Caractérisation fonctionnelle des variantes de RYR1 humaines exprimées de manière endogène

Ce protocole est important parce qu’il utilise du matériel patient. Si le patient est atteint de la maladie, l’utilisation de ses cellules devrait refléter plus précisément la réponse biologique du patient. Cette technique est simple à réaliser, directe et ne nécessite pas d’équipement sophistiqué.

Ces méthodes peuvent être utilisées pour le diagnostic, par exemple, pour prouver qu’une mutation RYR1 modifie fonctionnellement l’homéostasie du calcium, ainsi que pour tester la fonction thérapeutique potentielle d’un composé. En fonction des connaissances et des compétences techniques de chaque chercheur, des expériences de test doivent être effectuées avant que des échantillons de patients réels ne soient utilisés. Pour surveiller les changements dans la concentration intracellulaire de calcium des lymphocytes B transformés par EBV, resuspendez les cellules B immortalisées à une concentration d’une fois 10 à septième cellules par millilitre dans la solution de Krebs Ringer et Fura-2 AM à une concentration finale de cinq micromolaires pour une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius.

À la fin de l’incubation, prélever les cellules par centrifugation et remettre la pastille dans la solution fraîche de Krebs Ringer à une concentration de deux fois 10 à six cellules par millilitre. Juste avant de commencer l’expérience, centrifugez à nouveau les cellules et remettez rapidement en suspension les cellules dans 1,5 millilitre de solution de Krebs Ringer complétée par de l’EGTA de 0,5 millimolaire mais sans calcium ajouté. Transférez les cellules dans une cuvette de spectrofluoromètre en verre de trois millilitres et enregistrez le rapport de fluorescence sur un spectrofluoromètre équipé d’un agitateur magnétique réglé à la vitesse maximale et à 37 degrés Celsius pendant environ 30 secondes.

Pour évaluer la réponse à la libération de calcium dans les cellules individuelles, plaquer une fois 106 cellules chargées de Fura-2 AM dans un millilitre de la solution de Krebs Ringer complétée par un millimolaire de chlorure de calcium sur des feuilles de verre revêtues de poly-L-lysine et incuber les feuilles de couverture à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture cellulaire humidifié pendant 30 minutes. Lorsque les cellules se sont attachées, placez un couvercle dans une chambre de perfusion et commencez à infuser les cellules à un débit de deux millilitres de solution de Krebs Ringer complété par un débit d’un millimolaire de calcium par minute. À l’aide d’un microscope fluorescent inversé équipé d’un objectif d’immersion dans l’huile 40 fois supérieur et des filtres appropriés, enregistrez des mesures en ligne avec une fixation de caméra contrôlée par logiciel et couplée à une charge à intervalles d’une seconde, à un temps d’exposition fixe.

Pour obtenir une stimulation cellulaire, utilisez un stimulateur de perfusion cellulaire avec 12 valves pour ajouter les différentes concentrations d’agoniste. Pour isoler les myotubes des biopsies musculaires humaines, rincez d’abord la biopsie avec du PBS stérile pour éliminer tout excès de sang avant de hacher le tissu en petits fragments de 0,5 à un millimètre. Placez deux à trois fragments dans des inserts individuels dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de six puits contenant 1,5 millilitre de milieu de croissance musculaire humaine par puits et 500 microlitres de milieu par insert, et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire.

Pour mesurer les changements dans l’expression du calcium dans les myotubes humains, lorsque des myotubes multinucléés peuvent être observés, remplacez les surnageants de culture de myotubes par un milieu de différenciation frais complété par 10 microlitres de Fura-2 AM millimolaires pour une incubation de 30 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire. À la fin de l’incubation, transférer une culture glissante de couvercle de verre dans la chambre de perfusion et rincer les cellules avec la solution de Krebs Ringer complétée par du chlorure de calcium de deux millimolaires. Effectuez ensuite des mesures de calcium en ligne comme démontré à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’eau 20 fois supérieur.

Dans cette analyse représentative, une augmentation rapide du calcium a été observée dans les lymphocytes B immortalisés par l’EBV après l’ajout d’agonistes qui ont lentement diminué pour revenir aux niveaux de repos au fil du temps. Dans une expérience similaire, l’ajout de thapsigargin de 400 nanomolaires a provoqué un grand transitoire de calcium qui a atteint une valeur de fluorescence maximale de 2,4 unités arbitraires. Cette valeur de fluorescence a été considérée comme étant de 100 % lorsque la courbe dose-réponse correspondante a été construite.

Dans cette analyse, les cellules B immortalisées ont été stimulées avec de la caféine de cinq millimolaires pendant 20 secondes, ce qui a entraîné une augmentation immédiate du rapport de fluorescence de 340 et 380 nanomètres. Pour chaque concentration de caféine testée, le pic induit par la caféine au rapport de 340 par 380 nanomètres de fluorescence a été calculé et utilisé pour construire une courbe dose-réponse. La libération de calcium par les myotubes différenciés peut également être évaluée en réponse au rinçage avec du chlorure de potassium, différentes concentrations d’agonistes et / ou de caféine, et des courbes dose-réponse normales peuvent être générées.

Il est important de s’assurer que les cellules sont chargées correctement avec Fura-2 et que les longueurs d’onde de 340 et 380 nanomètres répondent à l’ajout de l’agoniste. Les mesures intracellulaires du calcium avec des indicateurs de calcium fluorescents peuvent être étudiées dans la plupart des cellules de mammifères et peuvent être appliquées à l’étude des changements calciques intracellulaires en réponse à différents stimuli.