Name: Condensats de protéines induits par dimérisation chimique sur les télomères (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Découvrez comment induire des condensats de protéines sur les télomères par dimérisation chimique contrôlée dans le temps. Cette méthode permet l'imagerie en cellules vivantes et l'étude de la séparation de phase chromatinienne.

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Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health des États-Unis (1K22CA23763201 à H.Z., GM118510 à D.M.C.) et la fondation Charles E. Kaufman à H.Z. Les auteurs tiennent à remercier Jason Tones d’avoir relu le manuscrit.

1. Production de lignées cellulaires transitoires
<ol><li>Culture de cellules acceptrices U2OS sur des couvercles en verre de 22 x 22 mm (pour l’imagerie vivante) ou des couvercles circulaires de 12 mm de diamètre (pour IF ou FISH) recouverts de poly-D-lysine dans une plaque à 6 puits avec milieu de croissance (10% de sérum bovin fœtal et 1% de solution de pénicilline-streptomycine dans DMEM) jusqu’à ce qu’ils atteignent 60-70% de confluence.</li>
	<li>Remplacer le milieu de croissance par un milieu de transfection de 1 mL (milieu de croissance sans solution de pénicilline-streptomycine) avant la transfection.</li>
	<li>Pour chaque puits de transfection, ajouter 4 μL de réactif de transfection à 150 μL de milieux sériques réduits, vortex pendant 10 secondes, puis incuber pendant 5 minutes.</li>
	<li>Pour chaque puits, ajouter le plasmide de construction Halo (Halo-GFP-TRF1 ou Halo-TRF1) et le plasmide de construction eDHFR (mCherry-eDHFR-SIM ou mutant mCherry-eDHFR-SIM) à un rapport de masse de 1:1 (0,5 μg de plasmide de construction Halo avec 0,5 μg de plasmide de construction eDHFR) à 150 μL de milieu sérique réduit, goutte à goutte, mélange par pipetage. REMARQUE: Les étiquettes sont relativement petites (Halo 33 kD, eDHFR 28 kD, mCherry 30 kD, eGFP 27 kD) et aucun effet sur la séparation de phase n’a été observé. Cependant, il est conseillé d’utiliser des mutants tels que le mutant SIM utilisé ici pour s’assurer que le comportement de phase est sensible aux mutations et non aux balises. SIM est de PIASx28,30. La séquence SIM est AAAGTCGATGTAATTGACTTAACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. Le mutant SIM est généré par la mutation des acides aminés SIM VIDL enVADA 28, et la séquence est AAAGTCGATGTAGCCGACGCCACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. Nous avons déposé nos plasmides à addgene: #164644 3XHalo-GFP-TRF1; #164646 mCherry-eDHFR-SIM; #164649 mutant mCherry-eDHFR-SIM.</li>
	<li>Ajouter 150 μL de mélange de milieux sériques réduits en réactif de transfection à 150 μL de milieux sériques réduits avec de l’ADN, goutte à goutte, mélanger par pipetage, incuber pendant 5 minutes.</li>
	<li>Ajouter les 300 μL de mélange réactif-ADN de transfection aux cellules, goutte à goutte, puis replacer les cellules dans l’incubateur.</li>
	<li>Attendez 24 à 48 heures avant l’imagerie en direct, l’immunofluorescence (IF) ou l’hybridation in situ par fluorescence (FISH).</li>
</ol>2. Dimérisation sur télomères
<ol><li>Dissoudre les dimérisants dans du sulfure de diméthyle à 10 mM et les stocker dans des tubes de microcentrifugation en plastique à −80 °C pour un stockage à long terme. REMARQUE: Au lieu d’utiliser le dimériseur avec TMP directement lié à Halo (TMP-Halo, TH), le dimériseur TMP-NVOC-Halo (TNH) qui a un linker photosensible, 6-nitroveratryl oxycarbonyl (NVOC), entre TMP et Haloligand est utilisé31. En effet, il faut moins de temps pour que la TNH (~ 5 minutes) diffuse dans la cellule que la TH (~ 20 minutes). Les résultats présentés ici peuvent également être obtenus en utilisant TH. Lorsque vous utilisez la TNH, veillez à ne pas exposer le dimériseur à la lumière pour éviter le clivage NOVC. Manipulez le TNH dans une pièce sombre avec une lampe à faible lumière rouge, rangez le dimériseur dans des tubes en plastique ambré et enveloppez le récipient contenant du TNH ou des cellules traitées avec du papier d’aluminium. L’imagerie TNH avec DIC est sûre.</li>
	<li>Prendre une aliquote de dimériseur de 10 mM à partir de −80 °C et diluer dans un milieu imageur jusqu’à une concentration en stock de 10 μM et conserver à −20 °C.</li>
