Name: Mesures basées sur la fluorescence de l’échange phosphatidylsérine/phosphatidylinositol 4-phosphate entre les membranes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Découvrez des protocoles de fluorescence pour mesurer le transfert de phosphatidylsérine et de phosphatidylinositol 4-phosphate par des protéines de transfert lipidiques, en utilisant Osh6p de levure et des membranes artificielles.

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Nous sommes reconnaissants à la Dre A. Cuttriss pour sa relecture attentive du manuscrit. Ces travaux sont financés par la subvention ExCHANGE de l’Agence nationale de la recherche Français (ANR-16-CE13-0006) et par le CNRS.

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts.

Les résultats de ces tests reposent directement sur les signaux des capteurs lipidiques fluorescents. Ainsi, la purification de ces sondes marquées à un rapport de 1:1 avec NBD et sans contamination fluorophore NBD libre est une étape critique de ce protocole. Il est également obligatoire de vérifier si le LTP examiné est correctement plié et non agrégé. La quantité de LTP testée dans les essais d’extraction doit être égale ou supérieure à celle des molécules PS ou PI(4)P accessibles pour mesurer correctement si cette LT...

La distribution précise des lipides entre différentes membranes et à l’intérieur des membranes des cellules eucaryotes1,2 a de profondes implications biologiques. Décrypter le fonctionnement des LTP est une question importante en biologie cellulaire3,4,5,6, et les approches in vitro sont d’une grande valeur pour aborder cette question7,8,9,10,11. Ici, une stratégie in vitrobasée sur la fluorescence est présentée qui a joué un rôle déterminant dans l’établissement que plusieurs protéines ORP/Osh affectent l’échange PS/PI(4)P entre les membranes cellulaires12 et constituent ainsi une nouvelle classe de LTP. PS est un glycérophospholipide anionique qui représente 2 à 10% des lipides membranaires totaux dans les cellules eucaryotes13,14,16. Il est distribué le long d’un gradient entre l’ER et le PM, où il représente 5-7% et jusqu’à 30% des glycérophospholipides, respectivement17,18,19. De plus, la PS est essentiellement concentrée dans la foliole cytosolique du PM. Cette accumulation et la partition inégale de PS dans le PM sont essentielles pour les processus de signalisation cellulaire19. En raison de la charge négative des molécules PS, la foliole cytosolique du PM est beaucoup plus anionique que la foliole cytosolique des autres organites1,2,19,20. Cela permet le recrutement, via des forces électrostatiques, de protéines de signalisation telles que le substrat C-kinase riche en alanine myristylée (MARCKS)21,le sarcome (Src)22,l’oncogène viral du sarcome Kirsten-rat (K-Ras)23et le substrat de toxine botulique C3 lié à Ras 1 (Rac1)24 qui contiennent un tronçon d’acides aminés chargés positivement et une queue lipidique.
La PS est également reconnue par la protéine kinase C conventionnelle de manière stéréosélective via un domaine C225. Cependant, le PS est synthétisé dansl’ER 26, indiquant qu’il doit être exporté vers le PM avant de pouvoir jouer son rôle. On ne savait pas comment cela avait été accompli19 jusqu’à ce que l’on constate que, dans la levure, Osh6p et Osh7p transfèrent le PS de l’ER au PM27. Ces LTP appartiennent à une famille conservée de manière évolutionnaire chez les eucaryotes dont le membre fondateur est OSBP et qui contient des protéines (ORP chez l’homme, protéines Osh chez la levure) intégrant un domaine lié à l’OSBP (ORD) avec une poche pour héberger une molécule lipidique. Osh6p et Osh7p sont uniquement constitués d’un ORD dont les caractéristiques structurelles sont adaptées pour lier spécifiquement le PS et le transférer entre les membranes. Néanmoins, la façon dont ces protéines ont transféré le PS de l’ER au PM n’était pas claire. Osh6p et Osh7p peuvent piéger PI(4)P comme ligand lipidiquealternatif 12. Dans la levure, PI(4)P est synthétisé à partir du phosphatidylinositol (PI) dans le Golgi et le PM par les PI 4-kinases, Pik1p et Stt4p, respectivement. En revanche, il n’y a pas de PI(4)P dans la membrane ER, car ce lipide est hydrolysé en PI par la phosphatase Sac1p. Par conséquent, un gradient PI(4)P existe à la fois aux interfaces ER/Golgi et ER/PM. Osh6p et Osh7p transfèrent le PS de l’ER au PM via des cycles d’échange PS/PI(4)P en utilisant le gradient PI(4)P qui existe entre ces deux membranes12.
