Name: Analyse de la synthèse lipidique neutre chez Saccharomyces cerevisiae par marquage métabolique et chromatographie sur couche mince (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Découvrez une méthode de marquage métabolique et de chromatographie sur couche mince pour quantifier la synthèse des lipides neutres chez Saccharomyces cerevisiae. Ce protocole permet d'analyser le métabolisme lipidique dans différents contextes génétiques.

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Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire Henne pour leur aide et leurs conseils conceptuels dans la réalisation de cette étude. W.M.H. est soutenu par des fonds de la Welch Foundation (I-1873), du NIH NIGMS (GM119768), du Ara Paresghian Medical Research Fund et du UT Southwestern Endowed Scholars Program. S.R a été soutenu par une subvention du programme T32 (5T32GM008297).

1. Croissance et étiquetage des cellules de levure avec de l’acide 14C-acétique
<ol><li>Inoculer une culture de levure en cueillant une colonie dans une assiette et en la distribuant dans 20 mL de milieux synthétiques complets (SC) contenant 2 % de dextrose (voir dossier supplémentaire pour la recette des milieux SC). Incuber à 30 °C pendant la nuit en agitant à 200 tr/min. REMARQUE: L’état de croissance, le volume de l’échantillon et le traitement diffèrent en fonction du ou des lipides d’intérêt. Avant de mener des expériences complètes, les conditions de croissance optimales et les volumes de culture doivent être déterminés empiriquement. Ce protocole traite du radiomarquage des cultures de levures cultivées jusqu’à la phase stationnaire, une phase de croissance lorsque la croissance de la biomembranaire et des cellules ralentit et que la synthèse NL est très active.</li>
	<li>Mesurer la DO600 de la culture de nuit à l’aide d’un spectrophotomètre et diluer la culture cellulaire de levure à une OD600 finale de 0,2 dans 50 mL de milieux SC frais contenant 2 % de dextrose. Cultivez les cellules pendant 24 heures, ou jusqu’à ce qu’elles aient atteint la phase stationnaire (qui est généralement définie par une doublure plate de la cellule doublant la mesure OD600).</li>
	<li>Avant de collecter les cellules, créez le tampon de trempe (voir Fichier supplémentaire pour plus de détails). Faire deux aliquotes de 20 mL de tampon de trempe pour chaque échantillon (c.-à-d. 40 mL de tampon de trempe pour chaque échantillon) et diviser uniformément en deux tubes coniques de 50 mL). Conservez les aliquotes du tampon de trempe à -80 °C pour une utilisation ultérieure.</li>
	<li>Une fois que les cultures ont atteint la DO ou la phase de croissance souhaitée, prélever les cellules par centrifugation à 4 100 x g pendant 10 min. Pendant que les échantillons sont dans la centrifugeuse, préparer les milieux de radiomarquage en ajoutant[1-14C] du sel de sodium de l’acide acétique aux milieux SC sans dextrose à une concentration finale de 10 μCi/mL. ATTENTION : Un équipement de protection individuelle (EPI) approprié doit être porté en tout temps lorsque vous travaillez avec des matières radioactives. Suivez toujours les directives locales pour le stockage, l’utilisation et l’élimination appropriés des matières radioactives. REMARQUE : La concentration d’acide 14C-acétique dans le milieu d’étiquetage et le temps d’incubation du radiomarquage doivent être ajustés en fonction du ou des métabolites d’intérêt. Ici, une incubation d’impulsions de radiomarquage de 20 minutes est utilisée, ce qui est suffisant pour étiqueter les espèces NL avec une gamme d’abondance.</li>
	<li>Retirez le surnageant des cellules granulées et lavez la pastille une fois avec 20 mL de milieu SC sans dextrose en remettant le granulé avec une pipette. Prélever à nouveau les cellules en centrifugant à 4 100 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Resuspendez les cellules dans 1 mL de milieu SC sans dextrose et transférez les cellules dans un tube de microcentrifugation marqué de 2 mL. Prélever à nouveau les cellules en centrifugant à 4 100 x g pendant 2 min.</li>
	<li>Resuspendez les cellules une fois de plus dans 500 μL de milieux SC sans dextrose. Pré-refroidir une centrifugeuse équipée de tubes coniques de 50 mL à -10 °C ou sur le réglage de température le plus bas.</li>
	<li>Commencez la période de radiomarquage en ajoutant rapidement 500 μL de milieu de radiomarquage à chaque 500 μL de suspension cellulaire (concentration finale de 14μcét acide C - 5 μCi/mL). Incuber les tubes dans un incubateur rotatif à 30 °C pendant 20 min. 2 min avant la fin de la période d’étiquetage, transférer une aliquote de 20 mL de tampon de trempe pour chaque échantillon du congélateur à -80 °C dans un seau de glace</li>
