Estimation des nanocristaux urinaires chez l’homme à l’aide de l’étiquetage des fluorophores de calcium et de l’analyse de suivi des nanoparticules

Ce protocole peut détecter spécifiquement les nanocristaux contenant du calcium dans l’urine humaine. Cette technique pourrait potentiellement être utile pour prévoir les parties de la formation de calcul rénal aussi bien que d’autres maladies liées à l’urée cristalline. La démonstration de la procédure sera Dr.Parveen Kumar, un chercheur IV dans mon laboratoire.

Demandez aux participants de consommer un régime pauvre en oxalate pendant trois jours et jeûne pendant la nuit. Prélevez ensuite un échantillon d’urine de 24 heures auprès des participants avant de leur faire consommer une charge d’oxalate. Nourrissez les participants avec un smoothie contenant des fruits et légumes ayant une charge d’oxalate d’environ huit millimoles.

Demandez aux participants de recueillir leur urine pendant 24 heures après la consommation d’oxalate et de la retourner le lendemain. Maintenir tous les échantillons d’urine à température ambiante avant le traitement. Mesurer et enregistrer le pH et le volume d’urine des échantillons d’urine.

Bien mélanger et ajouter 50 millilitres d’urine dans un tube conique stérile marqué de 50 millilitres. Centrifuger l’échantillon à 1 200 fois G pendant 10 minutes à température ambiante à l’aide d’une centrifugeuse de paillan. Jetez le surnageant, puis lavez et ressuscitez le culot avec cinq millilitres d’éthanol à 100%.

Centrifuger l’échantillon à 1 200 fois G pendant 10 minutes à température ambiante à l’aide d’une centrifugeuse de paillan. Jetez le surnageant et ressuscitez le culot dans un millilitre d’éthanol à 100%. Conservez l’échantillon à moins 20 degrés Celsius pour un traitement ultérieur ou procédez immédiatement à la coloration des échantillons.

Diluez les nanoparticules d’or de 100 nanomètres dans de l’eau ultrapure dans un rapport de 1:1 000 et utilisez-les pour optimiser les réglages de l’instrument. Diluer les échantillons d’urine 20 fois dans de l’eau avant de les colorer avec cinq fluo-4 am millimolaires pendant 30 minutes dans l’obscurité et analyser les échantillons à l’aide de NTA. Préparer les cristaux d’oxalate de calcium et de phosphate de calcium tel que décrit dans le manuscrit de texte avant l’analyse NTA.

Allumez l’ordinateur et l’instrument, puis ouvrez le logiciel et allumez l’appareil photo. Cliquez sur l’icône de capture dans le coin supérieur gauche de la fenêtre pour démarrer le mode de capture. Nettoyez la plate-forme en y pompant d’abord de l’air à l’aide d’une seringue d’un millilitre jusqu’à ce que la plate-forme semble propre.

Ajoutez doucement de l’eau à l’appareil deux à trois fois et utilisez une autre seringue d’un millilitre pour enlever les bulles d’air. Une fois que la plate-forme est propre, ajoutez de l’eau et vérifiez toute contamination à la surface en visualisant la caméra, puis ajoutez des nanoparticules d’or comme contrôle à l’injecteur de la pompe de chargement de l’échantillon pour configurer l’instrument. Réglez le niveau de la caméra sur l’écran ou sur le bouton sur le côté droit de l’instrument jusqu’à ce que l’image commence à afficher des pixels colorés, puis réduisez le niveau de la caméra.

Ensuite, ajustez l’écran pour optimiser l’image. Cliquez avec le bouton gauche de la souris sur l’image vidéo. Maintenez le bouton gauche de la souris et faites glisser l’image de haut en bas pour obtenir la vue entière.

Configurez la vitesse de perfusion et concentrez la caméra de sorte que les nanoparticules d’or soient visibles sur l’écran de la caméra. Réglez la vitesse de perfusion à élevée pour la configuration initiale afin de vous assurer que les nanoparticules d’or sont détectées. Une fois détecté, réduisez la vitesse à 50 microlitres par minute pour visualiser les nanoparticules d’or.

Ajustez le niveau de la caméra pour visualiser les particules. Pour les échantillons non colorés, ajustez le gain d’écran au niveau cinq pour atteindre la mise au point de la caméra et réglez le niveau de la caméra à huit. Une fois le focus défini, enregistrez l’exemple.

Après optimisation, nettoyez à nouveau l’appareil avec de l’eau avant d’évaluer d’autres échantillons pour vous assurer que le tube est propre et que les particules ne sont pas présentes. Pour analyser les échantillons colorés, ajustez la caméra à la position du filtre contenant le filtre fluorescent approprié et chargez les échantillons dilués et colorés sur l’injecteur de la pompe de chargement des échantillons, réduisant ainsi la vitesse à 20 microlitres par minute pour l’analyse. Réglez le gain d’écran à cinq et le niveau de la caméra à 13.

Enregistrez les données après chaque mesure. Calculer le nombre moyen de nanoparticules pour les cinq lectures pour chaque échantillon individuel et analyser les données à l’aide de l’écart-type ou de l’erreur-type de la moyenne. Utilisez des tests T pour l’analyse appariée.

Fluo-4 AM a pu se lier à la fois aux cristaux d’oxalate de calcium, qui avaient entre 50 et 270 nanomètres et avaient une concentration moyenne de 1 260 millions de particules par millilitre, et aux cristaux de phosphate de calcium, qui étaient entre 30 et 225 nanomètres et avaient une concentration moyenne de 2 220 millions de particules par millilitre. Des échantillons d’urine prélevés sur 24 heures avant la charge d’oxalate contenaient des nanocristaux urinaires d’une taille comprise entre 110 et 300 nanomètres. En revanche, il y avait une augmentation significative des nanocristaux urinaires présents dans les échantillons post-oxalate.

Pour confirmer la reproductibilité de la méthode, les échantillons ont été mesurés trois fois et il n’y avait pas de variation significative dans les répétitions techniques. Lors de la tentative de ce protocole, il peut y avoir une certaine difficulté avec l’ajout d’échantillons sans bulles à la machine. Pour éviter cela, ajoutez de l’air et de l’eau à la machine, puis ajoutez lentement des échantillons.

Assurez-vous également de surveiller continuellement vos échantillons et qu’il n’y a pas de bulles présentes. Cette nouvelle méthode sera testée chez les personnes atteintes de la maladie des calculs rénaux d’oxalate de calcium afin de surveiller la progression de la maladie et/ou de prédire le risque de calculs rénaux.