	<li>Lorsqu’ils sont prêts à l’emploi, diluez les dimériseurs à partir d’une solution mère de 10 μM jusqu’à une concentration de travail finale de 100 nM dans un milieu de croissance (pour l’imagerie fixe) ou un milieu d’imagerie. Traiter les cellules avec des dimériseurs de 100 nM (concentration finale) sur scène pour l’imagerie vivante ou incuber pendant 4 à 5 heures pour l’immunofluorescence (FI) et l’hybridation in situ par fluorescence (FISH). REMARQUE: La concentration de dimériseurs utilisés affecte l’efficacité de la dimérisation et donc la séparation de phase. La concentration de dimériseur permettant une efficacité de dimérisation maximale dépend du type de cellule et de la concentration en protéines d’ancrage, elle devra donc être déterminée pour différentes expériences. Un moyen simple consiste à incuber des cellules exprimant la protéine d’ancrage et mCherry-eDHFR (sans fusionner avec la protéine de séparation de phase ou fusionnée à un mutant de séparation sans phase) et à identifier la concentration de dimériseur à laquelle l’intensité mCherry la plus élevée à l’ancre est atteinte. Une approche plus systématique consiste à incuber les cellules exprimant l’ancre uniquement avec différentes concentrations de dimériseurs, puis avec un colorant de liaison Halo pour aider à déterminer la concentration de dimériseur à laquelle l’intensité du colorant de liaison Halo commence à plafonner (c’est-à-dire que toutes les ancres fusionnées Halo sont occupées par le dimériseur et plus pour le colorant liant Halo)32.</li>
	<li>Pour inverser la dimérisation, incuber les cellules avec des dimériseurs pendant 2 à 5 heures (avec ou sans imagerie en direct) ou jusqu’à ce que la taille de gouttelette souhaitée soit atteinte et ajouter 100 μM de TMP libre (concentration finale) dilué dans un milieu imageur aux cellules.</li>
</ol>3. Immunofluorescence (FI) 
<ol><li>Ensemencez10 5 cellules sur des verres à couverture circulaire de 12 mm de diamètre recouverts de poly-D-lysine dans une plaque à 6 puits. Transfectez ensuite les deux plasmides (Halo-GFP-TRF1 avec mCherry-eDHFR-SIM ou mCherry-eDHFR-SIM mutant) et attendez 24 à 48 heures avant de procéder à l’immunofluorescence. REMARQUE: Attendre plus d’un jour après la transfection peut obtenir une expression plus élevée.</li>
	<li>Diluer les dimérisants avec un milieu de croissance pour atteindre une concentration finale de 100 nM, ajouter des dimérisants dilués aux cellules et incuber à 37 °C pendant 4-5 heures. REMARQUE: La séparation de phase est rapidement induite après l’ajout de dimériseurs (< 30 minutes). Une incubation plus longue aide les gouttelettes à grossir en plus grandes tailles. Après la croissance des gouttelettes avec l’imagerie en direct peut être utilisé pour déterminer le temps qu’il faut pour que les gouttelettes atteignent un état souhaité.</li>
	<li>Fixer les cellules dans une solution de PBS contenant 4% de formaldéhyde et 0,1% de Triton X-100 pendant 10 minutes à température ambiante pour perméabiliser les cellules. Lavez les cellules 3 fois avec PBS. REMARQUE: Après cette étape, il peut être mis en pause et les cellules peuvent être stockées à 4 ° C pendant une semaine. Attention: Le formaldéhyde est nocif par inhalation et s’il est avalé, il irrite également les yeux, le système respiratoire et la peau et constitue un risque possible de cancer. Besoin de porter un équipement de protection individuelle, utiliser uniquement dans une hotte chimique. Mettez-le également dans un conteneur à déchets après utilisation, ne le jetez pas dans l’évier.</li>
	<li>Laver les couvercles deux fois avec 50 μL TBS-Tx et une fois avec 50 μL Antibody Dilution Buffer (AbDil). TBS-Tx a été fabriqué par TBS, 0,1% Triton X-100 et 0,05% Na-azide. AbDil a été fabriqué par TBS-Tx, 2% de BSA et 0,05% de Na-azide.</li>
	<li>Incuber chaque couvercle avec 50 μL d’anticorps primaire anti-PML (dilution 1:50 dans AbDil) / anti-SUMO1 (dilution 1:200 dans AbDil) / anticorps anti-SUMO2/3 (dilution 1:200 dans AbDil) à 4 °C dans une chambre humidifiée pendant la nuit. L’anticorps mCherry peut également être utilisé (dilution 1:200 dans AbDil) pour aider à détecter le signal mCherry pour FISH. REMARQUE: FISH éteint le signal fluorescent mCherry, ce qui rend difficile la différenciation des cellules transfectées avec des plasmides mCherry de celles qui ne sont pas transfectées dans les expériences FISH. L’utilisation de l’anticorps mCherry est conseillée. Alternativement, on peut faire une lignée cellulaire stable exprimant eDHFR contenant de la protéine.</li>
	<li>Lavez les couvercles 3 fois avec AbDil pour éliminer les anticorps primaires non liés.</li>
	<li>Incuber des cellules avec un anticorps secondaire [anticorps secondaire igG (H+L) anti-souris conjugué avec Alexa Fluor 647 pour PML et SUMO, anticorps secondaire anti-lapin IgG (H+L) conjugué avec Alexa Fluor 555 pour mCherry, tous deux à une dilution de 1:1000 dans AbDil] pendant 1 heure dans une boîte sombre à température ambiante.</li>
	<li>Laver les couvercles 3 fois avec TBS-Tx.</li>
	<li>Étiquetez les lames, diluez le DAPI dans un support de montage pour atteindre la concentration finale de DAPI de 1 μg/mL. Ensuite, mettez 2 μL de DAPI dilué sur la lame. Retournez les couvercles et placez-les sur la goutte DAPI, aspirez un liquide supplémentaire à partir du bord du couvercle.</li>
	<li>Scellez avec du vernis à ongles, laissez-le sécher et rincez par le haut de la housse avec de l’eau. Conserver au congélateur pour l’imagerie.</li>