	<li>Une fois la période de radiomarquage terminée, utilisez une pipette pour plonger l’échantillon entier de 1 mL dans 20 mL de tampon de trempe à froid. Vortex les tubes coniques pendant 5-10 s pour s’assurer que l’échantillon a été soigneusement mélangé avec le tampon de trempe. Incuber les échantillons dans un tampon de trempe pendant 2 min sur de la glace.</li>
	<li>Recueillir la pastille de la cellule en la faisant tourner dans une centrifugeuse à 5 000 x g pendant 3 min réglées à -10 °C ou à la température la plus basse. Pendant que les tubes d’échantillonnage tournent, transférez un autre ensemble d’aliquotes de tampon de trempe du congélateur à -80 °C dans un seau rempli de glace (c.-à-d. un tube de 20 mL de tampon de trempe par échantillon).</li>
	<li>Retirez le surnageant tampon de trempe des pastilles cellulaires et remplacez-le par un tampon de trempe frais, froid et de 20 mL. Vortex et agiter les échantillons jusqu’à ce que la pastille ait été délogée du fond du tube conique et mise en service complètement dans un tampon de trempe. Centrifuger à nouveau les échantillons à 5 000 x g pendant 3 min à -10 °C pour prélever les cellules.</li>
	<li>Une fois les cellules granulées, retirez soigneusement tout le tampon de trempe des échantillons en versant le surnageant et en enlevant l’excès avec une pipette. Stocker les tubes à -80 °C pour un traitement ultérieur.</li>
</ol>2. Isolement des lipides totaux de la levure
REMARQUE: Le protocole suivant pour l’isolement des lipides est basé sur une méthode bien établie et fréquemment utilisée qui extrait efficacement la plupart des espèces lipidiques neutres17,18. ATTENTION : Lorsque vous utilisez un solvant organique, portez toujours un EPI approprié et travaillez à l’intérieur d’une hotte lorsque cela est possible. Lors de l’extraction des lipides, évitez d’utiliser des plastiques incompatibles avec les solvants organiques. Les tubes en polypropylène conviennent au protocole suivant.
<ol><li>Peser 0,3 g de billes de verre lavées à l’acide pour chaque échantillon et les stocker dans des tubes de microcentrifugation de 2 mL sur de la glace. Retirez les granulés de cellule du congélateur à -80 °C et conservez-les sur la glace. Ajouter 350 μL de méthanol et 700 μL de chloroforme à chaque échantillon, réapséser et transférer dans des tubes de microcentrifugation contenant des billes de verre pré-pesées.</li>
	<li>Lyser des cellules par des tubes agités sur un vortex 3x pendant 1 min, avec 30 s d’incubations sur glace entre les agitations. Alternativement, les cellules peuvent être lysées à l’aide d’un mini batteur de perles pendant trois cycles de 1 min. Économisez 25 à 30 μL de lysate de cellules entières dans un tube séparé pour le comptage de scintillation. REMARQUE: Le lysate enregistré sera utilisé pour déterminer la quantité relative de radio-isotopes prélevés par chaque échantillon pendant la période d’impulsion, ce qui influencera la quantité de chaque échantillon chargé sur la plaque TLC. Cette question est examinée plus en détail à l’étape 3.2.</li>
	<li>Verser tout le contenu du tube de microcentrifugation de 2 mL dans un tube centrifuge en verre de 15 mL [Tube A]. Lavez les tubes de microcentrifugation de 2 mL en ajoutant 1 mL de méthanol et en vortexant pendant 10 à 15 s. Transférer le lavage au méthanol de 1 mL dans le tube A et ajouter 2 mL de chloroforme dans le tube A suivi de 400 μL d’eau pour un volume d’échantillon final de 4,45 mL.</li>
	<li>Échantillons vortex pendant 1 min suivi d’une centrifugation de 5 min à 1 000 x g. Après centrifugation, les phases aqueuse (supérieure) et organique (inférieure) doivent être clairement séparées visuellement par des débris cellulaires situés à l’interface.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, collectez la phase organique du tube A et passez à un nouveau tube centrifuge en verre de 15 mL (tube B). Ajouter 1 mL de 1M KCl au tube B. Dans le tube A, ajouter 1 mL de méthanol et 2 mL de chloroforme, ainsi que 200 μL d’eau MiliQ. Répétez les étapes de vortex et de centrifugation sur le tube A.</li>
	<li>Une fois de plus, collectez la phase organique du tube A et ajoutez-la au tube B. Jetez le tube A dans un récipient approprié. Tube vortex B pendant 1 min suivi d’une centrifugation de 5 min à 1 000 x g.</li>
