Hydrogels supramoléculaires injectables de polymères-nanoparticules pour les applications cellulaires et d’administration de médicaments

Notre protocole facilite la formulation d’hydrogels polymères-nanoparticules pour une utilisation comme biomatériaux. Nous espérons que les chercheurs développeront ce matériel pour des applications translationnelles et pour explorer les questions biologiques de base. Les hydrogels PNP sont facilement injectés par des aiguilles et des cathéters de petit diamètre, mais s’auto-guérissent rapidement après l’injection.

Cela permet l’administration contrôlée non invasive de médicaments et de cellules sur de longues échelles de temps. Cette technologie repousse les limites d’un traitement localisé et d’une libération prolongée de médicaments, avec des implications pour de vastes conditions déchaînées allant du cancer à la régénération des tissus en passant par l’immunisation passive. Pour synthétiser des nanoparticules par nano précipitation, ajoutez 50 milligrammes de polymère PEG-PLA à un flacon de scintillation en verre de huit millilitres et ajoutez un millilitre d’acétonitrile au flacon.

Vortex à dissoudre complètement. Ajoutez ensuite 10 millilitres d’eau ultra pure à un flacon de scintillation en verre de 20 millilitres avec une petite barre d’agitation et placez le flacon sur une plaque d’agitation réglée à 600 tours par minute. Utilisez une pipette de 200 microlitres pour ajouter un millilitre de la solution de solvant polymère goutte à goutte dans le flacon d’eau.

Des nanoparticules noyau-enveloppe se formeront lorsque la solution de solvant polymère sera rapidement dispersée dans l’eau. Vérifiez la taille des particules par diffusion dynamique de la lumière selon les protocoles standard. Ensuite, transférez la solution de nanoparticules dans une unité de filtre centrifuge pour concentrer la solution sur moins de 250 microlitres et ressuscitez les nanoparticules dans un tampon approprié.

Pour préparer l’hydrogel, ajoutez 333 milligrammes de solution mère HPMC-C12 à 6% à une seringue à verrouillage Luer d’un millilitre et ajoutez 500 microlitres de la solution mère de nanoparticules à 20% et 167 microlitres de PBS à un flacon de huit millilitres. Après le mélange, utilisez une aiguille pour remplir une autre seringue luer millilitre avec la solution de nanoparticules diluée et fixez les deux seringues à un mélangeur de coude. Mélanger les deux solutions pendant environ 60 cycles jusqu’à ce qu’un matériau d’hydrogel blanc homogène et opaque se soit formé.

Pour mesurer les propriétés rhéologiques de l’hydrogel formulé, injectez le volume approprié d’hydrogel en fonction de l’écart de géométrie sélectionné au centre d’une plaque de rhéomètre dentelée et utilisez des tests oscillatoires et d’écoulement pour mesurer les propriétés mécaniques de l’échantillon. Pour caractériser la libération de médicament de l’hydrogel, tout d’abord, préparer un capillaire en verre en utilisant de l’époxy pour sceller une extrémité de chaque tube. Lorsque l’époxy est réglé, utilisez une aiguille hypodermique de calibre 22 de quatre pouces pour injecter 100 à 200 microlitres d’hydrogel dans un minimum de trois tubes par échantillon, et ajoutez soigneusement 200 à 300 microlitres de PBS sur chaque volume d’hydrogel.

Aux moments appropriés, selon l’échelle de temps prévue pour la libération du médicament, utilisez une aiguille pour retirer soigneusement le PBS de chaque capillaire sans perturber la surface de l’hydrogel et ajouter un nouveau volume de PBS. À la fin de l’étude, analyser les aliquotes du PBS recueillies à l’aide d’une méthode appropriée pour quantifier la quantité de médicament libérée à chaque moment. Pour caractériser la stabilité thermique de l’insuline encapsulée en gel, chargez à la fois l’insuline et la thioflavine T dans l’hydrogel comme démontré et utilisez une aiguille de calibre 21 pour injecter 200 microlitres de la cargaison et sondez l’hydrogel chargé dans au moins trois puits d’une plaque noire de 96 puits par échantillon.

