Analyse multiplexée de l’expression génique rétinienne et de l’accessibilité de la chromatine à l’aide de scRNA-Seq et scATAC-Seq
March 12th, 2021
Ici, les auteurs démontrent l’utilité de MULTI-seq pour le phénotypage et les scRNA-seq et scATAC-seq appariés ultérieurs dans la caractérisation des profils d’accessibilité transcriptomique et chromatine dans la rétine.
Ce protocole permettra l’utilisation d’un séquençage d’ARN unicellulaire pour le phénotypage initial. Et, lorsqu’il est associé à un ATAC-seq unicellulaire, la reconstruction de réseaux de régulation génique. L’utilisation de MULTI-seq maintient les coûts bas pour l’investigation initiale, et la fixation d’échantillons appariés pour le séquençage d’ARN unicellulaire et le séquençage ATAC unicellulaire permet une analyse temporelle des réseaux de régulation génique.
Les chercheurs peuvent utiliser ce protocole pour comprendre les réseaux génétiques contrôlant le développement et la progression de la maladie. Pour commencer, ajoutez 20 microlitres de solution de code-barres d’ancrage à chaque échantillon et pipetez-le pour mélanger. Incuber sur la glace pendant cinq minutes.
Ajoutez ensuite 20 microlitres de solution de co-ancrage à chaque échantillon et incuber sur de la glace pendant cinq minutes supplémentaires. Ajouter un millilitre de 1% de BSA et de PBS glacés à chaque échantillon et centrifuger les cellules à 300 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant sans déranger la pastille de cellule.
Ajoutez ensuite 400 microlitres de glaçon 1% BSA et PBS. Centrifuger à 300 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Déterminer la concentration de cellules pour chaque échantillon à l’aide d’un hémocytomètre et calculer le nombre total de cellules et le volume requis pour le Gel Bead-In-Emulsion ou GEM.
Combinez les volumes calculés de chaque échantillon dans un nouveau tube stérile de 1,5 millilitre et déterminez la concentration cellulaire finale des échantillons combinés. Après la génération du GEM et le codage à barres, effectuer le nettoyage de l’ADNc d’expression génique en utilisant la sélection de la taille, en veillant à ne pas jeter le surnageant du premier tour de sélection, qui contient le code-barres de l’échantillon. Transférez le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge stérile de 1,5 millilitre et stockez-le sur de la glace.
Vortex le réactif de sélection de taille à base de billes paramagnétiques et ajouter 260 microlitres du réactif et 180 microlitres d’isopropanol à 100% au surnageant. Pipeter le mélange 10 fois et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Placez le tube sur une grille magnétique et attendez que la solution soit effacée.
Une fois que la solution est claire, retirez et jetez le surnageant. Ajouter 500 microlitres d’éthanol à 80% aux billes pendant 30 secondes, puis jeter le surnageant. Répétez cette opération pour un total de deux lavages.
Centrifuger brièvement les billes et les remettre dans le rack magnétique. Réglez la minuterie sur deux minutes. Ensuite, retirez l’éthanol résiduel avec une pipette P10 et séchez à l’air libre les billes sur la grille magnétique pendant les deux minutes restantes.
Retirez les billes du support magnétique et remettez-les en suspension dans 100 microlitres de tampon d’élution. Pipeter soigneusement pour remettre en suspension et incuber à température ambiante pendant deux minutes, puis remettre les billes dans la grille magnétique et attendre que la solution se dissipe. Transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.
Répéter le nettoyage comme indiqué, en utilisant la moitié du volume de tampon d’élution. Pour les échantillons destinés à la séquence scATAC, retirer tout liquide du tube microcentrifuge à l’aide d’une pipette P200 et congeler les échantillons dans de la glace sèche à l’éthanol. Pour dissocier les cellules dans les échantillons destinés au séquençage de l’ARNsc, effectuez les étapes de dissociation en utilisant la papaïne, comme décrit dans le manuscrit.
Centrifuger les cellules à 300 x g pendant trois minutes à température ambiante et retirer le surnageant sans perturber la pastille de cellule. Ajouter un millilitre de PBS réfrigéré et mélanger 10 fois ou jusqu’à ce que les cellules soient complètement suspendues. Encore une fois, centrifuger à 300 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, et répéter le lavage avec PBS deux fois.
Commencez à faire tourbillonner le tube à la vitesse la plus basse et ajoutez 900 microlitres de méthanol réfrigéré, goutte à goutte, tout en continuant à vorter doucement le tube pour empêcher les cellules de s’agglutiner. Incuber les cellules sur la glace pendant 15 minutes. Déterminer la concentration des cellules fixes à l’aide d’un hémocytomètre et évaluer l’efficacité de l’étape de fixation à l’aide du bleu de trypan.
Conservez les tissus congelés et les cellules fixes à moins 80 degrés Celsius. Le codage à barres MULTI permet le séquençage combiné de plusieurs échantillons et leur déconvolution computationnelle ultérieure. L’échantillon d’origine peut être déterminé pour chaque cellule en fonction de leur expression de code-barres.