Au cours d’un cycle, Osh6p extrait le PS de l’ER, échange le PS contre le PI(4)P au PM et transfère le PI(4)P à l’ER pour extraire une autre molécule de PS. Osh6p / Osh7p interagissent avec Ist2p28, l’une des rares protéines qui se connectent et rapprochent la membrane ER et le PM pour créer des sites de contact ER-PM dans la levure29,30,31. De plus, l’association d’Osh6p avec des membranes chargées négativement devient faible dès que la protéine extrait l’un de ses ligands lipidiques en raison d’un changement conformationnel qui modifie ses caractéristiques électrostatiques32. Cela aide Osh6p en raccourcissant son temps de séjour membranaire, maintenant ainsi l’efficacité de son activité de transfert lipidique. Combiné à la liaison à Ist2p, ce mécanisme pourrait permettre à Osh6p/7p d’exécuter rapidement et avec précision l’échange de lipides à l’interface ER/PM. Dans les cellules humaines, les protéines ORP5 et ORP8 exécutent l’échange PS/PI(4)P sur les sites de contact ER-PM via des mécanismes distincts33. Ils ont une ORD centrale, semblable à Osh6p, mais sont directement ancrés à l’ER via un segment transmembranaire C-terminal33 et s’amarrent au PM via un domaine d’homologie de Pleckstrin (PH) N-terminal qui reconnaît PI(4)P et PI(4,5)P233,34,35. ORP5/8 utilise PI(4)P pour transférer PS, et il a été démontré que ORP5/8 régule en outre les niveaux de PM PI(4,5)P2 et module probablement les voies de signalisation. À son tour, une diminution des niveaux de PI(4)P et PI(4,5)P2 diminue l’activité ORP5/ORP8 car ces protéines s’associent au PM d’une manière dépendante du PIP. La synthèse anormalement élevée de PS, qui conduit au syndrome de Lenz-Majewski, a un impact sur les niveaux de PI(4)P par ORP5/836. Lorsque l’activité des deux protéines est bloquée, le PS devient moins abondant au PM, ce qui réduit la capacité oncogène des protéines de signalisation37.
Inversement, la surexpression d’ORP5 semble favoriser l’invasion des cellules cancéreuses et les processus métastatiques38. Ainsi, les altérations de l’activité ORP5/8 peuvent modifier gravement le comportement cellulaire par des changements dans l’homéostasie lipidique. De plus, ORP5 et ORP8 occupent les sites de contact ER-mitochondries et préservent certaines fonctions mitochondriales, éventuellement en fournissant PS39. De plus, ORP5 se localise sur les sites de contact des gouttelettes ER-lipidiques pour délivrer du PS aux gouttelettes lipidiques par échange PS/PI(4)P40. La stratégie décrite ici pour mesurer (i) l’extraction de PS et DEP(4)P à partir de liposomes et (ii) le transport de PS et de PI(4)P entre liposomes a été conçue pour établir et analyser l’activité d’échange de PS/PI(4)P d’Osh6p/Osh7p12,32 et utilisée par d’autres groupes pour analyser l’activité d’ORP5/ORP835 et d’autres LTP10, 41. Il est basé sur l’utilisation d’un lecteur de plaque de fluorescence, d’un spectrofluoromètre standard au format L et de deux capteurs fluorescents, NBD-C2Lact et NBD-PHFAPP,qui peuvent détecter PS et PI(4)P, respectivement.
