Purification et expansion de cellules T tueuses naturelles invariantes de souris pour des études in vitro et in vivo

Ce protocole permet la purification des lymphocytes T INK, qui sont très rares, et permet une multiplication par 30 de leur nombre. La purification peut être réalisée en une journée et produire un grand nombre de lymphocytes T INK prêts à l’emploi pour des études in vivo et in vitro en deux semaines. Gloria Delfanti, post-doctorante au laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Après avoir disséqué la rate de la souris, écrasez-la à travers une passoire cellulaire de 70 nanomètres pour obtenir une suspension à cellule unique dans 10 millilitres de PBS avec 2% FBS. Centrifuger à 300 fois G pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire avec un millilitre de tampon stérile de chlorure d’ammonium potassium lysine.

Incuber les cellules pendant trois minutes à température ambiante, puis bloquer avec cinq millilitres de PBS avec 2% FBS. Centrifuger à 300 fois G pendant cinq minutes. Après avoir retiré le surnageant, remettez en suspension la pastille cellulaire dans trois millilitres de PBS avec 2% de FBS et éliminez les résidus de graisse par pipetage.

Pour les étapes d’enrichissement, gardez les cellules au froid et utilisez des solutions pré-refroidies à quatre degrés Celsius puis conservées sur de la glace. Centrifuger à 300 fois G pendant cinq minutes. Remettre en suspension toutes les cellules dans la quantité appropriée de PBS avec 2% FPS et un bloqueur Fc et incuber pendant 15 minutes à température ambiante.

Laver avec un à deux millilitres de tampon de séparation MACS par 10 millions de cellules et centrifuger à 300 fois G pendant 10 minutes. Après avoir retiré le surnageant, colorez les cellules avec CD19-FITC et H2-IAb-FITC et incubez pendant 15 minutes dans l’obscurité à quatre à huit degrés Celsius. Lavez les cellules en ajoutant un à deux millilitres de tampon MACS par 10 millions de cellules et centrifugez à 300 fois G pendant 10 minutes.

Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 90 microlitres de tampon MACS pour 10 millions de cellules. Ajouter 10 microlitres de microbilles anti-FITC pour 10 millions de cellules. Bien mélanger et incuber pendant 15 minutes dans l’obscurité à quatre à huit degrés Celsius.

Lavez les cellules en ajoutant un à deux millilitres de tampon MACS par 10 millions de cellules et centrifugez à 300 fois G pendant 10 minutes. Retirez le surnageant et remettez en suspension jusqu’à 125 millions de cellules dans 500 microlitres de tampon MACS. Placez une colonne LD dans le champ magnétique du séparateur MACS.

Pour éviter le colmatage, appliquez un filtre de pré-séparation sur la colonne LD et rincez-la avec deux millilitres de tampon MACS. Appliquez la suspension de cellule sur le filtre et collectez les cellules non étiquetées qui traversent la colonne. Lavez le réservoir de colonne vide trois fois avec un millilitre de tampon MACS.

Recueillir l’effluent enrichi en lymphocytes T et compter les cellules, en conservant 50 microlitres pour l’analyse FACS. Après centrifugé à 300 fois G pendant cinq minutes, retirez le surnageant et colorez les cellules avec cd1d tétramère-PE. Bien mélanger et incuber pendant 30 minutes dans l’obscurité sur de la glace.

Lavez les cellules en ajoutant un à deux millilitres de tampon MACS pour 10 millions de cellules. Après centrifugation à 300 fois G pendant 10 minutes, retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 80 microlitres de tampon MACS pour 10 millions de cellules. Ajouter 20 microlitres de microbilles anti-PE pour 10 millions de cellules.

Bien mélanger et incuber pendant 15 minutes dans l’obscurité à quatre à huit degrés Celsius. Lavez les cellules en ajoutant un à deux millilitres de tampon MACS par 10 millions de cellules et centrifugez à 300 fois G pendant 10 minutes. Retirez le surnageant et remettez en suspension jusqu’à 100 millions de cellules dans 500 microlitres de tampon MACS.

