Name: Une méthode pour préserver les racines et les rhizosphères des zones humides pour l’imagerie élémentaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Découvrez une méthode de slam-freezing et lyophilisation pour préserver racines et rhizosphères de zones humides en vue d'une imagerie élémentaire. Cette technique rapide et économique permet d'étudier les interactions plante-sol avec une haute résolution.

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Les auteurs reconnaissent une subvention de démarrage conjointe à Seyfferth et Tappero pour soutenir la collaboration entre l’Université du Delaware et le Brookhaven National Laboratory. Certaines parties de cette recherche ont utilisé la ligne de faisceau XFM (4-BM) de la National Synchrotron Light Source II, une installation d’utilisateurs du Bureau des sciences du département de l’Énergie des États-Unis (DOE) exploitée pour le Bureau des sciences du DOE par le Brookhaven National Laboratory en vertu du contrat no. DE-SC0012704.

1. Préparation de l’équipement de congélation par slam
<ol><li>Placez deux blocs de cuivre (~5 cm x 5 cm x 15 cm) horizontalement à l’intérieur d’un refroidisseur propre capable de contenir de l’azote liquide et versez suffisamment d’azote liquide pour immerger les blocs. Une fois que le bouillonnement s’estompe, placez deux entretoises au-dessus d’un bloc de cuivre à chaque extrémité. REMARQUE : La hauteur de l’entretoise détermine la hauteur de l’échantillon à congeler; cet exemple utilise une entretoise de 2 cm pour créer des cubes d’environ 3 cm x 3 cm x 2 cm. Le volume de l’azote liquide dépendra de la taille du refroidisseur. Cet exemple utilise environ 1 L pour environ 5 cubes en série. ATTENTION : Utilisez un équipement de protection individuelle et une ventilation appropriés, car l’azote liquide est un cryogène et un asphyxiant.</li>
	<li>À l’aide de pinces et de gants cryogéniques, placez l’autre bloc de cuivre à son extrémité pour faciliter la récupération lorsque l’échantillon est en place.</li>
</ol>2. Prélèvement d’échantillons et congélation
<ol><li>Extrayez la plante et la rhizosphère souhaitées du sol humide à l’aide d’une pelle et assurez-vous que le trou creusé est beaucoup plus grand que le volume racinaire souhaité. Placez le sol et la plante dans un récipient et placez-le sur une paillasse. REMARQUE: L’ensemble du sol en pot et de la plante provenant d’une étude en pot peut également être utilisé.</li>
	<li>Déterminer l’emplacement souhaité du sol où les racines doivent être prélevées (c.-à-d. la profondeur et la proximité de la pousse). Coupez l’excès de sol à l’aide d’une lame en acier, en prenant soin de ne pas déranger le sol dans la zone souhaitée. Lorsque la zone souhaitée est atteinte, coupez un « cube » de racine d’environ 3 cm x 3 cm x 2 cm et placez immédiatement le cube entre les deux entretoises sur le bloc de cuivre horizontal. À l’aide de gants cryogéniques, ramassez le bloc de cuivre vertical et placez-le sur les entretoises pour geler le cube de rhizosphère.</li>
	<li>Après que le bouillonnement se soit calmé (~ 5 min), récupérez le cube de rhizosphère congelé par slam des blocs de cuivre et enveloppez-le à l’intérieur d’un carré de feuille d’aluminium pré-étiqueté. Marquez l’orientation du bloc sur la feuille si vous le souhaitez. Placer dans un deuxième récipient d’azote liquide jusqu’à ce qu’il soit stocké dans un congélateur à -80 °C.</li>
	<li>Répétez l’opération au besoin pour obtenir le nombre souhaité de cubes racines à partir du site de terrain ou de l’expérience. Assurez-vous que les deux blocs de cuivre ont le temps de refroidir entre les échantillons.</li>
</ol>3. Lyophilisation et incorporation de cubes de rhizosphère
<ol><li>Préparez le lyophilisateur conformément aux instructions du fabricant. Veillez à ce qu’il ait obtenu la pression et la température de vide appropriées avant de retirer les échantillons du congélateur à -80 °C.</li>
