Name: Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules fœtales du syndrome de Turner (45XO) pour la modélisation en aval des déficits neurologiques associés au syndrome (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Découvrez la génération de cellules souches pluripotentes induites sans intégration à partir de fibroblastes fœtaux par nucléofection de plasmides épisomaux. Cette méthode permet la différenciation neuronale pour modéliser les déficits neurologiques du syndrome de Turner.

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Le soutien financier pour la recherche ci-dessus a été fourni par Manipal Academy of Higher Education. La caractérisation de la lignée a été réalisée en partie dans le laboratoire de M.M. Panicker au NCBS. Nous remercions Anand Diagnostic Laboratory pour son aide avec le caryotypage.

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<li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Reprogramming+to+Pluripotency+and+Directed+Differentiation+of+Human+Cells+with+Synthetic+Modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li>
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<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Free+of+Vector+and+Transgene+Sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li>
<li>Martí, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Characterization of pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 8, 223-253 (2013).</li>
<li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).</li>
<li>Ambartsumyan, G., Clark, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+and+early+human+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy and early human embryo development.</a> Human Molecular Genetics. 17, 10-15 (2008).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9, 2329-2340 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La génération de modèles cellulaires stables de tissu fœtal cytogénétiquement anormal est nécessaire pour perpétuer un phénotype défectueux. La voie iPSC est la méthode la plus efficace de préparation cellulaire pour la conservation perpétuelle des propriétés défectueuses20.
Les cellules souches pluripotentes (CSE) présentent des propriétés d’auto-renouvellement et de différenciation en cellules spécialisées qui rappellent les embryons de clivage précoce<sup class="xref...