</ol>4. Hybridation in situ par fluorescence (FISH)
<ol><li>Ensemencez10 5 cellules sur des verres à couverture circulaire de 12 mm de diamètre recouverts de poly-D-lysine dans une plaque à 6 puits. Transfecter les cellules avec des plasmides mutants Halo-TRF1 et mCherry-eDHFR-SIM ou mCherry-eDHFR-SIM et attendre 24-48 h avant de passer à FISH. L’étape de dimérisation est la même que celle décrite au 3.2. REMARQUE: Ici, TRF1 n’est pas fusionné avec GFP, de sorte que le canal vert est libéré pour la sonde d’ADN télomère.</li>
	<li>Fixez les cellules avec 4% de formaldéhyde pendant 10 minutes à température ambiante et lavez-les 4 fois avec du PBS. Pour IF-FISH, passez au protocole IF à partir d’ici et après avoir lavé l’anticorps secondaire dans IF (3.8), refixez les cellules avec 4% de formaldéhyde pendant 10 minutes à température ambiante et lavez-les trois fois avec du PBS.</li>
	<li>Couvercles déshydratés dans une série d’éthanol (70%, 80%, 90%, 2 minutes chacun).</li>
	<li>Incuber des couvercles avec une sonde PNA de 488 télC (rapport 1:2000) dans une solution d’hybridation de 5 μL à 75 °C pendant 5 minutes. La solution d’hybridation contient 70% de formamide désionisé, 10 mM de Tris (pH 7,4), 0,5% de réactif bloquant. Ensuite, incubez toute la nuit dans une chambre humidifiée à température ambiante.</li>
	<li>Laver les couvercles avec tampon de lavage (70% formamide, 10 mM Tris) 2 minutes pendant 3 fois à température ambiante et monter avec 1 μg / mL DAPI dans les supports de montage pour l’imagerie. REMARQUE: Le protocole FISH est un protocole publié33'34.</li>
</ol>5. Imagerie en direct
<ol><li>Lorsque les cellules sont prêtes pour l’imagerie, montez des couvercles dans des chambres magnétiques avec des cellules maintenues dans un milieu d’imagerie de 1 mL sans rouge phénol sur une scène chauffée dans une chambre environnementale.</li>
	<li>Installez un microscope et un appareil de contrôle de l’environnement. Les images ont été acquises avec un microscope confocal à disque rotatif avec un objectif 100x 1,4 NA, un Piezo Z-Drive, une caméra EMCCD (Electron Multiplying Charge-Coupled Device) et un module de fusion laser équipé de lasers 455, 488, 561, 594 et 647 nm contrôlés par un logiciel d’imagerie. Les puissances de sortie de tous les lasers sont de 20 mW mesurées à l’extrémité de la fibre.</li>
	<li>Localisez les cellules avec un signal GFP brillant sur les télomères et un signal mCherry localisé de manière diffusive dans le nucléoplasme. Trouvez environ 20 cellules, mémorisez chaque position avec des informations x, y, z et configurez les paramètres pour l’imagerie en accéléré avec un espacement de 0,5 μm pour un total de 8 μm en Z et un intervalle de temps de 5 minutes pendant 2 à 4 heures pour les canaux GFP et mCherry. Utilisez 30 % de 594 nm et 50 % d’intensité énergétique de 488 nm, avec des temps d’exposition de 200 ms et un gain de caméra de 300. REMARQUE: La puissance de sortie des unités laser est de 20 mW. Les foyers GFP brillants indiquent une plus grande taille d’ancrage qui peut nucléer les condensats plus facilement. Trouvez des cellules avec une large gamme de signaux mCherry, car la séparation de phase dépend de la concentration de SIM dans la cellule. Les cellules dont le signal mCherry est trop faible ou trop lumineux peuvent ne pas se séparer. Pour éviter le photobleaching, n’utilisez pas trop de puissance laser ou un temps d’exposition trop long.</li>
	<li>Commencez l’imagerie et prenez une boucle unique comme pré-dimérisation. Pause d’imagerie, ajoutez un support d’imagerie de 0,5 mL contenant 15 μL de dimériseur de 10 μM à la chambre d’imagerie sur la scène afin que la concentration finale du dimériseur soit de 100 nM. Reprendre l’imagerie.</li>
	<li>Lorsque vous êtes prêt à inverser la dimérisation, suspendez l’imagerie, ajoutez un support d’imagerie de 0,5 mL contenant 2 μL de TMP stock de 100 mM à la chambre d’imagerie sur la scène pour obtenir une concentration finale de TMP de 100 μM. Continuez à imager les cellules pendant 1 à 2 heures.</li>
</ol>6. Imagerie fixe
<ol><li>Même configuration de microscope que l’imagerie en direct, le chauffage de la scène n’est pas nécessaire. Utilisez 488 nm pour imager le télomère FISH, 561 nm pour mCherry IF et 647 nm pour PML ou SUMO IF. REMARQUE: Si vous n’utilisez pas d’anticorps mCherry, imagez directement la protéine mCherry, mais signalez peut-être faible en raison de la trempe dans FISH.  Utilisez toujours un laser de 561 nm plutôt que de 594 nm pour imager mCherry afin d’éviter le saignement du signal de Cy5 à mCherry.</li>
	<li>Localisez environ 30 à 50 cellules avec signal rouge (mCherry ou mCherry IF) à sélectionner pour les cellules transfectées.</li>
	<li>Les images ont été prises avec un espacement de 0,3 μm pour un total de 8 μm en Z pour collecter plus de signaux. Utilisez 80 % des 647 nm, 80 % des 561 nm et 70 % des 488 nm d’intensité énergétique, avec des temps d’exposition de 600 ms et un gain de caméra de 300.</li>
