Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules fœtales du syndrome de Turner (45XO) pour la modélisation en aval des déficits neurologiques associés au syndrome

Le syndrome de Turner est une maladie rare associée à un chromosome X complètement ou partiellement manquant. Le syndrome est caractérisé par l’infertilité, la petite taille, les troubles cardiovasculaires et les défauts neurocognitifs. Dans certains cas, il provoque la mort fœtale.

Bien que les cellules somatiques des fœtus aneuploïdes soient biologiquement précieuses, elles sont de courte durée, limitant ainsi leur utilisation dans la recherche. La génération d’iPSC est donc une méthode efficace de préparation cellulaire pour la conservation perpétuelle des caractères aneuploïdes. Ils se renouvellent automatiquement et peuvent se différencier en types cellulaires spécialisés qui rappellent le développement embryonnaire précoce.

L’administration de plasmides de reprogrammation épisomique non intégrateurs par fiction nucléaire est une méthode efficace et reproductible pour générer des IPSC complètement reprogrammés et stables. Cette méthode peut également être utilisée sur des cellules difficiles à programmer. Dans ce protocole, nous décrivons la régénération des CSPe à partir de matériel fœtal avec anéliod.

Transférer les villosités chorioniques fœtales collectées dans une boîte de Petri stérile. Lavez-le plusieurs fois avec du PBS contenant 1X solution antibiotique antimycotique. Retirez complètement le PBS par pipetage.

Ajouter 1 ml de mélange de collagénase aux villosités et incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes ou jusqu’à ce que le tissu se désintègre. Après incubation, neutraliser la collagénase en ajoutant un milieu contenant 10% de sérum bovin fœtal. Transférer le contenu de la boîte de Petri dans un tube de 15 ml.

Centrifugez le digest pour recueillir les villosités désintégrées et les cellules libérées. Décantez soigneusement le surnageant. Les villosités désintégrées sur plaque ainsi que les cellules libérées dans une fiole de culture T25 et un milieu AmnioMAX et se développent jusqu’à l’obtention d’une culture de fibroblastes confluents.

Développer les fibroblastes et la culture pour préparer les stocks en pour une utilisation dans des expériences ultérieures de transfection et de caractérisation. Préparer des cultures d’alcalis contenant les plasmides de reprogrammation. Isolez les plasmides à l’aide du kit de purification du plasmide Midi, conformément aux instructions du fabricant.

Re-suspendez chaque palette dans un volume approprié d’eau sans ARNi de DNAse pour obtenir une concentration finale de 1 microgramme par millilitre. Vérifiez les plasmides à l’aide du kit de digestion de restriction ECoR1, en suivant les instructions du fabricant. Trypsiniser les fibroblastes de villosités chorioniques.

Neutraliser et centrifuger pour collecter les cellules. Décantez le surnageant et re-suspendez les cellules dans 5 ml d’OPTI-MEM. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et retirez 1 million de cellules pour la nucléofection.

Centrifugeuse pour obtenir une palette de cellules. Effectuez une nucléofection à l’aide du kit Amaxa NHDF Neucleofactor. Préparer le réactif neucléofactoriel en mélangeant un supplément de 0,5 mL et une solution de nucléofacteur de 2,25 mL fournis dans le kit.

Retirez 100 microlitres de solution de nucléofacteur et ajoutez-y 1 microgramme de chaque plasmide. Re-suspendez doucement 1 million de cellules dans ce mélange. Transférer la suspension d’ADN cellulaire dans la cuvette, en s’assurant que l’échantillon recouvre le fond de la cuvette sans bulles d’air.

Coiffez la cuvette et insérez-la dans le support. Sélectionnez le programme de nucléofacteur D-23 pour une efficacité élevée et appliquez. Retirez la cuvette du support et ajoutez 1 mL de support AmnioMAX.

Transférer doucement le contenu dans une boîte de Petri traitée par culture tissulaire, à l’aide de la pipette fournie dans le kit. Incuber les cellules dans un incubateur à dioxyde de carbone humidifié à 37 degrés Celsius. Maintenez les cellules dans le milieu AmnioMAX pendant 10 jours, puis passez au milieu de pluripotence pendant 20 jours.

Pour l’expansion de l’iPSC, disséquez manuellement les colonies embryonnaires ressemblant à des cellules souches formées dans la boîte de reprogrammation à l’aide d’une pipette en verre tirée. Propager les CSPe de manière appropriée et masser tous les cinq à sept jours. Les iPCS étaient positifs pour la phosphatase alcaline marqueur de pluripotence.

Générer des corps embryonnaires en coupant les colonies d’iPSC en petits morceaux et en les plaquant dans des boîtes de Petri à faible attachement dans un milieu de corps embryoïde. La différenciation ectodermique est induite par le jour de placage de quatre corps embryoïdés dans un milieu de différenciation ectodermique. De même, la différenciation du mésoderme est induite par le placage des corps embryonnaires du jour huit dans le milieu de différenciation du mésoderme.

Pour induire la différenciation endodermique, culture des CS IPC dans une monocouche dans un milieu de différenciation endodermique. Les changements morphologiques dans les fibroblastes ont été surveillés au cours de la reprogrammation. Ils expriment une morphologie semblable à celle des cellules épithéliales et forment des colonies compactes.

Les cellules avaient également un rapport noyau / cytoplasmique en hauteur, typique des cellules pluripotentes en culture. Les iPSC possédaient un type de porteuse 45 XO et étaient positifs pour les marqueurs de pluripotence OCT4, NANOG, SOX 2, SSEA 4, TRA-1-81 et E-CADHERIN. Les cellules ont été colorées pour obtenir des marqueurs représentatifs de la couche germinale.

Le syndrome de Turner développe ainsi des déficits neurocognitifs. Les neurones dérivés du syndrome de Turner iPSC peuvent être un excellent modèle. Ceci est modélisé dans une plaque de Pétri pour comprendre la nouvelle ligne du syndrome de Turner dissociatif normal.