	<li>Retirez la couche aqueuse supérieure du tube B et jetez-la. Ajouter 1 mL de 1 M KCl frais au tube B et répéter l’étape de vortex/centrifugation. Une fois les couches séparées, collectez soigneusement toute la couche organique inférieure dans un flacon en verre étiqueté de 4 mL. REMARQUE: À cette étape, les extraits lipidiques peuvent être stockés à -80 ° C, ou le protocole peut être poursuivi pour la séparation TLC des lipides.</li>
</ol>3. Séparation et quantification des LNL marqués par radio-isotopes par chromatographie sur couche mince
<ol><li>Si les extraits lipidiques ont été placés à -80 °C, porter lentement à température ambiante en incubant sur de la glace puis sur une paillasse. Évaporer complètement le solvant des extraits lipidiques en séchant sous vide ou en utilisant un doux flux de gaz inerte (par exemple, argon ou azote). Pendant ce temps, préchauffez un four à 145 °C pour chauffer la plaque TLC.</li>
	<li>Avant que les échantillons puissent être chargés sur la plaque TLC, déterminez les quantités relatives de radiomarque prélevées par les cellules. Pipette 10 μL de lysate de cellule entière de l’étape 2.2 dans un flacon de scintillation en verre de 6 mL, ajouter 6 mL de liquide de scintillation et placer les flacons dans une grille. Utilisez un compteur de scintillation pour mesurer le cpm ou le dpm de chaque échantillon à l’aide de l’option de comptage à rack unique définie sur un temps de comptage de 1 min. Mesurer chaque lysate de cellule entière en double pour obtenir une moyenne pour chaque échantillon. Ajuster la quantité de chargement en fonction d’un type sauvage ou d’un échantillon de référence REMARQUE: La quantité de chaque échantillon à charger sur la plaque TLC peut être déterminée à l’aide de l’équation suivante: (nombre moyen d’échantillons) / (nombre moyen de référence) x volume de chargement souhaité. Par exemple, si 20 μL de l’échantillon de référence doivent être chargés sur la plaque TLC et ont une numération moyenne de 1 000, alors un échantillon expérimental avec une numération moyenne de 2 000 aura 10 μL chargés sur la plaque TLC.</li>
	<li>Reconstituer les lipides de l’échantillon dans 40-50 μL de chloroforme:méthanol à 1:1 (v/v%) en vortexant pendant 5 min. Préparer 101 mL du solvant de phase mobile dans un cylindre gradué en verre (voir la section Résultats représentatifs pour un exemple de séparation des principales espèces NL par un solvant d’acide acétique 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexane:Petroleum ether:Diethyl ether:Acetic acid).</li>
	<li>Versez le solvant dans une chambre TLC en verre contenant un tampon de saturation TLC 20 x 20 et un couvercle hermétique. Préparez une plaque canalisée de gel de silice 20 x 20 G en marquant doucement une ligne à 1,5 cm au-dessus du fond de la plaque à l’aide d’un crayon. La ligne désigne l’origine et l’endroit où les lipides seront chargés. Sous la ligne, étiquetez délicatement l’échantillon qui sera chargé dans chaque voie. Une fois la plaque TLC préparée, incuber la plaque dans un four à 145 °C pendant au moins 30 min pour préchauffer la plaque et éliminer tout excès d’humidité.</li>
	<li>Une fois que la plaque a été suffisamment chauffée et que le tampon de saturation TLC est saturé de solvant, retirez la plaque TLC du four et procédez immédiatement au chargement de la plaque TLC. Le chargement de la plaque pendant qu’elle est chaude assure une évaporation rapide du solvant. Pour chaque espèce lipidique d’intérêt, chargez 5 à 20 μg d’un étalon lipidique purifié sur une voie de la plaque TLC pour suivre la séparation et la distance de migration prévue. À l’aide d’une pipette, repérez 5 μL d’échantillon sur l’origine de chaque voie située à 1,5 cm au-dessus du fond de la plaque TLC. Chargement répété de 5 points μL jusqu’à ce que 20 à 40 μL d’échantillon avait été chargé dans chaque voie. REMARQUE: 5 à 20 μg de lipides purifiés non marqués peuvent être ajoutés à chaque voie d’échantillonnage en tant que traceurs qui peuvent être colorés et visualisés après la séparation TLC des lipides. La présence d’un étalon coloré permet un suivi et une excision faciles des bandes lipidiques radiomarquées pour le comptage ultérieur de la scintillation. Les étalons purifiés qui sont chargés sur la plaque seront déterminés par les espèces d’intérêt de NL. Voir la section Résultat représentatif pour des exemples de séparation de l’acide oléique (FFA), du 1,2 dioléoyl-glycérol (DG), de la trioléine (TG), du cholestérol (Chol), du cholestéryl-linoléate (SE) et du squalène dans les voies adjacentes aux voies d’échantillonnage.</li>