</ol>7. Traiter les images time-lapse
<ol><li>Définir le binaire pour les télomères Choisissez une cellule avec toutes les informations de temps et de pile z, choisissez uniquement le canal GFP et créez une couche binaire en définissant un seuil. Ajustez les valeurs inférieure et supérieure du seuil et utilisez des fonctions telles que « Lisser », « Nettoyer » et « Remplir les trous » pour voir dans quelle mesure le seuil capte les objets souhaités à travers tous les points temporels.</li>
	<li>Soustraire l’arrière-plan Choisissez tous les canaux, dessinez le rectangle Région d’intérêt (ROI) sur l’arrière-plan (à l’exception de la cellule). Définissez ce retour sur investissement comme arrière-plan, puis soustrayez l’intensité de l’arrière-plan.</li>
	<li>Lier le binaire télomère à l’intensité du télomère Choisissez le binaire télomère et liez-le au canal GFP pour calculer l’intensité GFP dans les objets binaires en tant qu’intensité télomère.</li>
	<li>Calculer le nombre et l’intensité des télomères au fil du temps Spécifiez les informations à exporter, telles que l’heure, l’ID d’objet, l’intensité moyenne, l’intensité de la somme et les données d’exportation. Utilisez un logiciel de traçage de figures pour lire le tableau exporté et générer des chiffres du nombre de télomères et de l’intensité des télomères (résumer l’intensité sur le volume de chaque télomère, puis faire la moyenne sur tous les télomères d’une cellule) au fil du temps.</li>
</ol>8. Traiter les images à cellules fixes
<ol><li>Définir le binaire pour les APOST Choisissez des cellules transfectées pour l’analyse en recherchant un signal dans un canal 561nm. En suivant la procédure décrite en 7.1, définissez un seuil dans les canaux GFP (TELOMER DNA FISH) et Cy5 (PML ou SUMO IF) pour générer un binaire pour les télomères et les corps PML ou SUMO, respectivement. Fusionnez les couches binaires GFP et Cy5 et créez une nouvelle couche contenant des particules qui ont toutes deux un signal GFP et Cy5 pour représenter la colocalisation du corps PML sur les télomères, donc les APM.</li>
	<li>Calculer le nombre et l’intensité APB/SUMO Soustrayez l’arrière-plan de l’image après 7.2. Lier la couche binaire APB/SUMO au canal Cy5 après la version 7.3. Calculer le nombre et l’intensité APB/SUMO. Exporter et tracer les données suivant la section 7.4.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole a démontré la formation et la dissolution de condensats sur des télomères avec un système de dimérisation chimique. La cinétique de la séparation de phase et du regroupement des télomères induit par la fusion de gouttelettes est surveillée par imagerie en direct. La localisation et la composition des condensats sont déterminées avec l’ADN FISH et la protéine IF.
Ce protocole présente deux étapes critiques. La première consiste à déterminer la concentration en protéines et en dimér...

De nombreuses protéines et acides nucléiques subissent une séparation de phase liquide-liquide (LLPS) et s’auto-assemblent en condensats biomoléculaires pour organiser la biochimie dans les cellules1,2. Le LLPS des protéines de liaison à la chromatine conduit à la formation de condensats associés à des loci génomiques spécifiques et impliqués dans diverses fonctions locales de la chromatine3. Par exemple, LLPS de la protéine HP1 sous-tend la formation de domaines hétérochromatiques pour organiser le génome4,5,LLPS des facteurs de transcription forme des centres de transcription pour réguler la transcription6,LLPS des ARNm naissants et des combinaisons multisensiques la protéine génère des corps de locus histones pour réguler la transcription et le traitement des ARNm d’histones7.  Cependant, malgré la découverte de nombreux exemples de condensats associés à la chromatine, les mécanismes sous-jacents de la formation, de la régulation et de la fonction des condensats restent mal compris. En particulier, tous les condensats associés à la chromatine ne sont pas formés par LLPS et des évaluations minutieuses de la formation de condensats dans les cellules vivantes sont encore nécessaires8,9. Par exemple, il est démontré que la protéine HP1 chez la souris n’a qu’une faible capacité à former des gouttelettes liquides dans les cellules vivantes et que les foyers d’hétérochromatine se comportent comme des globules polymères effondrés10. Par conséquent, des outils pour induire des condensats de novo sur la chromatine dans les cellules vivantes sont souhaitables, en particulier ceux qui permettent l’utilisation de l’imagerie en direct et des essais biochimiques pour surveiller la cinétique de la formation de condensats, les propriétés physiques et chimiques des condensats résultants et les conséquences cellulaires de la formation de condensats.