Les aneuploïdiens entraînent des malformations congénitales et des pertes de grossesse chez l’homme. ~ 50% à 70% des échantillons de pertes de grossesse présentent des anomalies cytogénétiques. Les embryons aneuploïdes perdus au début de la grossesse ne peuvent pas être facilement obtenus pour une analyse expérimentale, ce qui soulève la nécessité de développer d’autres modèles représentant étroitement l’embryogenèse humaine. Des cellules souches pluripotentes induites (CSI) dérivées de cellules diagnostiquées avec des troubles génétiques ont été utilisées pour modéliser les irrégularités génétiques représentatives et leurs conséquences sur le développement du fœtus1,2,3,4. Ces CSPi ressemblent à des cellules épiblastiques de l’embryon en développement et peuvent récapituler les événements précoces de la formation de l’embryon. Ils permettent de comprendre et de caractériser le programme de développement des lignées cellulaires et des modèles chez les embryons de mammifères précoces. CSPi dérivées précédemment de fibroblastes cutanés et d’amniocytes provenant de tests de diagnostic prénatal de syndromes d’aneuploïdie comme la monosomie X (syndrome de Turner), la trisomie 8 (syndrome de Warkany 2), la trisomie 13 (syndrome de Patau) et la trisomie partielle 11; 22 (syndrome d’Emanuel) ont fourni des informations précieuses concernant l’échec du développement4.
Le syndrome de Turner (TS) est une maladie rare caractérisée par l’infertilité féminine, la petite taille, des troubles endocriniens et métaboliques, un risque accru de maladie auto-immune et une prédisposition aux maladiescardiovasculaires 5. Bien qu’il s’agit du seul syndrome de monosomie survivable, il est également mortel pour l’embryon en développement provoquant des avortements spontanés6. Les individus survivants atteints de TS présentent des degrés d’altération du matériel chromosomique X dans leurs cellules. Les caryotypes vont de la perte complète d’un chromosome X (45,XO) à des mosaïques comme 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, la présence de chromosomes annulaires, la présence de matériel chromosomique Y,etc. 5.
Le diagnostic du syndrome se fait généralement par caryotypage du sang des individus symptomatiques et prélèvement de villosités chorioniques (CVS) pour détecter les syndromes d’aneuploïdie précoce. Étant donné que les syndromes d’aneuploïdie représentent environ 30% des avortements spontanés, il est courant de caryotyper le produit de la conception (POC) lors d’un avortement spontané. Ces cellules fœtales, y compris les villosités chorioniques possédant l’anomalie cytogénétique et les CSPi qui en sont dérivées, constituent une source précieuse de matériel biologique pour étudier les syndromes d’aneuploïdie4,6. Les CSI TS ont déjà été établies à partir d’amniocytes via la reprogrammation rétrovirale4,de fibroblastes de villosités chorioniques (obtenus par diagnostic prénatal) via une reprogrammation rétrovirale6,de cellules mononucléaires sanguines7 via la reprogrammation du virus Sendai et de fibroblastes cutanés d’individus TS via une reprogrammation lentivirale4 . Étant donné que l’objectif principal de notre laboratoire est de comprendre l’échec du développement, nous avons généré des CST iPSC à partir de POC, en particulier la composante des villosités chorioniques d’un avortement spontané8. Toutes les cellules isolées de ce tissu fœtal avaient un caryotype 45XO et produisaient des CS IPC avec le même caryotype. Ces CSPe sont uniques car elles sont les premières à être générées à partir d’un fœtus avorté et constituent une ressource précieuse pour étudier les échecs de grossesse liés à l’aneuploïdie. Cet article fournit une méthodologie détaillée de la génération de CSPic à partir de cette source cellulaire unique via la reprogrammation épisomique.