NBD-C2Lact correspond au domaine C2 de la glycoprotéine, la lactadhérine, qui a été remanié pour inclure une cystéine unique exposée au solvant près du site de liaison présumé du PS; un fluorophore NBD (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol) sensible à la polarité est lié de manière covalente à ce résidu(Figure 1A)12. Pour être plus précis, le domaine C2 de la lactadhérine (Bos taurus, UniProt: Q95114, résidus 270-427) a été cloné dans un vecteur pGEX-4T3 à exprimer en fusion avec la glutathion S-transférase (GST) chez Escherichia coli. La séquence C2Lact a ensuite été mutée pour remplacer deux résidus de cystéine accessibles aux solvants (C270, C427) par des résidus d’alanine et pour introduire un résidu de cystéine dans une région proche du site putatif de liaison PS (mutation H352C) qui peut ensuite être marqué avec N,N'-diméthyl-N-(iodoacétyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)éthylène diamine (IANBD)12 . Un site de clivage de la thrombine est présent entre la protéine GST et le N-terminus du domaine C2. Un avantage majeur est que ce domaine reconnaît sélectivement PS d’une manière indépendante de Ca2+contrairement à d’autres domaines C2 connus ou Annexin A542. NBD-PHFAPP est dérivé du domaine PH de la protéine 1 humaine adapteur de quatre phosphates (FAPP1), qui a été remaniée pour inclure une seule cystéine exposée au solvant qui peut être étiquetée avec un groupe NBD près du site de liaison PI(4)P (Figure 1A)43. La séquence nucléotidique du domaine PH de la protéine FAPP humaine (UniProt: Q9HB20, segment [1-100]) a été clonée en un vecteur pGEX-4T3 pour être exprimé en tandem avec une étiquette GST. La séquence PHFAPP a été modifiée pour insérer un résidu de cystéine unique dans l’interface de liaison membranaire de la protéine43. De plus, un agent de liaison à neuf résidus a été introduit entre le site de clivage de la thrombine et la terminaison N du domaine PH pour assurer l’accessibilité à la protéase.
Pour mesurer l’extraction de PS à partir de liposomes, NBD-C2Lact est mélangé à des liposomes en phosphatidylcholine (PC) contenant des traces de PS. En raison de son affinité pour le PS, cette construction se lie aux liposomes, et le fluorophore NBD subit un changement de polarité lorsqu’il entre en contact avec l’environnement hydrophobe de la membrane, ce qui provoque un décalage bleu et une augmentation de la fluorescence. Si le PS est extrait presque complètement par une quantité stœchiométrique de LTP, la sonde ne s’associe pas aux liposomes, et le signal NBD est plus faible(Figure 1B)32. Cette différence de signal est utilisée pour déterminer si un LTP(par exemple, Osh6p) extrait PS. Une stratégie similaire est utilisée avec NBD-PHFAPP pour mesurer l’extraction PI(4)P(Figure 1B), comme décrit précédemment12,32. Deux tests basés sur FRET ont été conçus pour (i) mesurer le transport PS des liposomes LA à LB, qui imitent respectivement la membrane ER et le PM, et (ii) le transport PI(4)P dans le sens inverse. Ces essais sont effectués dans les mêmes conditions(c.-à-d. même tampon, température et concentration lipidique) pour mesurer l’échange PS/PI(4)P. Pour mesurer le transport de la PS, NBD-C2Lact est mélangé à des liposomes LA composés de PC et dopés avec 5 mol% de PS et 2 mol% d’une phosphatidyléthanolamine fluorescente marquée à la rhodamine (Rhod-PE) - et des liposomes LB incorporant 5 mol% PI(4)P.
