat MatTek si vous visualisez des structures étiquetées endogènement. Transférez les ovarioles dans une goutte de 100 microlitres de médias TMRE dans un plat MatTek si vous visualisez des mitochondries étiquetées avec TMRE. Les ovarioles descendront au fond de la gouttelette.Il est important de pratiquer des dissections afin de commencer à imagerie du tissu aussi rapidement que possible. Une fois les ovarioles montés, placez le plat sur le microscope inversé et acquérez des images fixes ou de brèves vidéos comme enregistrement des conditions de prétraitement. Une fois cela fait, mettre en pause l’imagerie en direct, enlever le couvercle, et ajouter soigneusement 100 microlitres des deux micromolaires de peroxyde d’hydrogène préparé solution.Évitez de briser la surface de la gouttelette multimédia existante ou d’ajouter la solution trop rapidement, afin de ne pas déplacer les ovarioles reposant sur le fond. Remplacer le couvercle du plat, déplacer et recentrer l’ovariole désiré et reprendre l’imagerie. Prenez soin de reprendre l’imagerie le plus rapidement possible, car le traitement expérimental est sensible au temps.Montré ici sont encore des images d’un film, pris après le traitement du peroxyde d’hydrogène. Les mitochondries et les cellules germinales femelles sont dispersées dans tout le cytoplasme lorsque les mouches sont bien nourries et en bonne santé. Après l’ajout de peroxyde d’hydrogène, les dommages oxydatifs provoque des mitochondries à s’agglutiner, qui peut être vu aussi rapidement que 10 minutes après le traitement.Après 20 minutes, les dommages provoquent la dissipation du potentiel de membrane mitochondrique. Ainsi, la majorité des mitochondries s’estompent. Dans ce film en direct du processus, les mitochondries peuvent être vus rapidement s’agglutiner et la majorité des mitochondries finissent par s’estomper.Le clignotement pulsant dans le cytoplasme, particulièrement dans les cellules environnantes de follicule, semble caractéristique de l’addition de TMRE. Comme mentionné précédemment, l’imagerie doit avoir lieu rapidement après l’ajout de peroxyde d’hydrogène. Comme on le voit ici, si trop de temps s’écoule, le potentiel de la membrane mitochondriale est déjà perdu et l’étiquetage TMRE se dissipe, rendant les données impinterprétables.Dans ces images fixes vidéo, les particules de Clu étiquetées endogènes GFP sont robustes et abondantes dans le germplasme des femelles bien nourries. Après ajout de peroxyde d’hydrogène, les particules de Clu se dispersent dans les 10 minutes. Cela est démontré dans la vidéo d’accompagnement.Après l’ajout de peroxyde d’hydrogène, les particules clu bliss se dispersent rapidement. Nous avons trouvé ce protocole pour être un outil utile pour assurer l’imagerie précise de la localisation sauvage des particules de mitochondrie et de bonheur de Clu dans les cellules germinales femelles de Drosophila. Ce protocole devrait être applicable pour un large éventail d’études d’imagerie vivante et pourrait être utilisé pour traiter les tissus avant la fixation ainsi.Les étapes les plus importantes sont d’isoler les ovarioles libres de la gaine musculaire, d’ajouter doucement le peroxyde d’hydrogène, afin de ne pas déloger les ovarioles, et d’image rapidement après l’ajout de peroxyde d’hydrogène. Nous espérons que vous trouverez cela un contrôle utile pour l’imagerie en direct une variété de structures subcellulaires. Merci d’avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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