Ce protocole rapporte un système de dimérisation chimique pour induire des condensats de protéines sur la chromatine11 (Figure 1A). Le dimériseur se compose de deux ligands liés interagissant avec les protéines: le triméthoprime (TMP) et le ligand Halo et peut dimériser des protéines fusionnées aux récepteurs apparentés: Escherichia coli dihydrofolate réductase (eDHFR) et une enzyme alkyldéhalogénase bactérienne (enzyme Halo), respectivement12. L’interaction entre le ligand Halo et l’enzyme Halo est covalente, ce qui permet à l’enzyme Halo d’être utilisée comme ancre en la fusionnant à une protéine liant la chromatine pour recruter une protéine de séparation de phase fusionnée à l’eDHFR en chromatine. Après le recrutement initial, une concentration locale accrue de la protéine séparatrice de phase dépasse la concentration critique nécessaire à la séparation de phase et nuclée ainsi un condensat à l’ancre(Figure 1B). En fusionnant des protéines fluorescentes (par exemple mCherry et eGFP) à eDHFR et Halo, la nucléation et la croissance des condensats peuvent être visualisées en temps réel avec la microscopie à fluorescence. Étant donné que l’interaction entre l’eDHFR et le TMP n’est pas covalente, un excès de TMP libre peut être ajouté pour concurrencer le dimériseur pour la liaison eDHFR. Cela libérera ensuite la protéine de séparation de phase de l’ancre et dissoudra le condensat associé à la chromatine.
Nous avons utilisé cet outil pour induire la formation du corps nucléaire de la leucémie promyélocytaire de novo (LEMP) sur les télomères dans les cellules cancéreuses à télomérase négative qui utilisent une voie alternative d’allongement des télomères (ALT) pour le maintien des télomères13,14.  Les corps nucléaires PML sont des compartiments sans membrane impliqués dans de nombreux processus nucléaires15,16 et sont localisés de manière unique aux télomères ALT pour former des APM, pour les corps PML associés aux télomères ALT17,18. Les télomères se regroupent dans les ABC, probablement pour fournir des modèles de réparation pour la synthèse de l’ADN télomère dirigée par homologie dans ALT19. En effet, la synthèse de l’ADN télomère a été détectée dans les ABC et les ABC jouent un rôle essentiel dans l’enrichissement des facteurs de réparation de l’ADN sur les télomères20,21. Cependant, les mécanismes sous-jacents à l’assemblage APB et au clustering des télomères au sein des APB étaient inconnus. Étant donné que les protéines télomères dans les cellules ALT sont modifiées de manière unique par de petits modificateurs de type ubiquitine (SUMOs)22, de nombreux composants APB contiennent des sites desumoylation 22,23,24 ,25 et / ou des motifs interagissant SUMO (SIM)26,27 et des interactions SUMO-SIM conduisent à la séparation de phase28, nous avons émis l’hypothèse que la sumoylation sur les télomères conduit à l’enrichissement des protéines contenant SUMO / SIM et Les interactions SUMO-SIM entre ces protéines conduisent à une séparation de phase.  La protéine PML, qui a trois sites de sumoylation et un site SIM, peut être recrutée dans les télomères sumoyés pour former des ABC et la coalescence des ABC liquides conduit au regroupement des télomères. Pour tester cette hypothèse, nous avons utilisé le système de dimérisation chimique pour imiter la formation d’APB induite par la sumoylation en recrutant des CARTES SIM pour les télomères(Figure 2A)11. Le GFP est fusionné à Haloenzyme pour la visualisation et à la protéine de liaison aux télomères TRF1 pour ancrer le dimériseur aux télomères. La carte SIM est fusionnée à eDHFR et mCherry. La cinétique de la formation de condensats et le regroupement de télomères induit par la fusion de gouttelettes sont suivis par l’imagerie de cellules vivantes.  La séparation de phase est inversée en ajoutant un excès de TMP libre pour concurrencer la liaison eDHFR. L’immunofluorescence (FI) et l’hybridation in situ par fluorescence (FISH) sont utilisées pour déterminer la composition du condensat et l’association télomérique. Le recrutement de SIM enrichit le SUMO sur les télomères et les condensats induits contiennent du PML et sont donc des APM. Le recrutement d’un mutant SIM qui ne peut pas interagir avec SUMO n’enrichit pas SUMO sur les télomères ni n’induit de séparation de phase, ce qui indique que la force motrice fondamentale de la condensation APB est l’interaction SUMO-SIM. En accord avec cette observation, les polymères polySUMO-polySIM qui fusionnent à un facteur de liaison TRF2 RAP1 peuvent également induire la formation d’APB29. Par rapport au système de fusion polySUMO-polySIM où la séparation de phase se produit tant que suffisamment de protéines sont produites, l’approche de dimérisation chimique présentée ici induit une séparation de phase à la demande et offre ainsi une meilleure résolution temporelle pour surveiller la cinétique de la séparation de phase et du processus de regroupement des télomères. De plus, ce système de dimérisation chimique permet le recrutement d’autres protéines pour évaluer leur capacité à induire la séparation de phase et le regroupement des télomères. Par exemple, une protéine désordonnée recrutée dans les télomères peut également former des gouttelettes et des télomères de cluster sans induire la formation d’APB, ce qui suggère que le regroupement des télomères est indépendant de la chimie de l’APB et ne repose que sur la propriété liquide de l’APB11.