Ces échantillons combinés peuvent être analysés comme un seul ensemble de données aux fins du regroupement cellulaire et de l’identification du type de cellule. Étant donné que chaque cellule est codée à barres avant la génération GEM, les doublets cellulaires auront une forte probabilité de montrer l’expression de plusieurs codes-barres de séquence MULTI, et une majorité de doublets peuvent donc être identifiés et supprimés avant le regroupement et l’identification du type de cellule. Le séquençage ATAC unicellulaire peut être utilisé pour générer un ensemble de données avec des types de cellules correspondant à ceux trouvés par le séquençage d’ARN unicellulaire.
L’appariement de l’expression génique de séquençage de l’ARN unicellulaire et de l’information sur l’accessibilité de l’ADN du séquençage ATAC unicellulaire permet la reconstruction des réseaux de régulation des gènes. Lorsque vous essayez le protocole, gardez à l’esprit que le moment de deux minutes de l’évaporation ethnol est crucial pour la récupération de la séquence dans les étapes d’élution suivantes. La reconstruction de réseaux de régulation génique à l’aide d’un séquençage d’ARN unicellulaire apparié et d’un séquen-seq ATAC unicellulaire produit des cibles pour les études sur la surexpression génique et l’élimination des gènes.
MULTI-seq peut être utilisé à ce stade pour identifier les effets spécifiques du type cellulaire.
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Aperçu
Cette étude démontre l'application de MULTI-seq pour le phénotypage, suivie par le séquençage d'ARN simple cellule couplé (scRNA-seq) et le séquençage ATAC simple cellule (scATAC-seq) pour caractériser la transcriptomique et l'accessibilité de la chromatine dans les cellules rétiniennes. La méthode permet une investigation initiale rentable combinée à la capacité d'analyser les réseaux de régulation génique au fil du temps.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neuroscience
- Génomique
- Biologie cellulaire
Contexte
- Le scRNA-seq est utilisé pour le phénotypage initial.
- Le couplage avec le scATAC-seq permet la reconstruction des réseaux de régulation génique.
- MULTI-seq réduit les coûts des investigations initiales.
- Permet l'analyse au cours du temps des réseaux de régulation génique.
Objectif de l'étude
- Comprendre les réseaux génétiques contrôlant le développement.
- Investiguer la progression de la maladie à travers des aperçus cellulaires.
- Tirer parti de méthodologies rentables pour le séquençage à haut débit.
Méthodes utilisées
- Utilisation des plateformes scRNA-seq et scATAC-seq.
- Concentration sur les réponses des cellules rétiniennes.
- Emploi d'étapes critiques incluant incubation, centrifugation et codage de barres multiples.
- Processus détaillés pour la préparation des échantillons, la fixation et les étapes de séquençage.
Résultats principaux
- Démonstration de l'association efficace du scRNA-seq et du scATAC-seq pour un profilage complet.
- Identification d'ajustements dans l'expression génique et l'accessibilité de la chromatine à travers les échantillons rétiniens.
- Fourniture d'aperçus sur la dynamique des réseaux de régulation génique pendant le développement et la maladie.
Conclusions
- Cette étude améliore la compréhension des réseaux de régulation génique dans les cellules rétiniennes.
- Contribue directement à élucider les mécanismes liés au développement et à la maladie.
- Souligne les implications pratiques de l'utilisation de MULTI-seq pour l'analyse simple cellule à haut débit.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Understanding retinal gene regulatory networks is critical for identifying therapeutic targets in ocular diseases. The integration of scRNA-seq and scATAC-seq enables mechanistic de-risking by linking chromatin accessibility to transcriptional output. This approach supports target validation and predictive confidence in preclinical discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through paired gene expression and chromatin accessibility profiling.
- Operational Value: Supports biological de-risking by clarifying regulatory mechanisms in retinal cell types.
- Predictive Value: Identifies targets for overexpression and knockout studies to validate functional relevance.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates matched molecular readouts for compound screening in disease-relevant retinal models.
- Operational Value: MULTI-seq barcoding increases experimental throughput and reduces cost per sample.
- Scalability: Enables time-course analysis of gene regulatory networks across developmental or disease stages.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system insights by profiling retinal cells across conditions.
- Operational Value: Fixation and barcoding steps allow sample preservation and multi-sample coordination.
- Translational Continuity: Supports biomarker alignment by linking chromatin states to cell-type-specific expression.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, enabling hypothesis testing and pathway clarification before compound screening.
- Discovery Biology: Supports reconstruction of gene regulatory networks to clarify mechanism of action.
- Screening: Prepares standardized, barcoded retinal cell systems for reliable compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of gene expression and chromatin accessibility for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation through matched multi-omic profiles.
- Enterprise Reuse: MULTI-seq enables cost-effective sample multiplexing across projects and time points.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through mechanistic linkage of epigenomic and transcriptomic states.
- Operational Value: Standardization via fixation, barcoding, and cleanup protocols ensures reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing ambiguity in target biology.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of retinal targets based on regulatory network activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell genomics and retinal tissue dissociation.
- Depends on access to scRNA-seq and scATAC-seq platforms and magnetic bead-based size selection.
- Necessitates cross-team standardization for barcode design and sample handling.
- Involves adaptation considerations for fixation efficiency across retinal cell types.
- Limited by doublet formation risk if barcode separation is insufficient during elution.