	<li>Lorsque le lyophilisateur est prêt à recevoir des échantillons, placez un cube de rhizosphère congelé à l’intérieur d’un tube de 50 mL propre et lavé à l’acide et couvrez-le lâchement avec une lingette jetable propre. Fixez la lingette avec un élastique. Répétez l’opération au besoin pour vous assurer qu’un cube par tube. REMARQUE: Si l’échantillon est trop grand pour un tube, il peut être placé directement dans le récipient de lyophilisation en utilisant le papier d’aluminium comme porte-échantillon.</li>
	<li>Placer les tubes contenant des échantillons dans des récipients lyophilisateurs et les congeler pendant plusieurs jours. Le temps de séchage exact dépendra des propriétés du sol. REMARQUE: Conservez les échantillons séchés dans le lyophilisateur ou un dessiccateur pour éviter la réhydratation.</li>
	<li>Utilisez une lame en acier pour couper les cubes de sol séchés à la taille afin qu’ils s’adaptent à la forme souhaitée (par exemple, la forme de 25 mm de diamètre est idéale pour la plupart des applications). Étiquetez chaque forme, placez les cubes de sol dans les formes et placez les formes à l’intérieur d’un dessiccateur sous vide.</li>
	<li>Préparez l’époxy selon les instructions du fabricant. S’assurer que l’époxy choisi n’est pas contaminé et ne provoque pas de changements de spéciation des éléments souhaités 20,29,30.</li>
	<li>Utilisez un compte-gouttes pour ajouter de l’époxy à la forme d’un côté du sol, jusqu’à ce qu’il recouvre entièrement l’échantillon. Le sol s’assombrit en couleur à mesure que l’époxy mouille le sol. REMARQUE: Ajouter l’époxy lentement pour permettre à l’air dans le sol de s’échapper.</li>
	<li>Une fois les formulaires remplis d’époxy, fermez le dessiccateur à vide et allumez le vide. Selon la quantité d’air emprisonnée dans le sol, il peut être nécessaire d’ajouter périodiquement plus d’époxy aux formes. Vérifiez le niveau d’époxy toutes les 30-90 minutes pendant les 1-4 premières heures et ajoutez de l’époxy au besoin.</li>
	<li>Retirez l’échantillon de la forme une fois que l’époxy a durci (~ 5 jours).</li>
</ol>4. Découpe et sectionnement des cubes de rhizosphère
<ol><li>Découpez l’échantillon à l’aide d’une scie humide de précision à lame diamantée. Coupez les échantillons à différents endroits si aucune racine n’est obtenue lors de la coupe précédente.</li>
	<li>Poncez manuellement les échantillons coupés avec du papier de verre progressivement plus fin (par exemple, 220, 500, 1000 et 1500 grains) sur le côté coupé pendant environ 30 s.</li>
	<li>Effectuez l’imagerie de surface des échantillons à l’aide de techniques telles que LA-ICP-MS. REMARQUE: Pour préparer des sections minces pour S-XRF, envoyez les échantillons à une entreprise capable de préparer les sections minces (polissage simple ou double face) ou suivez les étapes 4.4 à 4.6 décrites ci-dessous.</li>
	<li>Collez le côté de l’échantillon souhaité sur une lame de quartz à l’aide de super colle et laissez durcir pendant la nuit.</li>
	<li>À l’aide d’une fine machine à sectionnement, coupez le sol sur des lames jusqu’à 2 mm d’épaisseur, puis broyez jusqu’à l’épaisseur souhaitée (généralement 30 μm). La surface de l’échantillon peut être polie si vous le souhaitez.</li>
	<li>Effectuez l’imagerie S-XRF des sections. Suivez les étapes appropriées à l’installation synchrotron et à la ligne de faisceau souhaitées pour demander et utiliser le temps d’imagerie.</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cet article décrit un protocole pour obtenir un sol en vrac préservé + rhizosphères de racines de plantes de zones humides en utilisant une technique de congélation slam qui peut être utilisée pour l’imagerie élémentaire et / ou la cartographie de la spéciation chimique.
Cette méthode présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes existantes. Tout d’abord, cette méthode permet l’étude simultanée des racines et des rhizosphères environnantes. Il existe actuellement des méthodes pour prés...

