Dissection efficace et culture des cellules épithéliales rétiniennes primaires de pigment de souris

Ce protocole permet l’isolement efficace et la culture des cellules RPE souris. Les cultures primaires saines d’EPR de souris sont des modèles valables pour comprendre les mécanismes des maladies oculaires sous-jacentes. Les cultures d’EPR confluentes et viables obtiennent dans les trois jours et peuvent être cultivées pendant des semaines.

Ce protocole a été utilisé avec succès pour comprendre les mécanismes sous-jacents à la dégénérescence maculaire liée à l’âge précoce, qui est la principale cause de cécité chez les personnes âgées dans les pays développés. Il est important de visualiser les étapes de dissection. Les détails sont essentiels pour le succès du protocole, par exemple, comment manipuler les globes oculaires afin que la sclère n’est pas perforée, où exactement les coupes doivent être effectuées, et comment intégrer les tasses oculaires dans la trypsine afin qu’ils restent ouverts.

Commencez par préparer tous les reagents nécessaires pour le protocole. Ensuite, commencez à nettoyer le globe oculaire en enlevant soigneusement tous les tissus conjonctifs, le sang et les muscles, en utilisant Dumont numéro cinq forceps et ciseaux inclinés, sans faire de coupures dans la sclère. Transférez régulièrement le globe oculaire dans un plat frais contenant trois millilitres de tampon HBSS sans HEPES pour garder l’œil frais et propre et éviter toute contamination.

Utilisez le nerf optique comme poignée pour tenir le globe oculaire et faire un trou au centre de la cornée avec une lame en acier carbone pointu numéro 11. Faire trois incisions dans la cornée à travers le trou avec Dumont numéro cinq ciseaux, en veillant à ce qu’il y ait suffisamment d’espace pour enlever la lentille. Maintenez le nerf optique et appliquez une légère pression sur l’ora serrata avec la base des ciseaux inclinés, jusqu’à ce que la lentille sort complètement.

Gardez l’épithélium de l’iris intact pour empêcher le décollement de la rétine neurale et de l’EPR pendant l’incubation. Placez l’œil dans le tampon HBSS sans HEPES. Incuber les yeux sans lentilles dans la solution hyaluronidase à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes dans un incubateur aéré de dioxyde de carbone de 5% pour détacher la rétine neurale de l’EPR.

Placez chaque œil dans un nouveau puits avec 1,5 millilitres de tampon HBSS HEPES froid par puits et incubez-le sur la glace pendant 30 minutes. Après le lavage, placez chaque œil dans un plat de culture de 35 millimètres avec tampon HBSS HEPES frais. Couper la cornée à travers les incisions d’origine avec huit centimètres de ciseaux Vannas jusqu’à ce que l’ora serrata est atteint, puis couper en dessous de l’ora serrata pour enlever l’épithélium de l’iris et la cornée.

Tenez l’ora serrata avec des pinces incurvées et à l’aide de pinces micro inclinées, retirez la rétine neurale, en vous assurant que la couche RPE n’est pas coupée. Ensuite, coupez l’attachement interne au nerf optique. Couper le nerf optique et transférer chaque tasse à yeux dans une autre plaque de 12 puits contenant 1,5 millilitres de trypsine fraîche-EDTA par puits.

Assurez-vous que les cils restent ouverts et complètement immergés dans la trypsine. Incuber les cils à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5 %. Recueillir chaque tasse à yeux avec toutes les feuilles rpe détachées pendant l’incubation de la trypsine et les transférer dans une plaque de 12 puits contenant 1,5 millilitres de solution FBS par puits.

Si les feuilles RPE restent dans la solution trypsine, utilisez une micropipette pour les transférer au puits avec la solution FBS. Tenez chaque tasse oculaire près du nerf optique et secouez-la face vers le bas dans la plaque de puits de 12 contenant 1,5 millilitres de 20% FBS dans le tampon HBSS HEPES jusqu’à ce que le détachement complet des feuilles rpe soit atteint. Recueillir les feuilles de RPE et les grappes rpe avec une micropipette, en évitant les morceaux blancs de scléra ou choroïde, qui pourraient contaminer les cultures, et les placer dans un tube de 15 millilitres.

Tirez deux yeux de la même souris dans un tube. Ensuite, centrifugez le mélange d’EPR à 340 x g pendant deux minutes à température ambiante et jetez le supernatant. Resuspendez doucement la pastille RPE dans un mélange d’un millilitre de 0,25% trypsine-EDTA et incubez-la pendant une minute dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pour désaggréger les feuilles d’EPR en cellules individuelles.

Puis pipette doucement de haut en bas 10 fois, en évitant la formation de bulles. Ajouter neuf millilitres de rpe moyen fraîchement préparé pour diluer et inactiver la trypsine et centrifugeuse le mélange à 340 x g pendant deux minutes à température ambiante. Aspirer le supernatant et soigneusement resuspendre la pastille cellulaire dans 150 microlitres de milieu RPE avec 5%FBS.

Ensuite, retirez le PBS de la chambre inférieure de l’insert membrane enduite de laminine précédemment préparée et ajoutez-y 700 microlitres de milieu RPE. Retirer la laminine de la chambre haute de l’insert membrane et distribuer la suspension cellulaire RPE drop-wise et uniformément au centre de la chambre. Placez l’insert membrane intacte dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant au moins 24 heures.

Ensuite, vérifiez l’insertion de la membrane sous le microscope pour s’assurer que la plupart des cellules RPE sont attachés à l’insert et la confluence est d’au moins 50%Ne changez pas le média au cours des 72 premières heures. Les cellules de RPE isolées utilisant ce protocole ont montré la taille typique de RPE, la morphologie, et la pigmentation. Un monocouche RPE fortement polarisé avec deux noyaux joints par des jonctions serrées, avec la présence de microvilli apical et d’infoldings basiques, a été observé après une semaine.

La polarisation du monocouche RPE a été confirmée par les valeurs TER, avec une moyenne supérieure à 200 ohms centimètre carré, qui est restée stable au fil du temps. Dans les analyses de phagocytose effectuées sur le POS bovin étiqueté FITC, l’engloutissement et la digestion du POS ont été observés, indiquant la formation d’un monocouche confluent fonctionnel des cellules de RPE. Les cultures viables nécessitent un temps de dissection court, ce qui est réalisé avec l’expérience.

Certaines cellules RPE peuvent rester attachées à la rétine neurale, mais si plusieurs feuilles de RPE restent attachées, le protocole ne réussira pas. Les hyaluronidase fraîches doivent être utilisées à chaque fois pour prévenir ce problème. Ces cultures fonctionnelles primaires de cellules de RPE de souris sont un outil valable pour étudier la pathobiologie de l’EPR dans beaucoup de maladies oculaires.

Par exemple, ce protocole a permis d’étudier la pathobiologie de l’EPR dans un modèle mural de dégénérescence maculaire.