Les premières méthodes de génération d’iPSC utilisaient la transduction virale et les transposons pour fournir les facteurs de reprogrammation. Les méthodes d’induction des cellules à la pluripotence ont évolué de l’intégration des vecteurs rétroviraux9,des vecteurs lentiviraux excisables10,11 et des méthodes basées sur les transposons12 aux vecteurs adénoviraux non intégrateurs13 et aux vecteurs à base du virus Sendai14. La reprogrammation rétrovirale et lentivirale, bien qu’efficace, implique l’intégration des facteurs de reprogrammation dans les chromosomes de l’hôte, provoquant des mutations d’insertion qui ont des effets imprévus dans les CSI. De plus, la reprogrammation virale empêche l’application translationnelle des CSI. Les systèmes à base d’ARN15 et d’administration directe de protéines16 ont été explorés pour éliminer complètement les risques potentiels associés à l’utilisation de virus et de transfections d’ADN. Cependant, ces méthodes se sont avérées inefficaces.
En 2011, Okita et al. ont rapporté une amélioration de l’efficacité de la reprogrammation par des plasmides épisomiques augmentés par la suppression de TP53 via shRNA. Ils ont également remplacé le cMYC par un LMYC (MYC associé au carcinome pulmonaire à petites cellules) non transformant pour améliorer la sécurité des hiPSC. Ces plasmides épisomiques expriment 5 facteurs de reprogrammation : OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC et shRNA pour TP5317,18. Ces vecteurs sont maintenus extra-chromosomiquement et perdus des cellules reprogrammées lors d’une culture continue, rendant ainsi les lignes sans transgène dans 10-15 passages. La nucléofection est une forme spécialisée d’électroporation qui délivre des acides nucléiques directement dans le noyau des cellules hôtes. C’est une méthode efficace pour l’administration des plasmides de reprogrammation dans divers types de cellules. Les plasmides épisomiques sont rentables et compensent les coûts élevés de la nucléofection. Cette méthode est efficace et reproductible dans des conditions optimisées, produisant des CSP stables à partir d’une variété de cellules somatiques. Dans ce protocole, nous décrivons la méthode de génération de CSI i à partir de fibroblastes isolés du tissu fœtal par nucléofection de plasmides de reprogrammation épisomique. Voici les protocoles détaillés pour l’isolement des fibroblastes des villosités chorioniques fœtales, la purification des plasmides, la nucléofection, la cueillette des colonies à partir de la plaque de reprogrammation et l’établissement de CSI stables.
Il est essentiel de confirmer la présence de traits de pluripotence dans les IPSC nouvellement générés. Cela comprend la démonstration de facteurs liés à la pluripotence (par exemple, expression de la phosphatase alcaline, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-cadhérine; généralement montré avec des tests d’immunofluorescence ou d’expression génique), l’identification des trois couches germinales par des tests de différenciation in vitro pour valider leurs potentiels de différenciation, le caryotypage pour déterminer le contenu chromosomique, le typage STR pour établir l’identité avec les cellules mères, vérifier la perte de gènes exogènes, et des essais in vivo plus rigoureux tels que la formation de tératome et la complémentation tétraploïde. Nous décrivons ici les protocoles de caractérisation du caryotypage, la coloration de la phosphatase alcaline des cellules vivantes, la détection de biomarqueurs liés à la pluripotence par immunofluorescence, les tests de différenciation in vitro et la méthode pour démontrer la perte de gènes exogènes19.

