Création de chimères du cerveau antérieur aviaire pour évaluer le développement facial
18 février 2021
Cet article décrit une technique de transplantation de tissus conçue pour tester les propriétés de signalisation et de structuration du cerveau antérieur basal au cours du développement craniofacial.
Cette méthode permet aux chercheurs d’évaluer les interactions tissulaires entre le cerveau antérieur basal et le visage. Le principal avantage de cette technique est qu’elle isole le cerveau antérieur basal pour l’évaluation et empêche la contamination par les cellules de la crête neurale, ce qui confondrait l’analyse. La partie difficile de cette technique est l’ablation du cerveau antérieur de l’hôte et son remplacement par le tissu donneur.
Diane Hu, chercheuse scientifique du laboratoire du Dr Ralph Marcucio, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, préparez des supports DMEM avec du rouge neutre, une pipette de transfert en verre et du tungstène affûté. À l’aide d’une seringue de 10 millilitres et d’une aiguille de calibre 18, retirez 0,5 millilitre d’albumine de l’extrémité pointue de la coquille d’œuf.
Faites un petit trou sur le dessus de la coquille à l’aide de la pointe des ciseaux. Ensuite, placez un morceau de ruban adhésif sur le trou et coupez une ouverture circulaire pour exposer l’embryon. Colorer l’embryon avec du rouge neutre.
Prélever des greffes de tissus du côté gauche du cerveau antérieur basal des embryons de stade sept ou huit. Utilisez des aiguilles de tungstène aiguisées incurvées pour inciser doucement un morceau du cerveau antérieur. Afin de ne pas inclure l’endoderme sous-jacent, glissez l’aiguille sous le cerveau antérieur et parallèlement à l’axe du tube neural.
Prélevez le greffon de l’embryon donneur à l’aide de la pipette de transfert en verre et transférez-le dans du DMEM contenant du rouge neutre pendant deux minutes pour le colorer. Ensuite, placez le greffon coloré dans le DMEM qui ne contient pas de rouge neutre jusqu’à ce qu’il soit prêt pour la greffe. Incuber les œufs fécondés du poulet blanc Livourne à 37 degrés Celsius dans une chambre humidifiée jusqu’aux stades sept à huit de Hamburger-Hamilton.
Exposer les embryons comme démontré précédemment. À l’aide d’aiguilles de tungstène aiguisées, préparer le site du greffon en coupant puis en retirant un morceau de cerveau antérieur basal de 0,3 par 0,2 millimètre pour accueillir le greffon. Évitez une perturbation excessive de l’endoderme sous-jacent, qui sera évidente lorsque les granules vitellins commenceront à couler à travers toute déchirure qui est faite.
Après avoir transféré le greffon à l’hôte, positionner le greffon pour remplacer le cerveau antérieur basal extirpé de l’hôte. Placez du ruban adhésif hermétiquement sur le trou et remettez les embryons dans l’incubateur à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’analyse. Initialement, les chimères ont été créées en transplantant des tissus de caille dans des embryons de poussins.
À l’aide de l’anticorps QCPN, les cellules de caille ont été visualisées et distinguées des tissus hôtes. Le système caille-poussin a confirmé que toute la greffe était composée uniquement de tissu neural et n’était pas contaminée par d’autres types de cellules. La transplantation de tissus de caille en embryons de canard a conduit à des chimères gravement déformées en raison d’un cerveau de caille en développement plus rapide.
Par conséquent, la transplantation de tissus de canard dans des embryons de poulet a été effectuée. Les chimères canard-poussin qui en résultent suggèrent que le cerveau participe à la régulation de la morphologie. L’hybridation C2 de montagne entière a été utilisée pour évaluer l’expression du hérisson Sonic dans les chimères.
Semblable à la morphologie, l’expression du hérisson sonique du côté canard de la chimère ressemblait davantage à celle d’un canard. La préparation du site hôte demande de la pratique. Un grand nombre d’embryons ne survivent pas, de sorte que la création d’un grand nombre de chimères peut aider à garantir des échantillons appropriés pour l’analyse.
Cette méthode a permis d’évaluer comment les signaux du cerveau façonnent le domaine d’expression du hérisson Sonic dans la zone ectodermique frontonasale.
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Aperçu
Cet article décrit une technique de greffe de tissus qui permet aux chercheurs d'évaluer les interactions tissulaires entre le prosencéphale basal et le visage au cours du développement craniofacial. La méthode permet d'isoler le prosencéphale basal pour évaluation, en évitant toute contamination par des cellules de la crête neurale.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Développement craniofacial
- Techniques de transplantation de tissus
Contexte
- Le cerveau antérieur basal joue un rôle essentiel dans le développement craniofacial.