<table><tbody><tr><td>0,25 % de trypsine, 0,1 % d’EDTA dans HBSS sans calcium, magnésium et bicarbonate de sodium</td><td>Corning</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>16 % de formaldéhyde (p/v), sans méthanol</td><td>Thermo Scientific</td><td>28906</td><td>Préparez 1 % dans 1x PBS</td></tr><tr><td>6 Well Culture Plate</td><td>VWR</td><td>10861-554</td><td></td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-101</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-mCherry</td><td>Abcam</td><td>Ab183628</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-PML</td><td>Santa Cruz</td><td>sc966</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-SUMO1</td><td>Abcam</td><td>Ab32058</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-SUMO2/3</td><td>Cytosquelette</td><td>Asm23</td><td></td></tr><tr><td>Réactif bloquant</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706100</td><td></td></tr><tr><td>BTX Tube micro 1.5ML&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>89511-258</td><td></td></tr><tr><td>Circle Cover Slips</td><td>Thermo Scientific</td><td>3350</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal.</td><td>Nikon</td><td>MQS31000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>DMEM avec L-glutamine, 4,5 g/L de glucose et de pyruvate de sodium</td><td>Corning</td><td>MT10017CV</td><td></td></tr><tr><td>caméra EMCCD</td><td>iXon Life.</td><td>897</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>4355221</td><td></td></tr><tr><td>sérum de veau fœtal, qualifié, approuvé par l’USDA Régions</td><td>Gibco</td><td>A4766801</td><td></td></tr><tr><td>formamide, MilliporeSigma</td><td>46-101-00ML</td><td></td>désionisé <td></td></tr><tr><td>IgG anti-souris de chèvre (H+L), anticorps secondaire recombinant, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A28181</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-lapin de chèvre (H+L), anticorps secondaire recombinant, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A32733</td><td></td></tr><tr><td>Pince/pince à épiler/pince à pointe, droite, effilée et de haute précision</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td></td></tr>, <tr><td>module de fusion laser&nbsp ;</td><td>Nikon</td><td>NIIMHF47180</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz’s L-15 Medium</td><td>Gibco</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Réactif de transfection</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de traçage de figures, MATLAB</td><td>The MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slide Box</td><td>Fisher Scientific</td><td>34487</td><td></td></tr><tr><td>Vernis à ongles</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-949-071</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’imagerie, NIS-Elements&nbsp ;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Milieu sérique réduit</td><td>Gibco</td><td>51985091</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x, pH 7,4</td><td>Fisher Scientific</td><td>70-011-044</td><td></td></tr><tr><td>Solution de pénicilline-streptomycine, 100X</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Piezo Z-Drive&nbsp ;</td><td>Physik Instrumente (PI)</td><td>91985</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette</td><td>VWR</td><td>10017</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope à angle coupé uni et givré</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-037-246</td><td></td></tr> Solution <tr><td>de poly-D-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP922I-500</td><td></td></tr><tr><td>Disque rotatif</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Sabots carrés</td><td>Thermo Scientific</td><td>3305</td><td></td></tr><tr><td>TBS 10x solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2471500</td><td></td></tr><tr><td>TelC-Alexa488</td><td>PNA Bio</td><td>F1004</td><td></td></tr><tr><td>TMP</td><td>synthétisé par le laboratoire</td><td></td> Chenoweth <td>Disponible sur demande</td></tr><tr><td>TNH</td><td>synthétisé par le laboratoire</td><td></td> Chenoweth <td>Disponible sur demande</td></tr><tr><td>Tris Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>92-901-00ML</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 10 % Solution</td><td>MilliporeSigma</td><td>64-846-350ML</td><td>Préparer 0,5 % dans 1x lignée cellulaire PBS</td></tr><tr><td>U2Os</td><td>Du laboratoire E.V. Makayev (Université technologique de Nanyang, Singapour)</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>NC9524612</td><td></td></tr></tbody></table>

condensats de protéines induits par dimérisation chimique sur les télomères

Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres

Les condensats associés à la chromatine sont impliqués dans de nombreux processus nucléaires, mais les mécanismes sous-jacents restent insaisissables. Ce protocole décrit un système de dimérisation des protéines induit chimiquement pour créer des condensats sur les télomères. Le dimériseur chimique se compose de deux ligands liés qui peuvent chacun se lier à une protéine: le ligand Halo à Halo-enzyme et le triméthoprime (TMP) à E. coli dihydrofolate réductase (eDHFR), respectivement. La fusion de l’enzyme Halo à une protéine télomère ancre les dimériseurs aux télomères par liaison covalente ligand-enzyme Halo. La liaison du TMP à l’eDHFR recrute la phase fusionnée de l’eDHFR séparant les protéines en télomères et induit la formation de condensats. Étant donné que l’interaction TMP-eDHFR n’est pas covalente, la condensation peut être inversée en utilisant un excès de TMP libre pour concurrencer le dimériseur pour la liaison eDHFR. Un exemple d’induction de la formation du corps nucléaire de la leucémie promyélocytaire (LEMP) sur les télomères et de détermination de la croissance, de la dissolution, de la localisation et de la composition des condensats est montré. Cette méthode peut être facilement adaptée pour induire des condensats à d’autres endroits génomiques en fusionnant Halo à une protéine qui se lie directement à la chromatine locale ou à dCas9 qui cible le locus génomique avec un ARN guide. En offrant la résolution temporelle requise pour l’imagerie en direct unicellulaire tout en maintenant la séparation de phase dans une population de cellules pour les essais biochimiques, cette méthode convient pour sonder à la fois la formation et la fonction des condensats associés à la chromatine.