Au temps zéro, FRET avec Rhod-PE éteint la fluorescence NBD. Si le PS est transporté des liposomes LA vers LB (par exemple, lors de l’injection d’Osh6p), une décrochage rapide se produit en raison de la translocation des molécules NBD-C2Lact des liposomes LA à LB (Figure 1C). Compte tenu de la quantité de PS accessible, NBD-C2Lact reste essentiellement dans un état lié à la membrane au cours de l’expérience12. Ainsi, l’intensité du signal NBD est directement corrélée avec la distribution de NBD-C2Lact entre les liposomes LA et LB et peut être facilement normalisée pour déterminer la quantité de PS transférée. Pour mesurer le transfert de PI(4)P dans la direction opposée, NBD-PHFAPP est mélangé avec des liposomes LA et LB; étant donné qu’il ne se lie qu’aux liposomes LB qui contiennent pi(4)P, mais pas Rhod-PE, sa fluorescence est élevée. Si PI(4)P est transféré aux liposomes LA, il se transfère à ces liposomes, et le signal diminue en raison de FRET avec Rhod-PE (Figure 1C). Le signal est normalisé pour déterminer la quantité de PI(4)P transférée43.

<table><tbody><tr><td>&nbsp ; L-cystéine &ge ; 97 % (FG)&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>W326305-100G</td><td>Préparez une solution mère de L-cystéine de 10 mM dans l’eau. Les aliquotes sont stockées à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Flacon ambré de 2 mL, PTFE/Rub Lnr, pour le stockage des lipides dans CHCL3</td><td>Wheaton</td><td>W224681</td><td></td></tr><tr><td>billes de verre de 4 mm de diamètre</td><td>Sigma</td><td>Z265934-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger conique de 50 mL</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml ; Purificateur KTA</td><td>GE healthcare</td><td></td><td>FPLC</td></tr><tr>Feuille <td></td><td></td><td></td><td>d’aluminium</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 avec un MWCO de 3 et 10 kDa</td><td>Merck</td><td>UFC900324, UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 avec un MWCO de 3 et 10 kDa</td><td>Merck</td><td>UFC800324, UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td></td><td></td><td>Préparez une solution mère de 50 mg/mL avec de l’eau filtrée et stérilisée et conservez-la à -20 & deg ;C.</td></tr><tr><td>Bestatin</td><td>Sigma</td><td>B8385-10mg</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Or Cellules Compétentes</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C16:0 Liss&nbsp ; (Rhod-PE) dans CHCl3 (1 mg/mL)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810158C-5MG</td><td></td></tr><tr><td>C16:0/C16:0-PI(4)P&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Echelon Lipids</td><td>P-4016-3</td><td>Dissoudre 1 mg de poudre de C16:0/C16:0-PI(4)P en 250 & micro ; L de MeOH et 250 &micro ; L de CHCl3. Complétez ensuite avec CHCl3 à 1 mL. La solution doit devenir claire.</td></tr><tr><td>C16:0/C18:1-PS (POPS) dans CHCl3 (10 mg/mL)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840034C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>C18:1/C18:1-PC (DOPC) dans CHCl3 (25 mg/mL)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C-500mg</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2sp ;</td><td>Sigma</td><td></td><td>Préparez 10 mM de solution mère de CaCl2 dans de l’eau.</td></tr><tr><td>Disrupteur cellulaire</td><td>à dynamique</td><td></td><td></td>constante</tr><tr><td>Chloroforme (CHCl3) RPE-ISO</td><td>Carlo Erba</td><td>438601</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail complet d’inhibiteurs de protéase sans EDTA</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Eau</td><td></td><td></td><td></td>déminéralisée (Milli-Q)</tr><tr><td>Diméthylformamide (DMF), anhydre, pure</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>à >99 %DNAse I Recombinante, sans RNAse, en poudre</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-B</td><td>Préparer 1 M de solution mère de DTT dans de l’eau Milli-Q.&nbsp ; Préparez 1 mL d’aliquotes et conservez-les à -20 °C.</td></tr><tr><td>Colonnes de chromatographie Econo-Pac (1,5 & times ; 12 cm).