- La compréhension des interactions tissulaires est essentielle pour la biologie du développement.
- Une contamination par des cellules de la crête neurale peut fausser l'analyse.
- L'isolement du cerveau antérieur basal permet une évaluation plus claire de ses propriétés de signalisation.
Objectif de l'étude
- Tester les propriétés de signalisation et de mise en place du cerveau basal.
- Développer une méthode fiable pour la greffe de tissus.
- Approfondir la compréhension des mécanismes du développement craniofacial.
Méthodes utilisées
- Préparation du milieu DMEM avec du rouge neutre.
- Utilisation d'une pipette de transfert en verre et de tungstène aiguisé.
- Élimination de l'albumine à l'extrémité pointue de la coquille d'œuf à l'aide d'une seringue.
- Remplacement du prosencéphale hôte par le tissu donneur.
Résultats principaux
- La technique permet d'isoler efficacement le noyau basal pour analyse.
- Démonstration de la procédure par un chercheur scientifique.
- Évaluation réussie des interactions tissulaires sans contamination.
- Apercus sur le rôle du noyau basal dans le développement craniofacial.
Conclusions
- La technique de transplantation est un outil précieux pour l'étude du développement craniofacial.
- L'isolement du cerveau antérieur basal améliore la précision des évaluations du développement.
- Cette méthode peut être appliquée à des recherches supplémentaires en neurosciences du développement.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Cette méthode permet une évaluation précise des signaux tissulaires dans le développement cranio-facial en isolant le cerveau antérieur des contributions interférentes des cellules de la crête neurale. Elle facilite la détection mécanistique des risques lors de la validation des cibles en clarifiant la manière dont les signaux d'origine cérébrale régulent les voies morphogénétiques telles que Sonic hedgehog dans la zone ectodermique frontonasale. L'approche fournit un système pertinent pour les maladies permettant d'évaluer les voies du développement avec une confiance prédictive en phase précoce de découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroge les hypothèses thérapeutiques concernant les interactions entre le tissu cérébral et le tissu facial dans le développement des vertébrés.
- Valeur opérationnelle : Permet la validation fonctionnelle de cibles en isolant les propriétés de signalisation du prosencéphale basal.
- Valeur prédictive : Renforce la confiance prédictive en associant la manipulation du prosencéphale basal à des modifications des domaines d'expression de SHH.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes chimériques validés pour l'évaluation quantitative de l'expression des morphogènes.
- Valeur opérationnelle : Normalise la transplantation de tissus pour garantir des résultats d'analyse reproductibles dans différentes conditions expérimentales.
- Extensibilité : Permet la génération de plusieurs chimères afin de compenser les faibles taux de survie et assurer une robustesse analytique.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Relie les découvertes mécanistiques à un stade précoce aux modèles précliniques de mise en place craniofaciale.
- Réduction des risques mécanistiques : Précise les régulateurs en amont de la voie SHH, une voie clé dans la modélisation des troubles congénitaux.
- Système pertinent pour les maladies : Utilise des chimères aviaires pour étudier les mécanismes conservés du développement facial chez les vertébrés.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de la phase de découverte précoce, où les tests d'interaction tissulaire renseignent sur la confiance en la cible avant les efforts d'identification de composés leaders.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses concernant les centres de signalisation dans la morphogenèse craniofaciale.
- Préparation des tests : Génère des systèmes biologiques standardisés pour l'analyse quantitative de l'expression de SHH.
- Analytique : Permet l'hybridation in situ sur des échantillons entiers afin de mesurer les variations d'expression spatiale des gènes, un paramètre clé de lecture.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité mécanistique entre la greffe de tissus neuronaux et les résultats phénotypiques faciaux.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une plateforme réutilisable pour évaluer les contributions tissulaires spécifiques aux voies du développement.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en isolant les signaux du diencéphale basal dans le développement facial.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité grâce à des techniques standardisées de greffage et de préparation de l'hôte.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en précisant les régulateurs en amont des voies thérapeutiques ciblables comme SHH.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles, fondée sur des données validées d'interactions tissulaires.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en manipulation microchirurgicale des tissus et en manipulation d'embryons d'oiseaux.
- Dépend d'outils spécialisés, notamment des aiguilles en tungstène aiguisées et des pipettes en verre pour transfert.
- Exige des protocoles normalisés d'incubation et de staging pour les embryons donneurs et hôtes.
- Implique l'optimisation de la préparation du site de greffe afin d'éviter les fuites de jaune d'œuf et de garantir la viabilité de l'hôte.
- Limité par des taux de survie embryonnaire faibles, nécessitant un grand nombre d'échantillons pour une analyse fiable.