Les racines et leurs rhizosphères sont dynamiques, hétérogènes et d’une importance cruciale pour comprendre comment les plantes obtiennent des nutriments minéraux et des contaminants1,2,3. Les racines sont la principale voie par laquelle les nutriments (p. ex., le phosphore) et les contaminants (p. ex., l’arsenic) se déplacent du sol aux plantes et, par conséquent, la compréhension de ce processus a des répercussions sur la quantité et la qualité des aliments, le fonctionnement de l’écosystème et la phytoremédiation. Cependant, les racines sont dynamiques dans l’espace et le temps en croissance en réponse aux besoins d’acquisition de nutriments et elles varient souvent en fonction, en diamètre et en structure (par exemple, racines latérales, racines adventices, poils racinaires)2. L’hétérogénéité des systèmes racinaires peut être étudiée à l’échelle spatiale, du niveau cellulaire au niveau de l’écosystème et à l’échelle temporelle, de l’heure au décennal. Ainsi, la nature dynamique et hétérogène des racines et de leur sol environnant, ou rhizosphère, pose des défis pour capturer la chimie de la rhizosphère au fil du temps. Malgré ce défi, il est impératif d’étudier les racines dans leur environnement de sol pour caractériser cette relation critique plante-sol.
La chimie de la rhizosphère des plantes des zones humides est particulièrement difficile à étudier en raison des gradients d’oxygène abrupts qui existent du sol en vrac aux racines, qui changent dans l’espace et le temps. Parce que les racines ont besoin d’oxygène pour respirer, les plantes des zones humides se sont adaptées aux conditions de faible teneur en oxygène des sols des zones humides en créant un aerenchyma4,5. Les aéréchymes sont des tissus corticaux évidés qui s’étendent des pousses aux racines, permettant la diffusion de l’air à travers la plante dans les racines. Cependant, une partie de cet air s’échappe dans la rhizosphère dans les parties moins subérisées des racines, en particulier près des jonctions latérales des racines, des extrémités des racines moins matures et des zones d’allongement6,7,8,9. Cette perte radiale d’oxygène crée une zone oxydée dans la rhizosphère des plantes des zones humides qui affecte la rhizosphère (bio-géo)chimie et est distincte du sol en vrac réduit10,11,12. Pour comprendre le devenir et le transport des nutriments et des contaminants dans les rhizosphères et les racines des zones humides, il est essentiel de préserver le sol en vrac chimiquement réduit, la rhizosphère oxydée et les racines des plantes des zones humides pour analyse. Cependant, comme le sol en vrac contient des constituants réduits du sol qui sont sensibles à l’oxygène, les méthodes de préservation des racines et du sol doivent préserver les structures racinaires et minimiser les réactions sensibles à l’oxygène.
Il existe des méthodes pour fixer les tissus végétaux et préserver l’ultrastructure pour l’imagerie, mais ces méthodes ne peuvent pas être appliquées pour préserver chimiquement les racines qui poussent dans le sol des zones humides. Pour les études où seule la distribution élémentaire dans les cellules végétales est souhaitée, les plantes sont généralement cultivées en hydroponie et les racines peuvent être facilement retirées de la solution, fixées sous congélation à haute pression et substitution par congélation et sectionnées pour une variété d’applications