<table><tbody><tr><td>0,15 % de trypsine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>27250018</td><td>G Banding</td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td>Pluripotence et milieu corporel embryoïde</td></tr><tr><td>4', 6 diamidino-2-phénylindole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8417</td><td>Immunocytochimie</td></tr><tr><td>Activine A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRP3003</td><td>Tests</td></tr> <tr><td>de différenciationPhosphatase alcaline Coloration</td><td>Vivante Thermo Fisher Scientific</td><td>A14353</td><td>Coloration AP</td></tr><tr><td>AMAXA Nucleofector II</td> Lonza-Nucleofection <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AmnioMAX II milieu complet</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>11269016</td><td>Milieu spécifique pour les cultures de cellules de villosités choriales fœtales</td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>HiMedia</td><td>TC021</td><td>Purification plasmidique</td></tr><tr><td>Anti souris IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11059</td><td>Immunocytochimie</td></tr><tr><td>Anti IgG de lapin (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>Immunocytochimie</td></tr><tr><td>Anti IgG de lapin (H+L) Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td><td>Immunocytochimie</td></tr><tr><td>Antibiotique-Antimycotique</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>15240096</td><td>Contrôle de</td></tr> <tr><td>la contaminationAnti-E-Cadhérine</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>Immunocytochimie</td></tr><tr><td>Anti-Nanog</td><td>BD Biosciences</td><td>560109</td><td>Immunocytochimie</td></tr><tr><td>Anti-OCT3/4</td><td>BD Biosciences</td><td>611202</td><td>Immunocytochimie</td></tr><tr><td>Anti-SOX17</td><td>BD Biosciences</td><td>561590</td><td>Immunocytochimie</td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>BD Biosciences</td><td>561469</td><td>Immunocytochimie</td></tr><tr><td>Anti-SSEA4</td><td>BD Biosciences</td><td>560073</td><td>Immunocytochimie</td></tr><tr><td>Anti-TRA 1-81</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td>Immunocytochimie</td></tr><tr><td>basique Facteur de croissance des fibroblastes[FGF2]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0291</td><td>Milieu de pluripotence</td></tr><tr><td>Facteur morphogénétique osseux 4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRP3016</td><td>Tests de différenciation</td></tr><tr><td>bovin Albumine sérique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td>Blocage</td></tr> du <tr><td>collagène humain Type IV</td><td>BD Biosciences</td><td>354245</td><td>Tests de différenciation</td></tr><tr><td>Mélange de collagénase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8051</td><td>Digestion des villosités choriales fœtales</td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>Tests de différenciation</td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td>Tests de différenciation</td></tr><tr><td>FastDigest EcoR1</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0274</td><td>Digestion de restriction</td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2518</td><td>Tests de différenciation</td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>HiMedia</td><td>S011</td><td>G Banding</td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>HiMedia</td><td>AS001</td><td>Fixateur pour le caryotype</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528</td><td>Tests de différenciation</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Pluripotence et milieu corporel embryoïde</td></tr><tr><td>Héparine sodique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td>Tests de différenciation</td></tr><tr><td>Solution d’insuline humaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278</td><td>Tests de différenciation</td></tr><tr><td>Insuline Transferrine Sélénite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1884</td><td>Tests de différenciation</td></tr><tr><td>KAPA HiFi PCR kit</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KR0368</td><td>OriP, EBNA1 PCR</td></tr><tr><td>KaryoMAX Colcemid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15210040</td><td>Arrêt mitotique pour caryotype</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10829018</td><td>Pluripotence et milieu de corps embryoïde</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>Pluripotence et milieu corporel embryoïde</td></tr><tr><td>Luria Bertani Agar</td><td>HiMedia</td><td>M1151F</td><td>Purification plasmidique</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td>Tests de différenciation</td></tr><tr><td>MEM Acides aminés non essentiels Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td>Pluripotence et milieu corporel embryoïde</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>HiMedia</td><td>MB113</td><td>Fixateur pour le caryotypage</td></tr><tr><td>Chaîne lourde ventriculaire de myosine &alpha ;/&beta ;</td><td>Millipore</td><td>MAB1552</td><td>Immunocytochemistry</td></tr><tr><td>NHDF Nucleofector Kit</td><td>Lonza</td><td>VAPD-1001</td><td>Nucleofection</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Cellules fixatrices</td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td>Plasmide de reprogrammation épisomique</td></tr><tr><td>pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td>Plasmide de reprogrammation épisomale</td></tr><tr><td>pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td>Reprogrammation épisomale du plasmidique</td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine</td><td>&nbsp ; Thermo Fisher Scientific,</td><td>&nbsp ; 15070063</td><td>Pluripotence et milieu corporel embryoïde</td></tr><tr><td>Phalloïdine- Tétraméthylrhodamine B isothiocyanate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1951</td><td>Immunocytochimie</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td>1 X PBS 1 comprimé de PBS dissous dans 200 ml d’eau déminéralisée et stérilisé par autoclavage Stockage : Température ambiante. PBST- 0,05 % Tween 20 en 1X PBS. Stockage : Température ambiante.</td></tr><tr><td>Kit de purification de plasmides - Préparation midi</td><td>QIAGEN</td><td>12143</td><td>Purification de plasmides</td></tr><tr><td>Solution de chlorure de potassium</td><td>HiMedia</td><td>MB043</td><td>Solution hypotonique pour le caryotypage</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Kit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>Isolation de l’ADN génomique</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td>Milieu de différenciation des hépatocytes</td></tr><tr><td>Citrate de sodium</td><td>HiMedia</td><td>RM255</td><td>Solution hypotonique pour le caryotypage</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>HiMedia</td><td>MB031</td><td>Perméabilisation</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05 %)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>25300054</td><td>Sous-culture de &nbsp ; fibroblastes de villosités choriales fœtales</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>HiMedia</td><td>MB067</td><td>Préparation de PBST</td></tr><tr><td>&beta ; III tubuline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8578</td><td>Immunocytochimie</td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorhydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td>Tests de différenciation</td></tr></tbody></table>

génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules fœtales du syndrome de turner (45xo) pour la modélisation en aval des déficits neurologiques associés au syndrome

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome (45XO) Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome

Les aneuploïdies chromosomiques provoquent de graves malformations congénitales, notamment des malformations du système nerveux central et la mort fœtale. Le dépistage génétique prénatal est purement diagnostique et n’élucide pas le mécanisme de la maladie. Bien que les cellules des fœtus aneuploïdes soient du matériel biologique précieux portant l’aneuploïdie chromosomique, ces cellules sont de courte durée, ce qui limite leur utilisation pour les expériences de recherche en aval. La génération de modèles de cellules souches pluripotentes induites (CSIp) est une méthode efficace de préparation cellulaire pour la conservation perpétuelle des caractères aneuploïdes. Ils se renouvellent d’eux-mêmes et se différencient en cellules spécialisées qui rappellent le développement embryonnaire. Ainsi, les CSPe constituent d’excellents outils pour étudier les événements de développement précoces. Le syndrome de Turner (TS) est une affection rare associée à un chromosome X complètement ou partiellement manquant. Le syndrome est caractérisé par l’infertilité, la petite taille, les troubles endocriniens, métaboliques, auto-immuns et cardiovasculaires et les défauts neurocognitifs. Le protocole suivant décrit l’isolement et la culture de fibroblastes à partir de tissu fœtal TS (45XO), la génération de TSiPSC sans intégration par l’administration de plasmides de reprogrammation épisomique par nucléofection suivie d’une caractérisation. Les TSiPSC de reprogrammation ont d’abord été examinés par coloration de la phosphatase alcaline des cellules vivantes, suivie d’un sondage approfondi pour les biomarqueurs de pluripotence. Les colonies sélectionnées ont été disséquées mécaniquement, ont été croisées plusieurs fois et des cellules stables auto-renouvelées ont été utilisées pour d’autres expériences. Les cellules ont exprimé les facteurs de transcription de pluripotence OCT4, NANOG, SOX2, les marqueurs de surface cellulaire SSEA 4 et TRA1-81 typiques des cellules souches pluripotentes. Le caryotype 45XO original a été conservé après la reprogrammation. Les TSiPSC ont pu former des corps embryoïdes et se différencier en cellules d’endoderme, de mésoderme et d’ectoderme exprimant des biomarqueurs spécifiques à la lignée ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). Les plasmides épisomiques exogènes ont été perdus spontanément et non détectés après le passage 15 dans les cellules. Ces TSiPSC sont une ressource cellulaire précieuse pour modéliser le neurodéveloppement moléculaire et cellulaire défectueux provoquant des déficits neurocognitifs associés au syndrome de Turner.