Des images représentatives de la localisation télomérique de SUMO identifiées par l’ADN télomère FISH et la protéine SUMO IF sont montrées à la figure 2. Les cellules à recrutement SIM enrichissent SUMO1 et SUMO 2/3 sur télomères par rapport aux cellules à recrutement mutant SIM. Cela indique que l’enrichissement SUMO induit par la dimérisation SIM sur les télomères dépend des interactions SUMO-SIM.
Un film en accéléré représentatif de TRF1 et SIM après dimérisati...

Ce protocole illustre un système de dimérisation des protéines induit chimiquement pour créer des condensats sur la chromatine.  La formation d’un corps nucléaire de leucémie promyélocytaire (LEMP) sur des télomères avec des dimériseurs chimiques est démontrée. La croissance, la dissolution, la localisation et la composition des gouttelettes sont surveillées par imagerie cellulaire vivante, immunofluorescence (IF) et hybridation in situ par fluorescence (FISH).

Condensats de protéines induits par dimérisation chimique sur les télomères

Chromatin-associated condensates are implicated in many nuclear processes, but the underlying mechanisms remain elusive. This protocol describes a ...

Ce protocole décrit le système de dimérisation chimique pour induire des condensats de protéines sur les télomères. Il peut être facilement adapté pour induire des condensats sur d’autres loci génomiques, et convient pour sonder la formation et la fonction des condensats associés à la chromatine. Cette méthode offre la résolution temporelle requise pour l’imagerie des cellules vivantes et maintient la séparation de phase dans la population de cellules pour les essais biochimiques.Pour commencer, dissoudre les dimériseurs dans le DMSO à 10 millimolaires et les stocker dans des tubes de microcentrifugation en plastique à moins 80 degrés Celsius pour un stockage à long terme. Diluer une aliquote de dimériseur de 10 millimolaires dans un milieu imageur jusqu’à une concentration en stock de 10 micromolaires et la stocker à moins 20 degrés Celsius. Lorsqu’ils sont prêts à l’emploi, diluez les dimériseurs à une concentration de travail finale de 100 nanomolaires dans un milieu de croissance ou un milieu d’imagerie.Ensemencez les cellules de 10 à la cinquième dans des verres à couverture circulaire de 12 millimètres de diamètre recouverts de poly-D-lysine dans une plaque à six puits. Ensuite, transfectez les cellules avec les plasmides mutants Halo-GFP-TRF1 et mCherry-eDHFR-SIM ou mCherry-eDFR-SIM et attendez 24 à 48 heures avant de procéder à l’immunofluorescence. Ajouter les 100 dimériseurs nanomolaires dilués aux cellules et les incuber à 37 degrés Celsius pendant quatre à cinq heures.Après l’incubation, fixer les cellules dans une solution de PBS contenant 4% de formaldéhyde et 0,1% de Triton X-100 pendant 10 minutes à température ambiante pour perméabiliser les cellules. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec PBS. Le couvercle de lavage glisse deux fois avec 50 microlitres de TBS-Tx et une fois avec 50 microlitres de tampon de dilution d’anticorps.Incuber chaque couvercle avec 50 microlitres d’anticorps primaires anti-PML, anti-SUMO-1 ou anti-SUMO-2 et 3 à quatre degrés Celsius dans une chambre humidifiée pendant la nuit. Le couvercle de lavage glisse trois fois avec un tampon de dilution d’anticorps pour éliminer l’anticorps primaire non lié, puis incube les cellules avec un anticorps secondaire pendant une heure dans une boîte sombre à température ambiante. Après la coloration, le couvercle de lavage glisse trois fois avec TBS-Tx.Étiquetez les diapositives en ajoutant deux microlitres d’un microgramme par millilitre de DAPI, puis retournez les glissements de couvercle et placez-les sur la goutte de DAPI. Aspirer le liquide supplémentaire du bord du couvercle. Scellez la glissière avec du vernis à ongles, laissez-la sécher et rincez le haut du couvercle avec de l’eau.Placez les lames au congélateur jusqu’à l’imagerie. Ensemencez 10 à la cinquième cellule sur des verres à couverture circulaire de 12 millimètres recouverts de Poly-D-Lysine dans une plaque à six puits et transfectez-les avec des plasmides mutants Halo-TRF1 et mCherry-eDHFR-SIM ou mCherry-eDHFR-SIM. Fixez les cellules avec 4% de formaldéhyde pendant 10 minutes à température ambiante et lavez-les quatre fois avec du PBS.Pour IF-FISH, colorez les cellules avec des anticorps primaires et secondaires et refixez-les avec du formaldéhyde à 4% pendant 10 minutes à température ambiante, puis lavez-les quatre fois avec du PBS et déshydratez les glissières de couverture dans une série d’éthanol. Incuber les glissements de couverture avec la sonde C-PNA de 488 télomères dans cinq microlitres de solution d’hybridation