Transition endothéliale à mésenchymateuse médiée par TGF-β (EndMT) et évaluation fonctionnelle des effecteurs EndMT à l’aide de l’édition du gène CRISPR/Cas9

La transition endothéliale à mésenchymateuse est un processus cellulaire dans lequel les cellules endothéliales changent leur morphologie pavée en un phénotype fibroblaste-comme. Et la cytokine TGF-bêta, transformant le facteur de croissance bêta, est un moteur principal de cette transition. L’analyse des changements de la morphologie cellulaire et des niveaux d’expression des marqueurs endothéliaux et mesenchymal nous permet d’évaluer l’occurrence de l’endothélial à la transition mesenchymal.

Les données émergentes lient le processus de transition endothéliale à mésenchymateuse à diverses maladies, y compris le cancer, les maladies cardiovasculaires et la fibrose. Et les données suggèrent que l’intervention peut être d’un avantage thérapeutique. En stimulant l’endothélial au processus mesenchymal de transition, qui se produit pendant l’embryogenèse et le développement d’organe, nous pouvons probablement être en mesure de régénérer les tissus mésenchymal-dérivés tels que le cartilage, l’os, et le muscle.

Pour détecter la protéine intracellulaire par coloration par immunoflourescence, la perméabilisation cellulaire à l’aide de 0,1% de Triton X-100 est nécessaire pour permettre aux anticorps de traverser les membranes cellulaires. Avec cette démonstration vidéo, les chercheurs auront une bonne compréhension de la façon d’étudier le rôle des cytokines telles que TGF-bêta dans la transition endothéliale à mésenchymateuse. Tout d’abord, la graine 1 x 10^ 5 reflétant les cellules MS1 endothéliales des îlots pancréatiques dans le DMEM complété par 10% FBS et 100 unités par millilitre de pénicilline et de streptomycine sur une plaque de culture enrobée de gélatine à 0,1%.

Après une incubation nocturne dans l’incubateur de culture cellulaire, lavez les cellules avec du PBS avant de les traiter avec deux millilitres de 0,25% de trypsine, 0,02% de solution d’EDTA pendant deux minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules ont commencé à se détacher, trempez la réaction avec cinq millilitres de milieu de culture complet et transférez la suspension cellulaire résultante dans un tube de 15 millilitres pour la centrifugation. Ressusciter le culot dans quatre millilitres de milieu complet frais pour le comptage.

Et ensemencez 1 X 10^3 cellules par centimètre cube dans un nouveau récipient de culture cellulaire. Après la culture d’une nuit, traiter deux puits avec cinq inhibiteurs micromolaires de kinase de récepteur TGF-bêta SB-431542 et deux puits avec le contrôle de solvant de DMSO. Et placez les cellules dans un incubateur de culture cellulaire pendant 30 minutes.

À la fin de l’incubation, traiter deux puits avec contrôle du véhicule et deux puits avec TGF-bêta 2. Après trois jours, utilisez un microscope inversé pour examiner la morphologie cellulaire de chaque groupe de traitement cellulaire sous imagerie brightfield. Pour évaluer les changements de marqueur endMT-connexes par la souillure immunofluorescente, détachez les cellules d’une culture appropriée de cellules MS1, comme démontré.

Et ensemencez les cellules à une concentration de cellules de 1,9 X 10 ^ 3 sur des verres de couverture ronds de 12 millimètres enduits de gélatine à 0,1% placés dans des puits individuels d’une plaque de 24 puits. Après une culture de nuit, traiter les cellules avec un nanogramme millilitre de TGF-bêta 2 pendant trois jours. À la fin de l’incubation, laver les cellules avec du PBS et fixer les cultures traitées avec 300 microlitres de formaldéhyde à 4% par puits pendant 10 minutes à température ambiante.

A la fin de la fixation, laver les cellules trois fois avec du PBS avant de les perméabiliser avec 300 microlitres de Triton X-100 à 0,1% et du PBS par puits pendant 10 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, lavez les cellules trois fois dans du PBS et bloquez les cellules avec 3% de BSA dans du PBS. Après 45 minutes à température ambiante, étiquetez les cellules avec des anticorps primaires PECAM-1 et SM22-alpha pendant 45 minutes à température ambiante, suivies de trois lavages dans pbs.

Après le dernier lavage, incuber les cellules avec les anticorps secondaires appropriés pendant 45 minutes à température ambiante, et laver les cellules trois fois avec pbs avant de monter les cellules avec un milieu de montage DAPI-complété et un glissement de couvercle. Scellez ensuite les bords du slip de couverture avec du vernis à ongles clair et imagez l’expression du marqueur cellulaire par microscopie confocale à fluorescence en utilisant les filtres appropriés selon les protocoles d’imagerie standard. Après trois jours de traitement avec TGF-bêta 2, les cellules MS1 endothéliales perdent leur structure pavée et se différencient en cellules de type mésenchymateux en forme de fuseau.

Cette différenciation induite par TGF-bêta 2 est supprimée lorsque les cellules sont exposées à l’inhibiteur SB-431542 du récepteur TGF-bêta kinase. L’expression de la protéine endothéliale PECAM-1 est robustement diminuée après stimulation de TGF-bêta 2 tandis que l’alpha mésenchymal sm-22 de facteur est profondément upregulated. En outre, Snail est nettement régulé à la hausse par l’exposition au TGF-bêta 2 tandis que l’expression de slug n’est pas affectée.

Comme observé, l’édition du gène CRISPR-Cas9 peut être utilisée pour faciliter l’introduction de deux ARN à guide unique d’escargot indépendants dans les cellules MS1 exprimant Cas9 afin de perturber l’expression de l’escargot. L’élimination de l’escargot est suffisante pour inhiber la morphologie fibroblastique-comme de cellules entraînée par TGF-bêta 2 en cellules MS1 et pour bloquer le déclin PECAM-1 médié par TGF-bêta 2 et l’amélioration alpha SM-22. L’évaluation des changements dans la morphologie cellulaire et l’expression des marqueurs endothéliaux et mésenchymateux par immunofluorescence peut être encore validée en mesurant l’expression de ces marqueurs sur l’ACP quantitative dans l’analyse western blot.

Cette technique de détection de la transition endothéliale à mésenchymateuse a permis aux chercheurs d’étudier cette signification émergente en tant que processus physiologique qui se produit dans de multiples maladies.