In vivo Imagerie du calcium chez la souris Olive inférieure

L’olive inférieure est la partie la plus ventrale de la médulle et est donc extrêmement difficile à atteindre chez un animal vivant. Ici, nous introduisons un protocole pour exposer le tronc cérébral de la souris adulte de la face ventrale et utilisons des lentilles GRIN pour enregistrer l’activité neuronale dans les neurones olive inférieurs exprimant des capteurs de calcium. Cette méthode évite les dommages au tronc cérébral critique pour la vie et permet d’enquêter sur les modèles d’activité spatio-temporelle et l’intégration des entrées dans l’olive inférieure.

Étant donné que l’opération est effectuée dans la région complexe de la gorge avec de nombreuses structures vitales, il est essentiel qu’elle soit menée par un chercheur ayant des compétences chirurgicales de haut niveau. Préparez un tube d’intubation en coupant une fente de 5 à 6 millimètres de long et de 0,8 millimètre de large à partir de l’extrémité d’un cathéter de calibre 20. Préparez une aiguille émoussée et incurvée en coupant la pointe, poncer la surface de fracture et pliez-la avec le plier.

Ceci sera utilisé pour soutenir une trachée pendant la trachéotomie. Diluer 15 milligrammes par millilitre de kétamine avec une solution saline à 15%Assembler des outils de chirurgie et des consommables. Réglez le coussin chauffant à 38 degrés Celsius.

Tournez le nosecone de 180 degrés horizontalement dans un cadre stéréotaxique. Peser la souris dont l’olive inférieure a été précédemment transfectée par des GCaMP6 porteurs du virus et calculer la quantité de kétamine diluée à injecter. Préremouchez la boîte d’induction avec 5% d’isoflurane et anesthésiez la souris.

Montez la souris dans le cadre stéréotaxique, côté ventral vers le haut. Rasez la gorge et la cuisse de la souris. Retirez les cheveux résiduels avec une crème d’épilation.

Appliquer par voie topique de la gelée de xylocaine sur la peau de gorge. Surveillez la température de la souris à l’avec un capteur thermique rectal. Injecter un millilitre de solution saline préchauffée par voie intrapéritonéale.

Évaluer la profondeur de l’anesthésie par une forte pincement sur les orteils postérieurs. Aucune réponse détectable ne doit être évoquée. Faire une incision verticale dans la peau de la gorge le long de la ligne médiane.

Séparez la peau du cou des viscères en dessous en utilisant la méthode de dissection émoussée et coupez la peau. Libérez les glandes salivaires du tissu conjonctif, et retournez-les latéralement pour exposer la trachée muscle-couverte sternothyroïde. Injecter par voie intrapéritonéale la première dose de kétamine diluée à cinq millilitres par kilogramme de poids animal.

Divisez soigneusement le muscle sternothyroïde le long de la ligne médiane avec le bout d’une pince fine pour exposer la trachée. Détachez la trachée des vaisseaux sanguins et de l’oesophage avec des pinces utilisant la méthode émoussée de dissection. Injecter une deuxième dose de kétamine diluée à 2,5 millilitres par kilogramme de poids animal.

Insérez en croix une aiguille émoussée sous la trachée. Soulevez la trachée avec l’aiguille émoussée. Faites en sorte que le fil de suture fasse le tour du troisième anneau de trachée, caudale de la glande thyroïde, avec une aiguille en demi-cercle.

Faites quatre liens d’instruments sur cet anneau. Percez la peau de la poitrine avec la même aiguille en demi-cercle et conduisez le fil à travers la peau. Soulevez doucement la trachée avec le fil et coupez la trachée caudale à la glande thyroïde.

Tirez la trachée vers la peau de la poitrine. Soulevez l’ouverture de la trachée en ajoutant un petit morceau d’éponge chirurgicale en dessous. Enlevez tout liquide restant à l’intérieur de l’extrémité d’ouverture de la trachée à l’avec une fine bande de tissu nettoyant.

Basculer le flux d’isoflurane du nosecone stéréotaxique au tube d’intubation. Insérez le tube d’intubation dans la trachée. Assurez-vous qu’une partie de la fente dans le tube reste à l’extérieur de la trachée pour permettre la respiration.

Fixez la trachée à la peau de poitrine de la souris en faisant trois à quatre liens d’instrument. Attachez la trachée avec le fil de suture pour fixer le tube d’intubation. Trancher le muscle sternothyroïdienne le long des fibres musculaires avec la pince fine.

Coupez la partie isolée avec les ciseaux à ressort. Libérez soigneusement les restes de trachée et de larynx du muscle pour minimiser les dommages sur les vaisseaux sanguins dans le muscle. Enlever les restes de trachée et de larynx.

Libérez l’œsophage des tissus attachés avec une pince et coupez-le avec des ciseaux à ressort. Enlever le muscle longitudinal recouvrant le tronc cérébral et l’arc ventral de l’atlas. Enlever le muscle recouvrant l’arc ventral de l’atlas et le tubercule antérieur.

Couper les arcs ventraux de l’atlas avec le rongeur. Enlever le tubercule antérieur de l’atlas. Retirez le sang et le liquide pour voir le foramen magnum et le tronc cérébral.

Dilatez le foramen magnum en enlevant l’os occipital avec le rongeur. Retirez le cartilage, et épluchez soigneusement la couche périostéale du mater de dura avec la pince fine pour avoir une vue claire du tronc cérébral ventral. Serrez le capteur SpO2 sur la cuisse de la souris pour surveiller les signes vitaux tels que la fréquence cardiaque, la saturation en oxygène et la fréquence respiratoire.

Montez la lentille GRIN sur la tige d’implantation. Nettoyez soigneusement la lentille avec un tissu nettoyant imbibé d’éthanol à 70%. Fixez la tige d’implantation sur le cadre stéréotaxique et montez le microscope miniature sur la tige d’implantation.

Ajouter plusieurs gouttes de solution saline dans la zone du tronc cérébral pour l’immersion de la lentille GRIN. Approchez le tronc cérébral avec l’objectif de GRIN. Les GCaMP6 exprimant des neurones olive inférieurs dans la zone superficielle peuvent être trouvés dans une région en forme de rectangle, environ 0,5 à 1,7 millimètre rostral à l’atlas restant, et environ 2,6 à 1,1 millimètre latéral à la ligne médiane.

Allumez la LED bleue d’excitation dans un microscope miniature pour localiser les neurones olive inférieurs transfectés par GCaMP6. Les neurones montrent une intensité de fluorescence de base différente en raison de divers niveaux d’expression de GCaMP6s. Le changement du niveau de calcium de la somata de neurone olive inférieur encerclé dans la vidéo de gauche nous montrera delta F divisé par F traces sur la droite.

Bien que la souris soit maintenue au chaud et hydratée, elle sera inévitablement affaiblie par une anesthésie et une chirurgie prolongées. Il est essentiel de garder la durée de la chirurgie courte afin que la condition physique de la souris soit bonne pour l’enregistrement. Un chercheur qualifié peut terminer la chirurgie en 70 minutes.

Cette méthode, avec des modifications, peut être employée pour étudier d’autres régions adjacentes du tronc cérébral ventral.