d’imagerie, y compris la spectrométrie de masse ionique secondaire à haute résolution (nanoSIMS), la microscopie électronique et l’analyse synchrotron par fluorescence X (S-XRF)13, 14,15. Pour étudier la plaque de Fe à l’extérieur des racines des zones humides, ces études hydroponiques doivent induire artificiellement la formation de plaque de Fe dans la solution16, qui ne représente pas avec précision l’hétérogénéité de la distribution et de la composition minérale de la formation de plaque de Fe et des éléments associés in situ17,18,19,20. Des méthodes existent pour préserver le sol des zones humides et les micro-organismes associés au carottage par congélation21, mais il est difficile d’obtenir des racines avec cette technique. Les méthodes actuelles pour visualiser les racines qui poussent dans le sol et leur chimie rhizosphérique se composent de deux types de mesure primaires: les flux élémentaires et la concentration élémentaire totale (et la spéciation). Le premier est généralement mesuré à l’aide de gradients diffusifs dans des couches minces (DGT)22,23,24, dans lesquelles le sol est placé dans des rhizoboxes pour soutenir la croissance des plantes en laboratoire et les éléments labiles dans le sol diffusent à travers un gel dans une couche de liaison. Cette couche de liaison peut ensuite être imagée pour quantifier les éléments labiles d’intérêt. Cette technique peut illustrer avec succès les relations entre les racines et la rhizosphère24,25,26,27, mais des artefacts provenant de la délimitation des racines peuvent exister en cultivant des plantes dans des rhizoboxes, et les informations sur l’intérieur des racines ne sont pas capturées avec DGT. Ce dernier implique l’échantillonnage des racines et de la rhizosphère, la préservation de l’échantillon et l’analyse directe de la distribution élémentaire sur une section d’échantillon. Pour cet échantillonnage environnemental des racines des plantes des zones humides et de leur rhizosphère environnante, une manipulation minutieuse des échantillons est nécessaire pour éviter les artefacts provenant de la préparation des échantillons.
Ici, un protocole est décrit qui préserve efficacement les structures racinaires et la chimie de la rhizosphère des plantes des zones humides par congélation et lyophilisation. La congélation éclair peut ralentir considérablement les transformations des solutés sensibles à l’oxygène, mais peut endommager les racines et provoquer une mobilisation lorsque les échantillons se dessèchent. Cependant, la congélation par claquement où l’échantillon est congelé entre des blocs de cuivre pré-refroidis avec de l’azote liquide minimise les dommages aux racines et la distorsion de l’échantillon28. Les échantillons conservés sont ensuite incorporés dans une résine époxy qui préserve la spéciationAs 20,29 et peut être coupée et polie pour l’imagerie des racines dans leur sol de rhizosphère. Les échantillons de ce rapport ont été analysés par imagerie de spéciation chimique S-XRF après sectionnement mince. Cependant, d’autres techniques d’imagerie pourraient également être utilisées, notamment la spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif par ablation laser (LA-ICP-MS), l’émission de rayons X induite par particules (PIXE), la spectrométrie de masse ionique secondaire (SIMS) et l’imagerie par spectroscopie de dégradation induite par laser (LIBS).