Génération de CSPe sans intégration à partir d’un fœtus avorté spontanément avec un caryotype 45XO Nous avons isolé des fibroblastes de FCV avec un caryotype 45XO spécifique du syndrome de Turner (TS) et les avons nucléofectés avec des plasmides de reprogrammation épisomique pour générer des TSiPSC qui peuvent être utilisés pour la modélisation en aval du syndrome, en particulier les déficits neurologiques associés(Figure 1a&amp; b). Nous avons utilisé de...

Ce protocole décrit la génération de CSI sans intégration à partir de fibroblastes de tissu fœtal par administration de plasmides épisomiques par nucléofection suivie d’une description des méthodes utilisées pour la caractérisation de l’iPSC et la différenciation neuronale.

Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules fœtales du syndrome de Turner (45XO) pour la modélisation en aval des déficits neurologiques associés au syndrome

Chromosomal aneuploidies cause severe congenital malformations including central nervous system malformations and fetal death. Prenatal genetic screening ...

Le syndrome de Turner est une maladie rare associée à un chromosome X complètement ou partiellement manquant. Le syndrome est caractérisé par l’infertilité, la petite taille, les troubles cardiovasculaires et les défauts neurocognitifs. Dans certains cas, il provoque la mort fœtale.Bien que les cellules somatiques des fœtus aneuploïdes soient biologiquement précieuses, elles sont de courte durée, limitant ainsi leur utilisation dans la recherche. La génération d’iPSC est donc une méthode efficace de préparation cellulaire pour la conservation perpétuelle des caractères aneuploïdes. Ils se renouvellent automatiquement et peuvent se différencier en types cellulaires spécialisés qui rappellent le développement embryonnaire précoce.L’administration de plasmides de reprogrammation épisomique non intégrateurs par fiction nucléaire est une méthode efficace et reproductible pour générer des IPSC complètement reprogrammés et stables. Cette méthode peut également être utilisée sur des cellules difficiles à programmer. Dans ce protocole, nous décrivons la régénération des CSPe à partir de matériel fœtal avec anéliod.Transférer les villosités chorioniques fœtales collectées dans une boîte de Petri stérile. Lavez-le plusieurs fois avec du PBS contenant 1X solution antibiotique antimycotique. Retirez complètement le PBS par pipetage.Ajouter 1 ml de mélange de collagénase aux villosités et incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes ou jusqu’à ce que le tissu se désintègre. Après incubation, neutraliser la collagénase en ajoutant un milieu contenant 10% de sérum bovin fœtal. Transférer le contenu de la boîte de Petri dans un tube de 15 ml.Centrifugez le digest pour recueillir les villosités désintégrées et les cellules libérées. Décantez soigneusement le surnageant. Les villosités désintégrées sur plaque ainsi que les cellules libérées dans une fiole de culture T25 et un milieu AmnioMAX et se développent jusqu’à l’obtention d’une culture de fibroblastes confluents.Développer les fibroblastes et la culture pour préparer les stocks en pour une utilisation dans des expériences ultérieures de transfection et de caractérisation. Préparer des cultures d’alcalis contenant les plasmides de reprogrammation. Isolez les plasmides à l’aide du kit de purification du plasmide Midi, conformément aux instructions du fabricant.Re-suspendez chaque palette dans un volume approprié d’eau sans ARNi de DNAse pour obtenir une concentration finale de 1 microgramme par millilitre. Vérifiez les plasmides à l’aide du kit de digestion de restriction ECoR1, en suivant les instructions du fabricant. Trypsiniser les fibroblastes de villosités chorioniques.Neutraliser et centrifuger pour collecter les cellules. Décantez le surnageant et re-suspendez les cellules dans 5 ml d’OPTI-MEM. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et retirez 1 million de cellules pour la nucléofection.Centrifugeuse pour obtenir une palette de cellules. Effectuez une nucléofection à l’aide du kit Amaxa NHDF Neucleofactor. Préparer le réactif neucléofactoriel en mélangeant un supplément de 0,5 mL et une solution de nucléofacteur de 2,25 mL fournis dans le kit.Retirez 100 microlitres de solution de nucléofacteur et ajoutez-y 1 microgramme de chaque plasmide. Re-suspendez doucement 1 million de cellules dans ce mélange. Transférer la suspension d’ADN cellulaire dans la cuvette, en s’assurant que l’échantillon recouvre le fond de la cuvette sans bulles d’air.Coiffez la cuvette et insérez-la dans le support. Sélectionnez le programme de nucléofacteur D-23 pour une efficacité élevée et appliquez. Retirez la cuvette du support et ajoutez 1 mL de support AmnioMAX.Transférer doucement le contenu dans une boîte de Petri traitée par culture tissulaire, à l’aide de la pipette fournie dans le kit. Incuber les cellules dans un incubateur à dioxyde de carbone humidifié à 37 degrés Celsius. Maintenez les cellules dans le milieu AmnioMAX pendant 10 jours, puis passez au milieu de pluripotence pendant 20 jours.Pour l’expansion de l’iPSC, disséquez manuellement les colonies embryonnaires ressemblant à des cellules souches formées dans la boîte de reprogrammation à l’aide d’une pipette en verre tirée. Propager les CSPe de manière appropriée et masser tous les cinq à sept jours. Les iPCS étaient positifs pour la phosphatase alcaline marqueur de pluripotence.Générer des corps embryonnaires en coupant les colonies d’iPSC en petits morceaux et en les plaquant dans des boîtes de Petri à faible attachement dans un milieu de corps embryoïde. La différenciation ectodermique est induite par le jour de placage de quatre corps embryoïdés dans un milieu de différenciation ectodermique. De même, la différenciation du mésoderme est induite par le placage des corps embryonnaires du jour huit dans le milieu de différenciation du mésoderme.Pour induire la différenciation endodermique, culture des CS IPC dans une monocouche dans un milieu de différenciation endodermique. Les changements morphologiques dans les fibroblastes ont été surveillés au cours de la reprogrammation. Ils expriment une morphologie semblable à celle des cellules épithéliales et forment des colonies compactes.Les cellules avaient également un rapport noyau / cytoplasmique en hauteur, typique des cellules pluripotentes en culture. Les iPSC possédaient un type de porteuse 45 XO et étaient positifs pour les marqueurs de pluripotence OCT4, NANOG, SOX 2, SSEA 4, TRA-1-81 et E-CADHERIN. Les cellules ont été colorées pour obtenir des marqueurs représentatifs de la couche germinale.Le syndrome de Turner développe ainsi des déficits neurocognitifs. Les neurones dérivés du syndrome de Turner iPSC peuvent être un excellent modèle. Ceci est modélisé dans une plaque de Pétri pour comprendre la nouvelle ligne du syndrome de Turner dissociatif normal.

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Biologie du développement

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Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules fœtales du syndrome de Turner (45XO) pour la modélisation en aval des déficits neurologiques associés au syndrome (Vidéo) | JoVE Journal

Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules fœtales du syndrome de Turner (45XO) pour la modélisation en aval des déficits neurologiques associés au syndrome

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