</td><td>Cuvette</td><td>d’électroporation Biorad 7321010</td><td></td></tr><tr><td>2 mm</td><td>Ozyme</td><td>EP102</td><td></td></tr><tr><td>Électroporateur Eppendorf 2510</td> Rotor à angle fixe <td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes Ti45 et Ti45</td><td>Beckman</td><td>Rotation des lysats</td><td></td>batcéraux</tr><tr><td>Seringues en verre (10, 25 et 50 & micro ; L) pour l’expérience de fluorescence</td><td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringues en verre (25, 100, 250, 500 et 1000 & micro ; L) pour manipuler les solutions mères lipidiques</td><td>Hamilton</td><td>1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN</td><td></td></tr><tr><td>Glutathion Sepharose 4B billes</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-05</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol (pur à 99 %)</td><td>Sigma</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tubes d’hémolyse avec capuchon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES , >99 % pur</td><td>Sigma</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Illustra Colonne de dessalage NAP 10</td><td>GE healthcare</td><td>GE17-0854-02</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta ;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&nbsp ;</td><td>Euromedex</td><td>EU0008-B</td><td>Préparer une solution mère d’IPTG à 1 M dans Milli-Qwater. Préparez 1 mL d’aliquotes et conservez-les à -20 °C.</td></tr><tr><td>K-Acétate</td><td>Prolabo</td><td>26664.293</td><td></td></tr><tr><td>Lennox LB Bouillon moyen sans glucose</td><td></td><td></td><td>Préparé avec de l’eau milli-Q et autoclave.</td></tr><tr><td>Azote liquide</td><td>Linde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol (MeOH) &ge ; 99,8 %</td><td>VWR</td><td>20847.24</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td></td><td>Préparez une solution de 2 M de MgCl2. Filtrer la solution à l’aide d’un 0,45 & micro ; m filtre.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Microplaque 96 puits PS F-Botom Noir Non-Contraignant</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Extrudeuse avec deux seringues Hamilton étanches aux gaz de 1 mL</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques de fluorescence basé sur un monochromateur</td><td>TECAN</td><td>M1000 Pro</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-Diméthyl-N-(Iodoacétyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide)</td><td>Dissoudre</td><td></td><td>25 mg d’IANBD dans 2,5 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO) et préparer 25 aliquotes de 100 &micro ; L dans des tubes à bouchon à vis de 1,5 mL. Ne vissez pas complètement le capuchon. Ensuite, retirez le DMSO dans un lyophilisateur pour obtenir 1 mg d’IANBD sec par tube. Les tubes sont fermés et stockés à -20 &deg ; C dans l’obscurité. &nbsp ;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1,8 mM KH2PO4, autoclavé et stocké à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Fioles en verre en forme de poire (25 mL, 14/23, verre Duran)</td>Pépstatine du groupe <td></td><td></td><td>Duran</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>p5318-25mg</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-C2LACT>plasmide </subplasmide</td><td></td><td></td><td>Disponible sur demande auprès de notre laboratoire</td></tr><tr><td>Plasmide</td><td></td><td></td> pGEX-PHFAPP <td>Disponible sur demande auprès de notre laboratoire</td></tr><tr><td>Fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) &ge ; 98,5 % (GC)</td><td>Sigma</td><td>P7626-25g</td><td>Préparer une solution mère de 200 mM de PMSF dans de l’isopropanol</td></tr><tr><td>Phosphoramidon</td><td>Sigma</td><td>R7385-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Filtres en polycarbonate (19 mm de diamètre) avec une taille de pores de 0,2 & micro ; m</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>Colonne de chromatographie Poly-Prep (avec un volume de lit de 0 à 2 ml et un réservoir de 10 ml)</td><td>Biorad</td><td>7311550</td><td></td></tr><tr><td>Préfiltres (10 mm de diamètre).