Imagerie calcique in vivo des réponses des neurones ganglionnaires géniculés de souris aux stimuli gustatifs

Cette technique peut répondre à d’importantes questions fonctionnelles sur les réponses neuronales au goût dans les ganglions géniculés, une partie cruciale de la voie gustative interne des tympans de la chorda. Cette technique peut être utilisée pour surveiller les réactions en temps réel de plusieurs neurones individuels dans un seul essai expérimental, car les cellules enregistrées par animal sont significativement plus élevées que ce qui est généralement observé via la méthode électrophysiologique. Avec la souris montée sur la tête en position couchée sur un coussin chauffant, faites une incision médiane de deux centimètres dans la peau au-dessus de la gorge, du sternum au menton.

Et rétracter la peau et les glandes sous-maxillaires pour exposer complètement les muscles digastriques. Après avoir localisé la couture dans la musculature paratrachéale, séparez la couture avec une dissection émoussée et rétractez le tissu pour l’ouvrir. Coupez soigneusement une ouverture dans le haut de la trachée assez grande pour tenir un morceau de tube en polyéthylène sans couper plus de la moitié du diamètre de la trachée et insérez le tube dans la trachée vers les poumons.

Repositionnez les rétracteurs pour libérer la musculature paratrachéale et rétracter les glandes sous-maxillaires. Ensuite, utilisez une petite quantité de colle vétérinaire pour sceller la musculature paratrachéale ensemble sur le tube. Pour briser la bulle tympanique, taquinez doucement le muscle digastrique souhaité vers le haut et séparez le tissu conjonctif.

Faites une incision à l’extrémité antérieure du muscle, en évitant les vaisseaux sanguins. Et retirez-vous postérieurement jusqu’à ce qu’il soit dégagé de la bulle tympanique. Inclinez légèrement la tête vers l’arrière pour soulever le bulla tympanique et localiser la branche de l’artère carotide antérieure au point d’insertion postérieur du muscle digastrique.

Palper juste en arrière de ce vaisseau sanguin pour la structure convexe de la bulle tympanique et localiser une couture dans la musculature. À l’aide de deux ensembles de pinces fines, disséquer émousser la couture jusqu’à ce que l’os de la bulle tympanique soit visible et utiliser des rétracteurs pour garder une vue dégagée de l’os. Localisez la couture antérieure à postérieure sur la bulle et utilisez une sonde chirurgicale pour percer un trou dans l’os au centre de la couture, puis utilisez un ensemble de ciseaux d’extrémité fine pour couper une zone circulaire dans l’os, en prenant soin de ne pas couper les vaisseaux sanguins antérieurs et postérieurs à ou en dessous de la bulle.

Pour exposer le géniculé, localisez la cochlée. Antérieur à la cochlée est le muscle tympan tenseur. Utilisez des ciseaux à ressort pour couper et enlever ce muscle.

Utilisez la sonde chirurgicale pour percer un trou dans le promontoire cochléaire et utilisez immédiatement l’aspiration pour aspirer tout liquide qui s’écoule hors du trou. Agrandir le trou dans la cochlée, en prenant soin de ne pas endommager le vaisseau sanguin entourant la cochlée, jusqu’au bord postérieur et latéral. Et inclinez la tête de la souris vers l’avant pour localiser le trou dans l’os temporal sous l’ancienne structure cochléaire.

Prenez note de la crête antérieure au trou qui se trouve directement au-dessus du septième nerf. Et insérez une sonde chirurgicale dans le trou pour permettre à l’os temporal d’être soigneusement soulevé pour exposer le septième nerf. Si le géniculé n’est pas entièrement visible, inclinez doucement la tête de l’animal vers l’arrière et essayez de remonter l’os vers le haut du nerf.

Si les ganglions sont encore obscurcis, tirez plus d’os par en dessous, en prenant soin de ne pas placer la sonde profondément sous l’os, car cela pourrait endommager le géniculé. Pour faire fonctionner le panneau de dégustation, utilisez aspiré pour retirer le liquide de sur le géniculé et placez la souris sur un tampon absorbant sous un microscope à dissection. Utilisez le trou laissé dans la bulle, le trou dans l’os temporal et le septième nerf pour localiser le ganglion géniculé.

Et utilisez le filtre FITCGFP sur la lunette épifluorescente pour vérifier les neurones ganglionnaires géniculés exprimant GCaMP individuels. Placez l’aiguille de distribution d’une ligne de dégustation fermement dans la bouche de l’animal et placez une boîte de Petri sous la bouche pour attraper tout liquide. Synchronisez le début de l’enregistrement vidéo avec le début de la présentation tastant, en regardant le flux en direct pour les réponses, la dérive et l’infiltration pendant l’enregistrement.

En cas d’infiltration, aspirez le liquide jusqu’à ce que la vue du géniculé soit claire et relivrez le tastant. En cas de dérive, vérifiez que toutes les parties du poste de tête sont fermement serrées. Si aucune réponse ne se produit, vérifiez que le liquide s’écoule et que le microscope et la caméra sont focalisés au bon endroit sans que rien n’obscurcisse le champ de vision.

Lorsque toutes les expériences souhaitées sont terminées, relâchez doucement les rétracteurs et répétez l’analyse de l’exposition et du tastant du côté opposé de l’animal. Comme observé, les stimuli gustatifs appliqués à la langue devraient entraîner une augmentation transitoire rapide de la fluorescence GCaMP, provoquant un changement notable de luminosité parmi les neurones répondants. L’analyse des séquences vidéo de fluorescence permet de génération de traces correspondant aux changements de fluorescence sur la réponse de base dans les régions d’intérêt individuelles au fil du temps.

Les changements dans l’intensité de fluorescence au-dessus du seuil sont considérés comme une réponse positive. En plus d’endommager les ganglions, il est important d’éviter les saignements. En cas de saignement, attendez que le sang coagule avant d’appliquer une solution saline et une aspiration pour éliminer le sang du champ visuel.

La visualisation des ganglions géniculés a permis aux chercheurs de mesurer directement les réponses des neurones aux stimuli gustatifs et d’identifier ces neurones avec des outils tels que GCaMP dépendant de Cre.