Analyse de la synthèse lipidique neutre chez Saccharomyces cerevisiae par marquage métabolique et chromatographie sur couche mince

Cette technique utilise des instruments couramment trouvés dans la plupart des environnements de laboratoire et permet l’analyse de plusieurs échantillons simultanément. Cette méthode peut fournir des informations clés sur la façon dont les enzymes du métabolisme des lipides sont régulées dans un contexte cellulaire et dans différents contextes génétiques. Inoculer une colonie d’une plaque de culture de levure dans 20 millilitres de milieux SC contenant 2% de dextrose et incuber à 30 degrés Celsius pendant la nuit en agitant à 200 tr / min.

Le lendemain, diluer la culture dans 50 millilitres de milieux frais jusqu’à une DO finale de 0,2 et la faire croître pendant 24 heures jusqu’à ce que la phase stationnaire soit atteinte. Préparez deux aliquotes de 20 millilitres de tampon de trempe pour chaque échantillon et conservez-les à moins 80 degrés Celsius. Simultanément, préparez des milieux de radiomarquage en ajoutant du sel de sodium d’acide acétique aux milieux SC sans dextrose à une concentration finale de 10 microcuries par millilitre.

Prélever les cellules en centrifugant à 4 100 x g pendant 10 minutes. Retirez le surnageant et lavez la pastille de cellule une fois avec 20 millilitres de milieu SC sans dextrose. Prélever à nouveau les cellules en les centrifugant à 4 100 x g pendant cinq minutes et les transférer dans un tube de microcentrifugation marqué de deux millilitres à l’aide d’un milieu libre dextre.

Centrifugez les cellules pendant encore deux minutes. Remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de milieux SC sans dextrose et commencez la période de radiomarquage en ajoutant rapidement 500 microlitres de milieux de radiomarquage à chaque suspension cellulaire. Incuber les tubes dans un incubateur rotatif à 30 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Pendant ce temps, pré-refroidir la centrifugeuse équipée de tubes coniques de 50 millilitres à moins 10 degrés Celsius et décongeler une aliquote de 20 millilitres de tampon de trempe. Une fois la période de radiomarquage terminée, utilisez une pipette pour plonger l’échantillon entier d’un millilitre dans un tampon de trempe décongelé sur de la glace. Recueillir la pastille de la cellule en la faisant tourner dans une centrifugeuse pré-refroidie à 5 000 x g pendant trois minutes et ajouter 20 millilitres de tampon de trempe à froid frais.

Vortex et secouez les échantillons pour les remettre complètement en service dans un tampon de trempe et centrifugez à nouveau les échantillons pour prélever les cellules. Une fois les cellules granulées, retirez soigneusement tout le tampon de trempe des échantillons en versant le surnageant et en enlevant l’excès avec une pipette. Conservez les tubes à moins 80 degrés Celsius pour un traitement ultérieur.

Peser 0,3 gramme de billes de verre lavées à l’acide pour chaque échantillon et les stocker dans deux tubes de microcentrifugation millilitres sur de la glace. Retirez les granulés de cellules du congélateur à moins 80 degrés et placez-les sur de la glace. Ensuite, ajoutez 350 microlitres de méthanol et 700 microlitres de chloroforme à chaque échantillon et ressuspendez les cellules.

Transférez-les dans des tubes de microcentrifugation contenant des billes de verre pré-pesées. Lyser les cellules en tourbillonnant trois fois pendant une minute, avec une incubation de 30 secondes sur de la glace entre les agitations. Versez les cellules dans un tube de centrifugeuse en verre de 15 millilitres et étiquetez le tube comme tube A.Lavez le tube de microcentrifugation avec un millilitre de méthanol, vortexez-le et versez le méthanol dans le tube A.Ajoutez deux millilitres de chloroforme suivis de 400 microlitres d’eau dans le tube A pour un volume d’échantillon final de 4,45 millilitres.