Selon le nombre de cellules, placez la colonne LS ou MS dans le champ magnétique du séparateur MACS et rincez la colonne avec un tampon MACS. Appliquez la suspension cellulaire sur la colonne, collectez les cellules non marquées qui passent à travers et lavez la colonne trois fois comme décrit précédemment. C’est la fraction négative.

Retirez la colonne du champ magnétique et placez-la sur un nouveau tube collecteur. Pipettez le tampon MACS sur la colonne et poussez le piston fourni dans la colonne pour éliminer la fraction positive enrichie en cellules T INK. Pour augmenter encore la récupération des lymphocytes T INK, centrifugez la fraction négative à 300 fois G pendant 10 minutes et répétez les étapes précédentes avec une nouvelle colonne LS ou MS.

Tirez les fractions positives et déterminez le nombre de cellules. Conservez 50 microlitres de fractions positives et négatives pour l’analyse FACS afin de vérifier la pureté. Pour activer les lymphocytes T INK à un rapport de un pour un, transférez le volume approprié de billes magnétiques anti-CD3 et CD28 dans un tube et à un volume égal de PBS, puis vortexez pendant cinq secondes.

Placez le tube sur un aimant pendant une minute et jetez le surnageant. Retirez le tube de l’aimant et remettez en suspension les billes magnétiques lavées dans le volume approprié de RPMI. Centrifugez les lymphocytes T INK purifiés à 300 fois G pendant cinq minutes et mélangez-les avec des billes magnétiques anti-CD3 ou CD28 de souris T-activateur.

Plaquez un millilitre de la suspension cellulaire, perles magnétiques anti-CD23 et CD28 dans une plaque de 48 puits avec 20 unités par millilitre d’IL-2, puis incubez à 37 degrés Celsius. Après cinq jours, ajoutez 10 nanogrammes par millilitre d’IL-7. Divisez les cellules en deux lorsqu’elles atteignent 80 à 90% de confluence, en ajoutant toujours 20 unités par millilitre d’IL-2 et 10 nanogrammes par millilitre d’IL-7.

Dans ces conditions, les lymphocytes T INK peuvent être dilatés jusqu’à 15 jours. En utilisant ce protocole, les lymphocytes T INK sont enrichis à partir de la rate de souris transgéniques par un processus de séparation immunomagnétique. Après enrichissement, les cellules peuvent être élargies avec des billes anti-CD3 et CD28, ce qui entraîne une expansion de 30 fois en moyenne au jour 14 de la culture.

La forte activation avec des billes anti-CD3 et anti-CD a induit la régulation négative de l’expression TCR des lymphocytes T IMK à la surface de la cellule et une double population négative est apparue. La majorité des lymphocytes T INK expansés sont négatifs cd4. La caractérisation des facteurs de transcription spécifiques à la lignée PLZF et ROR gamma T a permis d’identifier les phénotypes NKT1, NKT2 et NKT17 sur des lymphocytes T INK enrichis au jour zéro et 14.

Les lymphocytes T INK enrichis présentent un phénotype effecteur de type T80, qui est conservé après 14 jours d’expansion, comme le confirme la sécrétion d’interféron gamma et d’IL-4 après stimulation par la PMA et l’ionomycine. Pendant les étapes de purification, n’oubliez pas de travailler rapidement avec des solutions pré-refroidies et de vous débarrasser de tout résidu de graisse pouvant être vu lors du pipetage. Les lymphocytes T INK expansés peuvent être exploités pour des essais in vitro et des transferts in vivo chez la souris, même après des modifications fonctionnelles via le transfert ou l’édition de gènes.

L’expansion in vitro des lymphocytes T INK surmonte la limitation donnée par la rareté, les rendant exploitables dans des études précliniques dans les domaines de la surveillance immunitaire tumorale, des maladies infectieuses et de l’auto-immunité.