à 75 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis incuber les glissements de couverture pendant la nuit dans une chambre humidifiée à température ambiante. Lavez les couvercles trois fois avec un tampon de lavage pendant deux minutes par lavage à température ambiante et montez-les avec un microgramme par millilitre DAPI dans un support de montage pour l’imagerie.Pour l’imagerie en direct, montez les glissières de couverture dans des chambres magnétiques sur une scène chauffée dans une chambre environnementale, en maintenant les cellules dans un millilitre de milieu d’imagerie sans rouge phénol. Installez le microscope et l’appareil de contrôle de l’environnement comme décrit dans le manuscrit du texte. Localiser les cellules avec un signal GFP lumineux sur les télomères et un signal diffusif mCherry dans le cytosol.Trouvez environ 20 cellules, mémorisez chaque position avec les informations XYZ et configurez les paramètres pour l’imagerie time-lapse. Utilisez un espacement de 0,5 micromètre pour un total de huit micromètres en Z et un intervalle de temps de cinq minutes pendant deux à quatre heures pour les canaux GFP et mCherry. Utilisez 30% de 594 nanomètres et 50% d’intensité de puissance de 488 nanomètres, avec des temps d’exposition de 200 millisecondes et un gain de caméra de 300.Commencez l’imagerie et prenez une boucle temporelle comme pré-dimérisation. Ensuite, mettez l’imagerie en pause, ajoutez 0,5 millilitre de support d’imagerie contenant 15 microlitres de 10 dimériseurs micromolaires à la chambre d’imagerie, en prenant soin de ne pas toucher la scène, et reprenez l’imagerie. Lorsque vous êtes prêt à inverser la dimérisation, suspendez l’imagerie et ajoutez 0,5 millilitre de support d’imagerie contenant deux microlitres de TMP stock de 100 millimolaires à la chambre d’imagerie.Continuez à imager les cellules pendant une à deux heures. Pour l’imagerie fixe, utilisez la même configuration de microscope que l’imagerie en direct, mais sans chauffage de la scène. Localisez environ 30 à 50 cellules avec le signal rouge à sélectionner pour les cellules transfectées.Acquérir des images avec un espacement de 0,3 micromètre pour un total de huit micromètres dans Z.Utilisez 80% de 647 nanomètres, 80% de 561 nanomètres et 70% d’intensité de puissance de 488 nanomètres, avec des temps d’exposition de 600 millisecondes et un gain de caméra de 300. La localisation télomérique de SUMO a été identifiée à l’aide de l’ADN télomère FISH et de l’immunofluorescence de la protéine SUMO. Les cellules avec recrutement SIM enrichissaient SUMO-1 et SUMO-2 et 3 par rapport aux cellules avec recrutement de mutants SIM, ce qui indique que l’enrichissement SUMO induit par la dimérisation SIM sur les télomères dépend des interactions SUMO-SIM.Un film en accéléré de TRF-1 et SIM après dimérisation est montré ici. Sim a été recruté avec succès pour les télomères, et les foyers SIM et TRF-1 sont devenus plus grands et plus lumineux, comme prévu pour la formation et la croissance de gouttelettes liquides. En outre, la fusion des foyers TRF-1 a été observée, ce qui a conduit à un regroupement des télomères, comme le montre la réduction du nombre de télomères et l’augmentation de l’intensité des télomères au fil du temps.En revanche, le mutant SIM a été recruté pour les télomères après dimérisation, mais n’a induit aucune formation de gouttelettes ou de regroupement de télomères, ce qui indique que la séparation de phase et le regroupement des télomères sont entraînés par les interactions SUMO-SIM. L’inversion de la séparation de phase et du regroupement des télomères a été observée après l’ajout d’un excès de TMP libre. Le nombre de télomères a augmenté et l’intensité des télomères a diminué au fil du temps.Des images représentatives des APM identifiés par l’ADN télomère FISH et la protéine PML IF sont montrées ici. Les cellules avec SIM recruté ont plus d’APN que les cellules avec un mutant SIM recruté, ce qui suggère que les condensats induits par la dimérisation sont en effet des APN. Lors de l’exécution de ce protocole, n’exposez pas les dimériseurs sensibles à la lumière à la lumière.Travaillez dans une pièce sombre avec une lampe qui émet de la lumière rouge et enveloppez les cellules avec du papier d’aluminium pendant l’incubation. En suivant cette procédure, l’étiquetage de proximité peut être utilisé pour générer une liste complète des composants du condensat induit. L’imagerie en direct peut être utilisée pour suivre la dynamique des composants dans le condensat.Ces méthodes peuvent aider à déterminer les rôles de la gouvernance du contrôle de la composition des condensats.

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