Ensuite, scellez la plaque avec un joint de plaque adhésive optiquement claire pour éviter l’évaporation et insérez la plaque dans un lecteur de plaque équipé d’un contrôle de la température, d’une secousse et d’une programmation de lecture cinétique. Pour évaluer la viabilité des cellules encapsulées par hydrogel, utilisez une aiguille de calibre 21 pour injecter 150 microlitres d’hydrogel contenant la concentration appropriée de cellules dans chacun des trois puits par échantillon dans une plaque claire de 96 puits et ajoutez 100 microlitres du milieu cellulaire approprié dans chaque volume d’hydrogel. Le premier jour de la culture, remplacer le surnageant sur chaque hydrogel au point de temps approprié pour chaque groupe d’échantillon par 50 microlitres de deux solution millimolaires de calcine AM.

Après une incubation de 30 minutes, imagez le centre de chaque puits par microscopie confocale. Pour évaluer la capacité des cellules encapsulées à se déposer dans une seringue avant l’injection, diluer les cellules d’intérêt à un fois 10 aux six cellules par millilitre en concentration de PBS et colorer les cellules avec 50 microlitres de deux calcines millimolaires AM pendant 10 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, mélanger les cellules avec 500 à 700 microlitres d’hydrogel comme démontré et utiliser une aiguille de calibre 21 pour injecter 100 à 200 microlitres de cellules contenant de l’hydrogel dans le fond d’au moins une cuvette par échantillon.

Ensuite, imaginez les cuvettes à plat sur le côté sur la scène d’un microscope confocal immédiatement après l’injection et à une et quatre heures après l’ensemencement pour observer si les cellules se sont déposées dans l’hydrogel ou si elles sont restées en suspension. Les capacités d’amincissement par cisaillement et d’auto-guérison du gel peuvent être observées à l’aide de protocoles de balayage d’écoulement et de cisaillement par étapes, respectivement. La caractérisation des modules de stockage et de perte à l’aide d’une expérience de balayage de fréquence de cisaillement oscillatoire dans le régime viscoélastique linéaire à des gammes de fréquences de 0,1 à 100 radians par seconde révèle les propriétés solides.

Il ne devrait généralement pas y avoir de croisement des modules de stockage et de perte de cisaillement observés à basse fréquence pour des formulations plus rigides, tandis que des événements de croisement peuvent être attendus pour des formulations d’hydrogel plus faibles. La variation de la teneur en polymère des hydrogels PNP peut avoir un impact direct sur la diffusion de la cargaison à travers le réseau polymère et le taux de libération des matériaux. Les hydrogels PNP peuvent également stabiliser les cargaisons sensibles à l’instabilité thermique, prolongeant considérablement la durée de conservation de la cargaison et réduisant la dépendance à l’égard du stockage et de la distribution de la chaîne du froid.

L’inclusion de motifs d’intégrine peut être utile pour adapter des hydrogels de PNP pour des thérapies cellulaires. Les cellules encapsulées peuvent être étiquetées par fluorescence pour faciliter leur visualisation et leur quantification. Par exemple, les formulations dépourvues de sites d’adhésion auront une faible viabilité cellulaire car les cellules encapsulées ne prolifèrent pas par rapport aux cellules encapsulées et aux formulations avec des motifs d’adhésion, telles que RGD.

Nous explorons toujours comment les changements dans la formulation affectent les caractéristiques rhéologiques et le maillage dynamique de la matrice polymère. Nous utilisons également le FRAP pour étudier la diffusion des molécules dans l’hydrogel. Ces documents peuvent être utilisés pour poser de nouvelles questions biologiques sur la façon dont l’administration prolongée pourrait affecter l’administration de médicaments, la mise au point de vaccins ou l’immunothérapie du cancer.