Visualisation et quantification des dommages à l’ADN spécifiques au site à base d’endonucléase

Cette vidéo de méthodologie présente les étapes cruciales des protocoles d’immunomarquage et d’immunoprécipitation de la chromatine régulièrement utilisés pour étudier le processus cellulaire lié aux dommages à l’ADN et pour visualiser et quantifier le recrutement des protéines impliquées dans la réparation de l’ADN. Cette technique fournit aux chercheurs des outils puissants pour identifier de nouvelles protéines liées au locus génomique endommagé, ainsi que leurs modifications post-traductionnelles nécessaires à la régulation affinée lors de la réparation de l’ADN. Étant donné que ces techniques peuvent être appliquées pour étudier différents processus cellulaires, elles ont une pertinence potentielle si une microirradiation laser ou les systèmes d’induction dommageables à l’ADN à base de noyau sont utilisés.

Récemment, plusieurs outils puissants ont été développés pour induire des dommages à l’ADN spécifiques au site qui peuvent être utilisés pour étendre notre compréhension de la réparation de l’ADN. Appliquant des approches biochimiques et génétiques, ces ustensiles sont essentiels pour révéler les événements cellulaires associés au recrutement et à l’assemblage de complexes de réparation de l’ADN sur le site des dommages à l’ADN. De plus, ces techniques permettent d’étudier ces processus à la résolution d’une seule cellule en utilisant à la fois des cellules fixes et vivantes.

Maintenez les cellules d’U2OS dans des monocouches dans le milieu de culture de DMEM complété avec du sérum foetal de veau de 10%, de la glutamine millimolaire 2, et de la solution antibiotique-antimycotique de 1%. Cultiver des cellules dans un environnement humidifié à 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés jusqu’à ce que 80% de confluence soit atteint, en renouvelant le milieu tous les deux à trois jours. Aspirer le milieu et laver les cellules avec du PBS.

Détachez les cellules avec une solution de trypsine-EDTA. Lorsque les cellules se détachent, arrêtez l’activité de la trypsine en ajoutant des milieux de culture aux cellules, ce qui donne une suspension cellulaire. Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage de cellules.

La plaque 20 000 cellules par millilitre par puits sur la plaque de 24 puits avec couvercle rond stérile de 12 millimètres glisse dans chaque puits. Incuber les cellules pendant 24 heures à 37 degrés dans un environnement humidifié à 5% de dioxyde de carbone pour permettre la fixation sur les glissements de couverture. Traiter les cellules avec 10 nanogrammes par millilitre de néocarzinostatine ou utiliser la méthode appropriée pour induire des ruptures à double brin via des systèmes à base d’endonucléuse.

Incuber les cellules pendant une à huit heures à 37 degrés dans un environnement humidifié à 5% de dioxyde de carbone pour suivre la cinétique de la réparation de l’ADN. Fixer les cellules avec une solution de PBS de formaldéhyde à 4% pendant 20 minutes à 25 degrés. Retirer la solution de fixation et laver les cellules trois fois avec du PBS pendant cinq minutes chacune.

Retirer le PBS et ajouter 0,2 % de Triton X dissous dans le PBS. Incuber les échantillons pendant 20 minutes. Lavez les cellules trois fois avec du PBS.

Bloquer la liaison non spécifique avec 5% BSA dilué dans BSA-PBST et incuber les échantillons pendant au moins 20 minutes. Ajouter la quantité appropriée d’anticorps primaires dilués dans une solution de BSA-PBST à 1 %. Placer chaque couvercle glisser à l’envers sur un parafilm ou 10 gouttelettes de microlitres de l’anticorps dilué.

Incuber les échantillons dans une chambre d’humidité pendant une heure et demie à quatre degrés. Placez les glissements de couverture en arrière étant côté vers le haut dans la plaque de 24 puits et le lavage trois fois avec PBS. Ajouter la quantité appropriée d’anticorps secondaires dilués dans 1 % de BSA-PBST.

Placez chaque couvercle glisser à l’envers sur le parafilm sur une gouttelette de 10 microlitres de l’anticorps dilué. Incuber les échantillons dans une chambre d’humidité à quatre degrés pendant une heure. Replacez les glissades du couvercle en cours de mise en place dans la plaque de 24 puits et lavez trois fois avec du PBS.

Avant de retirer la dernière solution de lavage PBS, retirez doucement les glissades de couverture avec la moitié de la pince à épiler et de l’aiguille, puis placez-les à l’envers sur les lames de verre avec des gouttelettes de support de montage. L’immunoprécipitation de la chromatine est une technique largement utilisée pour identifier les modèles de liaison des protéines à l’ADN. Pour révéler l’occupation d’une protéine de réparation du désir autour du DSB, un anticorps spécifique est utilisé pour immunoprécipiter la protéine d’intérêt de la préparation de chromatine ainsi que la région de l’ADN à laquelle elle est liée.

En outre, ChIP a été couramment appliqué pour cartographier la présence d’une modification post-traductionnelle spécifique utilisée par les DSB à un lieu génomique donné. Environ 20 millions de cellules par millilitre doivent être cultivées dans un plat de 15 centimètres pour chaque échantillon. Retirer le milieu de culture et laver les cellules deux fois avec du PBS glacé.