	<li>Une fois que l’étalon et les échantillons expérimentaux ont été chargés, placez la plaque dans la chambre de développement et attendez que le solvant ait atteint le sommet de la plaque (40-60 min). Une fois la plaque complètement développée, retirez-la de la chambre et laissez-la sécher dans la hotte pendant 20 minutes.</li>
	<li>Une fois la plaque séchée, recouvrez-la d’un film plastique et placez-la dans une cassette en développement avec un écran d’autoradiographie. Laissez la plaque se développer avec l’écran pendant 24-48 h.</li>
</ol>4. Visualisation et quantification des lipides séparés par TLC
<ol><li>Retirez l’écran de la cassette en développement et placez-le à l’intérieur d’un imageur au phosphore. Sélectionnez l’option Phosphor Imaging et développez à 800-1000 V. REMARQUE: L’imagerie au phosphore donne une vue qualitative des lipides radiomarqués sur la plaque TLC. Cependant, la quantification des lipides radiomarqués est mieux réalisée par le comptage par scintillation, qui est décrit ultérieurement.</li>
	<li>Mélanger 100 mL de réactif p-anisaldéhyde (voir Dossier supplémentaire)et déposer dans un flacon pulvérisateur en verre. Vaporiser la plaque TLC avec un réactif p-anisaldéhyde jusqu’à ce que la silice soit saturée. Cuire la plaque dans un four à 145 °C pendant 5 min, ou jusqu’à ce que des bandes apparaissent.</li>
	<li>Pour quantifier les espèces lipidiques individuelles à l’aide du comptage par scintillation radiomarquage, utilisez une lame de rasoir pour gratter le gel de silice de la plaque TLC en verre. Transférer chaque bande de gel de silice correspondant à une seule espèce lipidique radiomarquée dans un flacon de scintillation en verre et ajouter 6 mL de liquide de scintillation. Vortex vigoureusement jusqu’à ce que la bande de silice ait été réduite en petits morceaux.<ol>
<li>Alternativement, les lipides peuvent être extraits de la bande de gel de silice en utilisant le protocole d’extraction des lipides à la section 3. Si les lipides sont extraits du gel de silice, évaporer entièrement le solvant comme à l’étape 3.1 et ajouter 6 mL de liquide de scintillation aux lipides séchés. Placez la grille contenant les flacons de scintillation dans un compteur de scintillation. Sélectionnez l’option Compter un seul rack et ajustez le temps de comptage à 2 min par flacon. Les résultats du compteur de scintillation seront imprimés et peuvent être visualisés sous forme de graphique à barres.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts concurrents dans la préparation de ce manuscrit.

Ici, un protocole de radiomarquage polyvalent pour surveiller quantitativement la synthèse des espèces NL dans la levure est présenté. Ce protocole est très modulaire, ce qui permet de terminer la procédure dans les 3-6 jours. De plus, il existe une abondante littérature sur l’utilisation de la TLC pour séparer les espèces lipidiques et les métabolites, ce qui devrait permettre à l’utilisateur de détecter plusieurs espèces lipidiques d’intérêt avec un simple changement des systèmes de solvants TLC16</su...

L’acétyl-CoA est l’élément constitutif fondamental de diverses biomolécules, y compris les lipides neutres (LNL), qui servent de monnaie biomoléculaire polyvalente pour la construction de membranes, la génération d’ATP et la régulation de la signalisation cellulaire1,2. La disponibilité des LNL à être déviés dans l’une de ces voies respectives est, en partie, réglementée par leur stockage. Les gouttelettes lipidiques (LD), organites cytoplasmiques composés de noyaux hydrophobes de triglycérides (TG) et d’esters de stérols (SE), sont les principaux compartiments de stockage de la plupart des LL cellulaires. En tant que tels, les LD séquestrent et régulent les LNL, qui peuvent être dégradés et ensuite utilisés pour les processus biochimiques et métaboliques3,4. On sait que la mauvaise régulation des protéines associées à la NL et à la LD est corrélée à l’apparition de pathologies telles que la lipodystrophie et les syndromes métaboliques5,6. Pour cette raison, la recherche actuelle sur la LD est intensément axée sur la façon dont la synthèse NL est régulée spatialement, temporellement et à travers des tissus distincts d’organismes multicellulaires. En raison des rôles cellulaires omniprésents des NL, de nombreuses enzymes responsables de la synthèse et de la régulation des LNL sont conservées dans l’ensemble des eucaryotes7. En effet, même certains procaryotes stockent les LL dans les LD8. Par conséquent, des organismes modèles génétiquement traitables tels que Saccharomyces cerevisiae (levure bourgeonnante) ont été utiles pour l’étude de la synthèse et de la régulation des NL.