</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610014</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>http://pymol.org/</td><td></td> <td>Construction des modèles 3D des protéines (Figure 1A)</td></tr><tr><td>Cuvette en quartz pour la fluorescence UV/visible (volume minimum de 600 &micro ; L)</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes en quartz</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée&nbsp ; Eppendorf 5427R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Évaporateur rotatif</td><td>Buchi</td><td>B-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubes microcentriques à bouchon à vis (1,5 mL)</td><td>Sarsted</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petite barre d’agitation magnétique PFTE (5 &times ; 2 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes microcentriques à pression (0,5, 1 et 2 mL)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYPRO orange</td><td></td><td></td><td>coloration fluorescente pour détecter les protéines dans le gel SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Thermomixeur</td><td>Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>THROMBIN, À PARTIR DE PLASMA HUMAIN</td><td>Sigma</td><td>10602400001</td><td>Dissoudre 20 unités dans 1 mL d’eau milli-Q et préparer 25 &micro ; L aliquotes dans des tubes Eppendorf de 0,5 ml. Ensuite, congelez et conservez à -80 °C.</td></tr><tr><td>Tris, ultra pure</td><td>MP</td><td>819623</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse L90K</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre d’absorbance UV/visible</td><td>SAFAS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrofluorimètre UV/visible avec support de cellule à température contrôlée et dispositif d’agitation</td><td>Jasco ou Shimadzu</td><td>Jasco FP-8300 ou Shimadzu RF-5301PC</td><td></td></tr><tr><td>Chambre à</td><td></td><td></td> <td>vide</td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>Julabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XK 16/70 colonne rempli de Sephacryl S200HR</td><td>GE healthcare</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mesures basées sur la fluorescence de l’échange phosphatidylsérine/phosphatidylinositol 4-phosphate entre les membranes

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Plusieurs membres de la famille des protéines liées à la protéine de liaison à l’oxystérol (OSBP) conservées de manière évolutionnaire (ORP) / homologues OSBP (Osh) ont récemment été trouvés pour représenter un nouveau groupe de protéines de transfert lipidique (LTP) dans les levures et les cellules humaines. Ils transfèrent la phosphatidylsérine (PS) du réticulum endoplasmique (RE) à la membrane plasmique (PM) via les cycles d’échange PS/phosphatidylinositol 4-phosphate (PI(4)P). Cette découverte permet de mieux comprendre comment la PS, qui est essentielle pour les processus de signalisation, est distribuée dans toute la cellule et d’enquêter sur le lien entre ce processus et le métabolisme du phosphoinositide (PIP). Le développement de nouveaux protocoles basés sur la fluorescence a joué un rôle déterminant dans la découverte et la caractérisation de ce nouveau mécanisme cellulaire in vitro au niveau moléculaire. Cet article décrit la production et l’utilisation de deux capteurs lipidiques marqués par fluorescence, NBD-C2Lact et NBD-PHFAPP,pour mesurer la capacité d’une protéine à extraire PS ou PI(4)P et à transférer ces lipides entre membranes artificielles. Tout d’abord, le protocole décrit comment produire, étiqueter et obtenir des échantillons de haute pureté de ces deux constructions. Deuxièmement, cet article explique comment utiliser ces capteurs avec un lecteur de microplaques de fluorescence pour déterminer si une protéine peut extraire PS ou PI(4)P des liposomes, en utilisant Osh6p comme étude de cas. Enfin, ce protocole montre comment mesurer avec précision la cinétique de l’échange PS/PI(4)P entre liposomes de composition lipidique définie et déterminer les taux de transfert lipidique par transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) à l’aide d’un fluoromètre standard.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62177/62177fig01.jpg"> Figure 1: Description des capteurs lipidiques fluorescents et des essais in vitro. (A) Modèles tridimensionnels de NBD-C2Lact et NBD-PHFAPP basés sur la structure cristalline du domaine C2 de la lactadhérine bovine (ID PDB: 3BN648) et la structure RMN du domaine PH de la protéine FAPP1 h...

Ici, nous décrivons des protocoles utilisant des capteurs lipidiques fluorescents et des liposomes pour déterminer si une protéine extrait et transporte de la phosphatidylsérine ou du phosphatidylinositol 4-phosphate in vitro.