Vortex les échantillons pendant une minute suivie d’une centrifugation de cinq minutes à 1000 x g pour séparer clairement les phases aqueuse et organique avec les débris cellulaires se trouvant à l’interface. À l’aide d’une pipette de pâturage en verre, recueillir la phase organique dans un nouveau tube de centrifugeuse en verre étiqueté B et ajouter un millilitre d’un chlorure de potassium molaire. Ajouter un millilitre de méthanol et deux millilitres de chloroforme au tube A et répéter les étapes de vortex et de centrifugation.

Vortex et tube centrifuge B pour séparer la phase aqueuse et la phase organique. Retirez la couche aqueuse supérieure et rassemblez toute la couche organique inférieure dans un flacon en verre de quatre millilitres. Évaporer complètement le solvant des extraits lipidiques en séchant sous gaz inerte et préchauffer un four à 145 degrés Celsius pour chauffer la plaque TLC.

Déterminer les quantités relatives de radiomarque prises par les cellules avant de les charger sur la plaque TLC. Reconstituer les lipides de l’échantillon dans 40 à 50 microlitres de chloroforme et de méthanol mélangés à un rapport de un pour un en vortexant pendant cinq minutes. Préparer 101 millilitres du solvant de phase mobile dans un cylindre gradué en verre.

Ensuite, versez le solvant dans une chambre TLC en verre contenant un tampon de saturation TLC de 20 par 20 et un couvercle hermétique. Préparez une plaque canalisée de gel de silice 60G de 20 par 20 et marquez une ligne à 1,5 centimètre au-dessus du fond de la plaque à l’aide d’un crayon. Une fois que la plaque a été suffisamment chauffée et que le tampon de saturation TLC est saturé de solvant, retirez la plaque TLC du four et procédez immédiatement au chargement.

À l’aide d’une pipette, repérez cinq microlitres d’échantillon sur l’origine de chaque voie située à 1,5 centimètre au-dessus du fond de la plaque TLC et répétez le chargement jusqu’à ce que 20 à 40 microlitres d’échantillon entraitré dans chaque voie. Une fois l’étalon et les échantillons chargés, placez la plaque dans la chambre de développement et attendez que le solvant ait atteint le sommet de la plaque. Lorsque la plaque est complètement développée, retirez-la de la chambre et laissez-la sécher dans la hotte pendant 20 minutes.

Une fois la plaque séchée, recouvrez-la d’un film plastique et placez-la dans une cassette en développement avec un écran d’autoradiographie. Retirez l’écran de la cassette en développement et placez-le à l’intérieur d’un imageur au phosphore. Vaporisez la plaque TLC avec un réactif p-anisaldéhyde jusqu’à ce que la silice soit saturée, puis faites-la cuire dans un four à 145 degrés pendant cinq minutes ou jusqu’à ce que des bandes soient apparues.

Pour quantifier les espèces lipidiques, grattez le gel de silice contenant des espèces lipidiques individuelles et transférez-les dans des flacons de scintillation en verre. Ajouter six millilitres de liquide de scintillation et vortex vigoureusement jusqu’à ce que la bande de silice ait été réduite en petits morceaux. Placez la grille avec les flacons de scintillation dans un compteur de scintillation et comptez en ajustant le temps de comptage à deux minutes par flacon.

L’imagerie au phosphore permet de visualiser l’autoradiogramme de l’acide gras sans étiquette, du triacylglycérol, du diacylglycérol, du cholestérol et du squalane. Il a été démontré que les espèces lipidiques purifiées peuvent être séparées dans cette méthode et ensuite visualisées par pulvérisation de la plaque TLC avec un réactif p-anisaldéhyde. Les espèces visualisées comprennent tous les lipides mentionnés précédemment en plus des esters stériles.

En appliquant une période de poursuite de 10 minutes dans des milieux sans radiomarque après le pouls, on a observé au niveau du principal bassin de squalane disparaître et le cholestérol total était élevé. De même, l’apparition du diacylglycérol dans la période de poursuite était corrélée à une diminution du signal des acides gras libres. Avant d’effectuer le protocole complet, il est important de déterminer si les cellules absorberont le radiomarque de l’acide acétique dans l’état de croissance et le fond génétique d’intérêt.