La séparation et la quantification des LN à partir d’extraits cellulaires peuvent être réalisées de multiples façons, y compris la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS), la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) et la chromatographie liquide ultra-performance-spectrométrie de masse (UPLC-MS)9,10,11. Peut-être que la méthode la plus simple pour séparer les LNL est par chromatographie sur couche mince (TLC), qui permet une quantification densitométrique ultérieure à partir d’une courbe standard12,13. Bien que le TLC ne fournisse qu’une séparation des LNL, il reste une technique puissante car il est peu coûteux et permet la séparation rapide des LNL de plusieurs échantillons simultanément. Deux des défis les plus considérables auxquels est confrontée l’étude des LNL via TLC sont: 1) le large éventail d’abondances cellulaires des espèces NL et de leurs intermédiaires, et 2) la gamme d’hydrophilie / hydrophobicité des intermédiaires lipidiques dans les voies de synthèse NL. Par conséquent, la quantification des espèces de Terre-Neuve-et-Labrador par LTC est généralement limitée aux espèces les plus abondantes; cependant, l’introduction d’un radiomarque de l’acide C-acétique 14peut améliorer considérablement la détection des intermédiaires de faible abondance dans les voies NL. L’acide acétique est rapidement converti en acétyl-CoA par l’acétyl-CoA synthétase ACS214, ce qui fait de l’acide 14C-acétique un substrat de radiomarquage approprié dans la levure15. De plus, la séparation des LNL hydrophobes et des intermédiaires hydrophiles des LNL peut être réalisée par TLC grâce à l’utilisation de plusieurs systèmes de solvants16. Ici, une méthode est présentée pour la séparation des LNL en utilisant le label métabolique de l’acide C-acétique 14dans la levure. Les lipides marqués pendant la période de pouls sont ensuite isolés par un protocole d’isolement lipidique total bien établi17,suivi de la séparation des espèces NL par TLC. Le développement de plaques TLC par autoradiographie pour visualiser les lipides marqués et par pulvérisation chimique pour visualiser les lipides totaux permet de multiples méthodes de quantification. Les bandes lipidiques individuelles peuvent également être facilement extraites de la plaque TLC à l’aide d’une lame de rasoir, et le comptage de scintillation peut être utilisé pour quantifier la quantité de matériau radiomarqué dans la bande.

<table><tbody><tr><td>[1-C14] Activité spécifique du sel de sodium de l’acide acétique : 45-60mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC084H001MC</td><td></td></tr><tr><td>18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol</td><td>Avanti</td><td>800811O</td><td></td></tr><tr><td>200 proof absolu éthanol</td><td>Sigma</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>Perles de verre lavées à l’acide 425-600um</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Ampoules ambrées pour pipettes</td><td>Pastuer Fisher</td><td>03-448-24</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate d’ammonium >99 %</td><td>Sigma</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>Compteur à scintillation Beckman LS6500</td><td>PerkinElmer</td><td>A481000</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme (grade HPLC)</td><td>Fisher</td><td>C607SK</td><td></td></tr><tr><td>Cholestérol >99 %</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Cholesteryl-linoléate >98 %</td><td>Sigma</td><td>C0289</td><td></td></tr><tr><td>Acide sulfurique concentré</td><td>Sigma</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>Corning 50mL Tubes coniques, polypropylène avec bouchon centristar</td><td>Sigma</td><td>CLS430829</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose, qualité anhydre</td><td>Sigma</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>Éther diéthylique qualité anhydre</td><td>Sigma</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>Four de séchage</td><td>Fisher</td><td>11-475-155</td><td></td></tr><tr><td>EcoLume liquide à scintillation</td><td>Centrifugeuse VWR</td><td>IC88247001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5424R</td><td>Fisher</td><td>05-401-205</td><td></td></tr><tr><td>GE Écran de stockage au phosphore</td><td>Sigma</td><td>GE28-9564-75</td><td></td></tr><tr><td>Imageur</td><td></td><td></td><td></td>FLA9500 GE Typhoon</tr><tr><td>Acide acétique glacial, grade ACS</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Flacons à scintillation 6mL</td><td>Sigma</td><td>M1901</td><td></td></tr><tr><td>Capuchons de tubes à centrifuger en verre</td><td>Fisher</td><td>14-595-36A</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger en verre</td><td>Fisher</td><td>14-595-35A</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur en verre</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Hexane, qualité anhydre</td><td>Sigma</td><td>296090</td><td></td></tr><tr><td>L-Adénine >99 %</td><td>Sigma</td><td>A8626</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanine >98 %</td><td>Sigma</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginine >99 %</td><td>Sigma</td><td>A1270000</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagine >98 %</td><td>Sigma</td><td>A0884</td><td></td></tr><tr><td>L-Aspartate >98 %</td><td>Sigma</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystéine >97 %</td><td>Sigma</td><td>W326305</td><td></td></tr><tr><td>Acide L-Glutamique monosodique sel monohydraté >98 %</td><td>Sigma</td><td>49621</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine >99 %</td><td>Sigma</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>L-Glycine >99 %</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine >99 %</td><td>Sigma</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>L-Isoleucine >98 %</td><td>Sigma</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine >98 %</td><td>Sigma</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysine >98 %</td><td>Sigma</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>L-Méthionine, grade HPLC</td><td>Sigma</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-Phénylalanine, qualité réactif</td><td>Sigma</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>L-Proline >99 %</td><td>Sigma</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>L-Sérine >99 %</td><td>Sigma</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>L-Theronine, qualité réactif</td><td>Sigma</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>L-Tryptophane >98 %</td><td>Sigma</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosine >98 %</td><td>Sigma</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>L-Uracil >99 %</td><td>Sigma</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-Valine >98 %</td><td>Sigma</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol, grade ACS</td><td>Fisher</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>Acide oléique >99 %</td><td>Sigma</td><td>O1008</td><td></td></tr><tr><td>p-anisaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>A88107</td><td></td></tr><tr><td>Éther de pétrole, grade ACS</td><td>Sigma</td><td>184519</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylcholine, dipalmitoyle >99 %</td><td>Sigma</td><td>P1652</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Eppendorf</td><td>2231000713</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium, granulés</td><td>d’hydroxyde de sodium Sigma</td><td>P3911</td><td></td>de qualité</tr><tr><td>ACS, certifiés ACS</td><td>Fisher</td><td>S318-100</td><td></td></tr><tr><td>Squalène >98 %</td><td>Sigma</td><td>S3626</td><td></td></tr><tr><td>Acide succinique cristallin/certifié</td><td>Fisher</td><td>110-15-6</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de saturation TLC</td><td>Sigma</td><td>Z265225</td><td></td></tr><tr><td>Gel de silice TLC 60G Plaque canalisée en verre</td><td>Fisher</td><td>NC9825743</td><td>Pas d’indicateurs fluorescents</td></tr><tr><td>Film plastique transparent</td><td>Apollo</td><td>829903</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Trioléine >99 %</td><td>Sigma</td><td>T7140</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur vortex</td><td>Fisher</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>Whatman cassette d’exposition</td><td>Sigma</td><td>WHA29175523</td><td></td></tr><tr><td>Base d’azote de levure sans sulfate d’ammonium et acides aminés</td><td>Sigma</td><td>Y1251</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse de la synthèse lipidique neutre chez saccharomyces cerevisiae par marquage métabolique et chromatographie sur couche mince

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Les lipides neutres (LNI) sont une classe de biomolécules hydrophobes et sans charge qui jouent un rôle clé dans l’homéostasie énergétique et lipidique. Les NL sont synthétisés de novo à partir de l’acétyl-CoA et sont principalement présents chez les eucaryotes sous forme de triglycérides (TG) et d’esters de stérols (SE). Les enzymes responsables de la synthèse des LNL sont hautement conservées de Saccharomyces cerevisiae (levure) à l’homme, faisant de la levure un organisme modèle utile pour disséquer la fonction et la régulation des enzymes du métabolisme NL. Bien que l’on sache beaucoup de choses sur la façon dont l’acétyl-CoA est converti en un ensemble diversifié d’espèces NL, des mécanismes de régulation des enzymes du métabolisme NL et comment une mauvaise régulation peut contribuer aux pathologies cellulaires sont encore en cours de découverte. De nombreuses méthodes d’isolement et de caractérisation des espèces de Terre-Neuve-et-Labrador ont été mises au point et utilisées au cours de décennies de recherche; toutefois, il n’a pas été question d’un protocole quantitatif et simple pour la caractérisation complète des principales espèces de Terre-Neuve-et-Labrador. Ici, une méthode simple et adaptable pour quantifier la synthèse de novo des principales espèces nl dans la levure est présentée. Nous appliquons 14marques métaboliques de l’acide C-acétique couplées à la chromatographie sur couche mince pour séparer et quantifier une gamme variée de NL physiologiquement importantes. De plus, cette méthode peut être facilement appliquée pour étudier les taux de réaction in vivo des enzymes NL ou la dégradation des espèces NL au fil du temps.