<table><tbody><tr><td>Blocs de cuivre</td><td>McMaster Carr</td><td>89275K42</td><td></td></tr><tr><td>Lame diamantée</td><td>Buehler</td><td>15 LC, 102 mm x 0,3 mm</td><td>Vitesse de fonctionnement : 225 tr/min</td></tr><tr><td>Formes époxy</td><td>Struers</td><td>40300085</td><td>FixiForm</td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>Epotek</td><td>301-2FL</td><td></td></tr><tr><td>Superglue</td><td>Loctite</td><td>404</td><td></td></tr><tr><td>Tronçonneuse</td><td>mince Buehler</td><td>PetroThin</td><td></td></tr><tr><td>Scie humide</td><td>Buehler</td><td>IsoMet 1000</td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode pour préserver les racines et les rhizosphères des zones humides pour l’imagerie élémentaire

A Method to Preserve Wetland Roots and Rhizospheres for Elemental Imaging

Les racines interagissent beaucoup avec leur environnement de sol, mais il est difficile de visualiser de telles interactions entre les racines et la rhizosphère environnante. La chimie de la rhizosphère des plantes des zones humides est particulièrement difficile à capturer en raison des gradients d’oxygène abrupts des racines au sol en vrac. Ici, un protocole est décrit qui préserve efficacement la structure racinaire et la chimie de la rhizosphère des plantes des zones humides grâce à la congélation et à la lyophilisation. La congélation slam, où l’échantillon est congelé entre des blocs de cuivre pré-refroidis avec de l’azote liquide, minimise les dommages aux racines et la distorsion de l’échantillon qui peuvent se produire avec la congélation éclair tout en minimisant les changements de spéciation chimique. Bien que la distorsion de l’échantillon soit encore possible, la possibilité d’obtenir plusieurs échantillons rapidement et à un coût minimal augmente le potentiel d’obtenir des échantillons satisfaisants et optimise le temps d’imagerie. Les données montrent que cette méthode réussit à préserver les espèces d’arsenic réduites dans les racines de riz et les rhizosphères associées aux plaques de fer. Cette méthode peut être adoptée pour l’étude des relations plantes-sol dans une grande variété d’environnements de zones humides qui couvrent des plages de concentration allant du cycle des oligo-éléments aux applications de phytoremédiation.

Cette méthode permet de préserver les racines et les espèces chimiques dans les racines et la rhizosphère des plantes des zones humides et dans le sol en vrac. Dans ce travail, la méthode a été utilisée pour évaluer la spéciation as et la co-localisation avec les oxydes de Fe et Mn et les nutriments des plantes dans la rhizosphère du riz (Oryza sativa L.). Le riz a été cultivé à l’installation RICE de l’Université du Delaware où 30 mésocosmes de rizières (2 m x 2 m, 49 plantes chacun) sont utilisés pour cultiver...

Nous décrivons un protocole pour échantillonner, préserver et sectionner les racines intactes et le sol de la rhizosphère environnante dans les milieux humides en utilisant le riz(Oryza sativa L.) comme espèce modèle. Une fois conservé, l’échantillon peut être analysé à l’aide de techniques d’imagerie élémentaire, telles que l’imagerie par spéciation chimique par fluorescence X synchrotron (XRF).

Une méthode pour préserver les racines et les rhizosphères des zones humides pour l’imagerie élémentaire

Roots extensively interact with their soil environment but visualizing such interactions between roots and the surrounding rhizosphere is challenging. The ...