Mesures basées sur la fluorescence de l’échange phosphatidylsérine/phosphatidylinositol 4-phosphate entre les membranes

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Cette méthode utilise la fluorescence pour déterminer si un transfert de protéine vers des liqidés biologiquement importants entre la membrane synthétique et contribue ainsi à la distribution de ces lipides à l’intérieur des cellules eucaryotes. Cette technique permet l’extraction et le transport d’un lipide naturel par une protéine, elle nécessite et des cellules de fluorescence et des liposomes qui sont faciles à fabriquer. Cette méthode peut être utilisée et modifiée pour obtenir un aperçu de la biologie cellulaire par les protéines derrière la distribution de certains lipides essentiels entre les organes et les membranes.La démonstration visuelle est essentielle pour expliquer comment effectuer des mesures en temps réel du transfert lipidique par fluorescence. Maud Magdeleine, ingénieure pour mon laboratoire, fera également la démonstration de la procédure. Commencez par préparer un tampon d’acétate de potassium HEPES frais filtré et dégivré, complété par un chlorure de magnésium millimolaire pour former un tampon HKM.Ensuite, préparez des liposomes uniquement en PC ou dopés en plus avec deux pour cent molaires PS ou PI(4)P. Maintenant, placez la fiole sur un évaporateur rotatif pour sécher le lipide sous vide. Dans un puits, mélanger des liposomes contenant deux pour cent molaires de PS avec un capteur lipidique, NBD-C2 Lact, à une concentration finale de 250 nanomolaires et un volume de 100 microlitres.Remplissez un deuxième puits avec la même quantité de liposome et de lact NBD-C2 mélangé à trois protéines de transfert lipidiques micromolaires ou LTP. Remplissez un troisième puits avec 250 lactes nanomolaires NBD-C2 mélangées à des liposomes PC purs de 80 micromolaires et un quatrième puits avec des liposomes PC purs de 80 micromolaires. Répétez ces étapes pour préparer trois séries supplémentaires de quatre puits.Placez ensuite la plaque multi-puits dans le lecteur de fluorescence. Pour chaque puits, enregistrez un spectre NBD de 505 à 650 nanomètres avec une bande passante de cinq nanomètres lors de l’excitation à 490 nanomètres à 25 degrés Celsius. Pour chaque série, soustrayez le spectre enregistré avec seulement des liposomes des autres spectres.Pour le test d’extraction PI(4)P, préparez des liposomes dopés à deux pour cent molaires de phosphatidylinositol-4-phosphate et effectuez des mesures avec la sonde NBD-PH FAPP. Effectuez des expériences de contrôle et déterminez le pourcentage d’extraction. Après avoir fini d’extruder des liposomes, remplissez un tube avec ces liposomes extrudés.Préparez un tampon HKM fraîchement dégazé et filtré et maintenez les tubes contenant des liposomes extrudés à température ambiante. Enveloppez les tubes contenant des liposomes avec de la phosphatidyléthanolamine étiquetée rhodamine dans du papier d’aluminium et stockez-les dans une boîte opaque pour éviter tout blanchiment photo. Réglez la température entre 25 et 37 degrés Celsius et ajustez les monochromemètres d’excitation à 460 nanomètres avec une bande passante courte de un à trois nanomètres et l’émission à 530 nanomètres avec une large bande passante supérieure à 10 nanomètres.Réglez le temps d’acquisition sur vingt-cinq minutes avec une résolution temporelle d’au plus une seconde. Dans la cuvette de quartz, diluez 30 microlitres de la suspension de liposomes LA et de la solution mère de lact NBD-C2 et du tampon HKM pré-chaudr pour préparer un échantillon de 570 microlitres contenant 200 lipides totaux micromolaires et 250 lacts nanomolaires ou NBD-C2. Ajouter une petite barre d’agitation magnétique et positionner la cuvette dans le support du fluoromètre.Une fois que l’échantillon est équilibré thermiquement, déclenchez la mesure. Après une minute, ajoutez 30 microlitres de la suspension de liposome LB à l’échantillon. Après trois minutes, injectez du LTP dans