Dans ce protocole, nous avons démontré que le labeling, la détection et la quantification des espèces NL peuvent être réalisés par 14étiquetage métabolique de l’acide C-acétique. Les principales espèces nl peuvent être séparées dans un système de solvant de 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexane:Éther de pétrole:Éther diéthylique:Acide acétique (Figure 1A, B). L’imagerie au phosphore permet de visualiser l’acide gras libre marqué (FFA), le triacylglycérol (TG), le diacylgly...

Ici, un protocole est présenté pour le profilage métabolique de la levure avec de l’acide 14C-acétique, qui est couplé à la chromatographie sur couche mince pour la séparation des lipides neutres.

Analyse de la synthèse lipidique neutre chez Saccharomyces cerevisiae par marquage métabolique et chromatographie sur couche mince

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Cette technique utilise des instruments couramment trouvés dans la plupart des environnements de laboratoire et permet l’analyse de plusieurs échantillons simultanément. Cette méthode peut fournir des informations clés sur la façon dont les enzymes du métabolisme des lipides sont régulées dans un contexte cellulaire et dans différents contextes génétiques. Inoculer une colonie d’une plaque de culture de levure dans 20 millilitres de milieux SC contenant 2% de dextrose et incuber à 30 degrés Celsius pendant la nuit en agitant à 200 tr / min.Le lendemain, diluer la culture dans 50 millilitres de milieux frais jusqu’à une DO finale de 0,2 et la faire croître pendant 24 heures jusqu’à ce que la phase stationnaire soit atteinte. Préparez deux aliquotes de 20 millilitres de tampon de trempe pour chaque échantillon et conservez-les à moins 80 degrés Celsius. Simultanément, préparez des milieux de radiomarquage en ajoutant du sel de sodium d’acide acétique aux milieux SC sans dextrose à une concentration finale de 10 microcuries par millilitre.Prélever les cellules en centrifugant à 4 100 x g pendant 10 minutes. Retirez le surnageant et lavez la pastille de cellule une fois avec 20 millilitres de milieu SC sans dextrose. Prélever à nouveau les cellules en les centrifugant à 4 100 x g pendant cinq minutes et les transférer dans un tube de microcentrifugation marqué de deux millilitres à l’aide d’un milieu libre dextre.Centrifugez les cellules pendant encore deux minutes. Remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de milieux SC sans dextrose et commencez la période de radiomarquage en ajoutant rapidement 500 microlitres de milieux de radiomarquage à chaque suspension cellulaire. Incuber les tubes dans un incubateur rotatif à 30 degrés Celsius pendant 20 minutes.Pendant ce temps, pré-refroidir la centrifugeuse équipée de tubes coniques de 50 millilitres à moins 10 degrés Celsius et décongeler une aliquote de 20 millilitres de tampon de trempe. Une fois la période de radiomarquage terminée, utilisez une pipette pour plonger l’échantillon entier d’un millilitre dans un tampon de trempe décongelé sur de la glace. Recueillir la pastille de la cellule en la faisant tourner dans une centrifugeuse pré-refroidie à 5 000 x g pendant trois minutes et ajouter 20 millilitres de tampon de trempe à froid frais.Vortex et secouez les échantillons pour les remettre complètement en service dans un tampon de trempe et centrifugez à nouveau les échantillons pour prélever les cellules. Une fois les cellules granulées, retirez soigneusement tout le tampon de trempe des échantillons en versant le surnageant et en enlevant l’excès avec une pipette. Conservez les tubes à moins 80 degrés Celsius pour un traitement ultérieur.Peser 0,3 gramme de billes de verre lavées à l’acide pour chaque échantillon et les stocker dans deux tubes de microcentrifugation millilitres sur de la glace. Retirez les granulés de cellules du congélateur à moins 80 degrés et placez-les sur de la glace. Ensuite, ajoutez 350 microlitres de méthanol et 700 microlitres de chloroforme à chaque échantillon et ressuspendez les cellules.Transférez-les dans des tubes de microcentrifugation contenant des billes de verre pré-pesées. Lyser les cellules en tourbillonnant trois fois pendant une minute, avec une incubation de 30 secondes sur de la glace entre les agitations. Versez les cellules dans un tube de centrifugeuse en verre de 15 millilitres et étiquetez le tube comme tube A.Lavez le tube de microcentrifugation avec un millilitre de méthanol, vortexez-le et versez le méthanol dans le tube A.Ajoutez deux millilitres de chloroforme suivis