Cette méthode offre aux chercheurs une nouvelle façon de préparer les racines des plantes aquatiques, la rhizosphère environnante et le sol en vrac pour les techniques d’imagerie élémentaire. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle est relativement rapide et abordable tout en préservant avec précision la distribution et la spéciation des éléments d’intérêt. Cette technique peut être utilisée pour répondre à des questions concernant de nombreux éléments et systèmes végétaux, des nutriments dans les systèmes agricoles au devenir et au transport des contaminants dans les systèmes de entraves.Assurez-vous de travailler rapidement tout en étant conscient de la ou des zones souhaitées du système racinaire pour l’échantillonnage. Et prélever plusieurs échantillons par système racinaire. Pour préparer l’équipement de congélation slam pour une expérience, placez deux, cinq par cinq par 15 centimètres de blocs de cuivre horizontalement dans un refroidisseur propre capable de contenir de l’azote liquide.Et en portant l’EPI approprié, versez suffisamment d’azote liquide dans la glacière pour immerger les blocs. Une fois que le bouillonnement s’estompe, placez une entretoise à chaque extrémité d’un bloc de cuivre. Ensuite, à l’aide de pinces et de gants cryogéniques, tenez l’autre blog en cuivre à son extrémité pour faciliter la récupération lorsque l’échantillon est en place.Pour prélever l’échantillon, utilisez une plante en pot ou utilisez une pelle pour commencer à extraire la plante et la rhizosphère souhaitées du sol humide, en faisant en sorte que le trou creusé soit beaucoup plus grand que le volume racinaire souhaité. Utilisez une lame en acier pour couper tout excès de sol, en prenant soin de ne pas déranger le sol dans la zone souhaitée. Lorsque les zones souhaitées atteignent, coupez un cube de racine d’environ trois par trois par deux centimètres et placez immédiatement le cube entre les deux entretoises sur le bloc de cuivre horizontal.Pour une congélation slam de l’échantillon, utilisez les gants cryogéniques pour placer le bloc de cuivre vertical sur les entretoises pendant environ cinq minutes. Lorsque le bouillonnement s’estompe, transférez l’échantillon de cube de rhizosphère congelé dans un morceau de carré de feuille d’aluminium pré-étiqueté. Pour lyophilisation des cubes de sol, lorsque le lyophilisateur a atteint la pression et la température de vide appropriées, placez un échantillon de cube de rhizosphère congelé pour un tube de 50 millilitres propre et lavé à l’acide ou directement dans le lyophilisateur et utilisez une lingette jetable propre pour empêcher la poussière de pénétrer dans la pompe à vide.Placer les échantillons dans le lyophilisateur pendant au moins quelques jours jusqu’à ce qu’ils mettent à sec. Lorsque les tissus ont été lyophilisés, utilisez une lame en acier pour sécher les cubes de sol à une taille appropriée pour l’analyse avant de placer les cubes sous forme étiquetée à l’intérieur d’un dessiccateur sous vide. Après avoir préparé l’époxy conformément aux instructions du fabricant, utilisez un compte-gouttes pour ajouter lentement de l’époxy à la forme d’un côté du sol, jusqu’à ce que l’époxy recouvre entièrement l’échantillon.Le sol s’assombrit en couleur à mesure que l’époxy mouille le sol. Une fois les formulaires remplis d’époxy, fermez le dessiccateur et allumez le vide. Vérifiez le niveau d’un époxy toutes les 30 à 90 minutes pendant les quatre premières heures, en ajoutant de l’époxy supplémentaire si nécessaire.Une fois que l’époxy a durci, retirez l’échantillon. Après l’encastrement, utilisez une scie humide de précision à lame diamantée pour couper l’échantillon. Coupez l’échantillon dans une direction différente si aucune racine n’est obtenue lors de la coupe précédente.Après la coupe, poncez manuellement le côté coupé de chaque échantillon avec du papier de verre de plus en plus fin pendant 30 secondes par taille de grain. Dans cette figure, plusieurs diamètres de racines peuvent être observés dans la matrice du sol sous forme de sections transversales. Les racines peuvent démontrer différents niveaux de qualité.Par exemple, dans cette image, on peut observer une racine bien conservée, une racine déformée par le processus de lyophilisation et une racine qui a été retirée pendant le processus de coupe mince. L’analyse de cette section transversale de la racine avec une racine latérale en section longitudinale par imagerie synchrotron par fluorescence X telle que démontrée permet la détection du fer, du manganèse et de l’arsenic. La présence de fer dans le sol et entourant la racine dans la plaque de fer est également visible dans les images de micrographie lumineuse.Le manganèse est présent de manière unique dans le cortex de la racine latérale, mais co-localise également avec le fer dans certaines zones de la plaque de fer sous forme de teinte vert-bleu. L’arsenic se trouve principalement dans le système vasculaire de la racine latérale qui fusionne avec le système vasculaire de la racine primaire. L’imagerie par spéciation chimique révèle une variabilité dans la localisation des espèces d’arsenic.Comme observé dans ce diagramme tricolore, l’arsénite et l’arsénite glutathion sont étroitement associés dans le système vasculaire, tandis que l’arséniate se localise principalement à l’extérieur de la racine, associée à la plaque de fer. Avant le prélèvement de l’échantillon, déterminez la partie souhaitée du système racinaire pour l’imagerie élémentaire. Cela dictera l’orientation de l’emplacement de la clé racine supprimée.En suivant ce protocole, les échantillons peuvent être imagés à l’échelle du micron ou plus grossier à l’aide d’une variété de techniques, en fonction des questions de recherche spécifiques, des éléments d’intérêt ou de l’instrumentation disponible.

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