l’échantillon de sorte que la concentration finale du LTP soit de 200 nanomolaires, puis acquérez le signal pendant les 21 minutes restantes.Effectuer une expérience parallèle pour normaliser le signal NBD. Mélanger 30 microlitres de suspension de liposomes d’équilibre LA avec 250 lacts nanomolaires NBD-C2 dans un tampon HKM à un volume final de 570 microlitres. Après une minute, injecter 30 microlitres de suspension de liposomes d’équilibre LB.Convertir les courbes cinétiques mesurées avec un LTP d’intérêt pour déterminer la quantité de PS transférée de LA en liposomes LB au fil du temps. Normalisez ensuite chaque point de données de la courbe. Effectuez l’expérience PI(4)P en utilisant les mêmes paramètres et conditions d’émetteur au sol que pour le test de transfert PS.Dans la cuvette, mélanger 30 microlitres de suspension de liposome lb et de sonde NBD-PH FAPP avec un tampon HKM préchauffé pour obtenir un volume final de 570 microlitres. Une fois l’équilibre thermique de l’échantillon atteint, commencez la mesure. Après une minute, injecter 30 microlitres de suspension de liposome LA.Après trois minutes, injectez le LTP d’intérêt et enregistrez le signal. Effectuez une deuxième expérience pour normaliser le signal NBD. Mélanger 30 microlitres de suspension de liposomes d’équilibre lb avec 250 nanomolaires NBD-PH FAPP et 570 microlitres de tampon HKM.Après une minute, injecter 30 microlitres de suspension de liposomes d’équilibre LA. Convertissez les courbes cinétiques pour déterminer la quantité de PI(4)P transférée des liposomes LB aux liposomes LA au fil du temps, puis normalisez chaque point de données. Quantifier la mesure dans laquelle un LTP est efficace.Effectuer une régression linéaire des premiers points de données de la cinétique de transfert pour obtenir une pente. Divisez la valeur de pente par la concentration de LTP dans le mélange réactionnel pour déterminer le nombre de molécules lipidiques transférées par protéine et par unité de temps. La récupération efficace du lact C2 à partir des billes a été vérifiée avec l’analyse de la page SDS.Le spectre absorbant visible ultraviolet de lacte C2 marqué avec NBD a confirmé que toutes les molécules de lactE C2 étaient étiquetées avec un groupe NBD. La pureté du lact NBD-C2 et sa fluorescence ont été déterminées par l’analyse de la page SDS. La fluorescence du lact NBD-C2 ou du FAPP NBD-PH était maximale lorsque seuls des liposomes contenant du PS ou du PI(4)P étaient utilisés pour l’incubation, ce qui indique que le capteur était lié à la membrane.Une faible fluorescence a été observée lorsque Osh6p était également présent, indiquant que cette protéine extrayait efficacement PS ou PI(4)P des liposomes. Les résultats d’un test de transfert PS utilisant Osh6p comme LTP sont affichés. Les courbes cinétiques moyennes du transfert de PS des liposomes LA aux liposomes LB, dopés ou non dopés au phosphatidylinositol-4-phosphate ont été calculés.Le taux de transport PS initial moyen a été déterminé à partir de trois expériences distinctes. De même, les résultats d’un test de transfert PI(4)P utilisant Osh6p comme LTP sont présentés ici. Avec les courbes cinétiques moyennes obtenues après normalisation du signal.Les taux de transfert moyens ont été mesurés avec des liposomes LA qui ont été dopés ou non dopés avec PS. Lors de l’exécution de ce protocole, utilisez un nouveau tampon et préparez les mêmes jours. Minimisez l’exposition à la lumière des liposomes et des protéines florescents, utilisez des protéines étiquetées NBD bien purifiées et conservez-les sur la glace. peut être confirmé en mesurant le transfert de PS et de PI(4)P entre les organites à l’intérieur de la cellule procaryote à l’aide de capteurs lipidiques fluorescents génétiquement codés.Cette technique ouvre la voie à une meilleure compréhension des PS et des PI(4) qui sont distribués au sein de la cellule, et leur activité subit la spécificité de plusieurs LTPS.

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