de 400 microlitres d’eau dans le tube A pour un volume d’échantillon final de 4,45 millilitres.Vortex les échantillons pendant une minute suivie d’une centrifugation de cinq minutes à 1000 x g pour séparer clairement les phases aqueuse et organique avec les débris cellulaires se trouvant à l’interface. À l’aide d’une pipette de pâturage en verre, recueillir la phase organique dans un nouveau tube de centrifugeuse en verre étiqueté B et ajouter un millilitre d’un chlorure de potassium molaire. Ajouter un millilitre de méthanol et deux millilitres de chloroforme au tube A et répéter les étapes de vortex et de centrifugation.Vortex et tube centrifuge B pour séparer la phase aqueuse et la phase organique. Retirez la couche aqueuse supérieure et rassemblez toute la couche organique inférieure dans un flacon en verre de quatre millilitres. Évaporer complètement le solvant des extraits lipidiques en séchant sous gaz inerte et préchauffer un four à 145 degrés Celsius pour chauffer la plaque TLC.Déterminer les quantités relatives de radiomarque prises par les cellules avant de les charger sur la plaque TLC. Reconstituer les lipides de l’échantillon dans 40 à 50 microlitres de chloroforme et de méthanol mélangés à un rapport de un pour un en vortexant pendant cinq minutes. Préparer 101 millilitres du solvant de phase mobile dans un cylindre gradué en verre.Ensuite, versez le solvant dans une chambre TLC en verre contenant un tampon de saturation TLC de 20 par 20 et un couvercle hermétique. Préparez une plaque canalisée de gel de silice 60G de 20 par 20 et marquez une ligne à 1,5 centimètre au-dessus du fond de la plaque à l’aide d’un crayon. Une fois que la plaque a été suffisamment chauffée et que le tampon de saturation TLC est saturé de solvant, retirez la plaque TLC du four et procédez immédiatement au chargement.À l’aide d’une pipette, repérez cinq microlitres d’échantillon sur l’origine de chaque voie située à 1,5 centimètre au-dessus du fond de la plaque TLC et répétez le chargement jusqu’à ce que 20 à 40 microlitres d’échantillon entraitré dans chaque voie. Une fois l’étalon et les échantillons chargés, placez la plaque dans la chambre de développement et attendez que le solvant ait atteint le sommet de la plaque. Lorsque la plaque est complètement développée, retirez-la de la chambre et laissez-la sécher dans la hotte pendant 20 minutes.Une fois la plaque séchée, recouvrez-la d’un film plastique et placez-la dans une cassette en développement avec un écran d’autoradiographie. Retirez l’écran de la cassette en développement et placez-le à l’intérieur d’un imageur au phosphore. Vaporisez la plaque TLC avec un réactif p-anisaldéhyde jusqu’à ce que la silice soit saturée, puis faites-la cuire dans un four à 145 degrés pendant cinq minutes ou jusqu’à ce que des bandes soient apparues.Pour quantifier les espèces lipidiques, grattez le gel de silice contenant des espèces lipidiques individuelles et transférez-les dans des flacons de scintillation en verre. Ajouter six millilitres de liquide de scintillation et vortex vigoureusement jusqu’à ce que la bande de silice ait été réduite en petits morceaux. Placez la grille avec les flacons de scintillation dans un compteur de scintillation et comptez en ajustant le temps de comptage à deux minutes par flacon.L’imagerie au phosphore permet de visualiser l’autoradiogramme de l’acide gras sans étiquette, du triacylglycérol, du diacylglycérol, du cholestérol et du squalane. Il a été démontré que les espèces lipidiques purifiées peuvent être séparées dans cette méthode et ensuite visualisées par pulvérisation de la plaque TLC avec un réactif p-anisaldéhyde. Les espèces visualisées comprennent tous les lipides mentionnés précédemment en plus des esters stériles.En appliquant une période de poursuite de 10 minutes dans des milieux sans radiomarque après le pouls, on a observé au niveau du principal bassin de squalane disparaître et le cholestérol total était élevé. De même, l’apparition du diacylglycérol dans la période de poursuite était corrélée à une diminution du signal des acides gras libres. Avant d’effectuer le protocole complet, il est important de déterminer si les cellules absorberont le radiomarque de l’acide acétique dans l’état de croissance et le fond génétique d’intérêt.

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Analyse de la synthèse lipidique neutre chez Saccharomyces cerevisiae par marquage métabolique et chromatographie sur couche mince

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