Fixer les cellules avec une solution de formaldéhyde-PBS à 1%. Placer la plaque sur un agitateur orbital et agiter doucement pendant 20 minutes. Arrêtez la fixation avec de la glycine pour atteindre une concentration finale de 125 millimolaires et incuber sur un agitateur d’orbiteur avec une agitation douce pendant cinq minutes à 25 degrés.

Placez la plaque sur de la glace et lavez-la deux fois avec du PBS glacé. Grattez les cellules dans du PBS glacé et transférez-les dans des tubes coniques de 15 millilitres. Centrifuger les cellules à 5 000 tr/ min pendant cinq minutes à quatre degrés.

Aspirer soigneusement le surnageant et ressusciter le culot dans un tampon de lyse cellulaire à deux millilitres et incuber sur de la glace pendant 10 minutes. Centrifuger à 5 000 tr/min pendant cinq minutes à quatre degrés. Jetez soigneusement le surnageant et ressuscitez la pastille dans 500 à 1 500 tampons de lyse nucléaire microlitres et incuber sur de la glace pendant 30 à 60 minutes.

Transférer le lysat dans un tube conique en polystyrène adapté à la sonication. Soniquez le lysat pour ciselé l’ADN à une taille moyenne de fragment de 300 à 1000 paires de bases. Préparez dynabeads pour les étapes de pré-nettoyage et d’immunoprécipitation.

Laver les perles deux fois pendant 10 minutes à quatre degrés avec un tampon RIPA. Ressuscitez dynabeads dans le même volume de tampon RIPA que vous avez retiré de la solution mère d’origine dans les étapes 3.1. Pré-effacer 25 à 30 microgrammes de chromatine de chaque échantillon avec quatre Dynabeads microlitres par rotation pendant une à deux heures à quatre degrés.

Précipitez les Dynabeads avec un aimant et transférez le surnageant dans un nouveau tube Eppendorf. Ajouter la quantité appropriée d’anticorps à chaque échantillon de chromatine et tourner pendant la nuit à quatre degrés. Le lendemain, ajoutez 40 microlitres de Dynabeads lavés à chaque échantillon et incuber pendant la nuit en tournant à quatre degrés.

Laver une fois avec 300 microlitres de tampon à faible teneur en sel pendant 10 minutes avec une rotation à quatre degrés. Laver une fois avec 300 microlitres de tampon à haute teneur en sel pendant 10 minutes avec une rotation à quatre degrés. Laver une fois avec un tampon de chlorure de lithium 300 microlitres pendant 10 minutes avec une rotation à quatre degrés.

Laver deux fois avec 300 microlitres TE pendant 10 minutes avec rotation pour le premier lavage à quatre degrés et le deuxième lavage à 25 degrés. Ajouter 200 tampons d’élution microlitres aux billes et les incuber à 65 degrés dans un thermo-agitateur pendant 15 minutes avec une secousse continue. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et éluer à nouveau des perles dans un tampon d’élution microlitre de 200 microlitres.

Ajouter 500 microgrammes par millilitre protéinase-K et demi-pour cent de SDS et incuber les échantillons à 50 degrés pendant deux heures. Effectuer l’extraction du chloroforme et transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube Eppendorf. Ajouter deux volumes et demi d’éthanol absolu et 0,1 volume trois molaires d’acétate de sodium pH 5,2.

Incuber pendant au moins 20 minutes à moins 80 degrés. Retirez l’éthanol et séchez le culot à l’air. Ressusciter la pastille dans 50 microlitres TE. Pour étudier leur distribution spéciale sur l’ADN, l’immunoprécipitation de la chromatine doit être appliquée.

Un résultat expérimental typique obtenu par ChIP-qPCR est présenté dans cette figure, qui démontre l’enrichissement temporel de l’histone gamma AX comme réponse aux dommages induits I-PpoI-induits d’ADN. Sur la partie gauche de l’image, le signal AX gamma détecté en temps opportun est montré du côté de la rupture, tandis que sur la partie droite, la distribution de l’histone gamma AX est présentée à la région du gène de contrôle à laquelle les ruptures démontrées n’ont pas été induites. Bien que la réparation de l’ADN soit un domaine de recherche relativement récent, nos connaissances augmentent rapidement à l’aide de méthodes biochimiques et microscopiques.

Néanmoins, les techniques biochimiques, telles qu’une tache occidentale, l’immunoprécipitation, et la spectrométrie de masse exigent une grande quantité de cellules. Les processus de réparation de l’étude représentent un instantané de la population cellulaire souhaitée. Le champ microscopique a été révolutionné par des techniques à haute résolution, telles que le microscope à super résolution, qui permet la visualisation des processus cellulaires induits par les dommages à l’ADN au niveau nucléosomique, ainsi que la cartographie précise de la co-localisation des protéines.

D’autre part, l’immunoprécipitation de la chromatine est un outil puissant, en particulier en la combinant avec des méthodes de séquençage pour visualiser son modèle de liaison à l’échelle du génome d’une protéine liée à la réparation de l’ADN souhaitée et des ruptures à double brin dans des régions de chromatine ou d’hétérochromatine.