Analyse comparative de méthodes expérimentales pour quantifier l’activité animale dans les modèles de maladie mitochondriale de Caenorhabditis elegans

Ce protocole utilise deux tests semi-automatisés différents pour quantifier rapidement l’activité locomotrice de C.elegans en milieu liquide, et a le potentiel d’être appliqué pour le dépistage de médicaments dans les modèles de maladie de C.elegans. Les principaux avantages de ces deux techniques sont leur facilité d’utilisation et leur facilité de reproductibilité. Les deux techniques ont le potentiel d’évaluer les effets des médicaments sur le comportement des vers avec un débit variable.

Ces tests de motilité sont utiles pour évaluer l’activité locomotrice des modèles de maladie mitochondriale de C.elegans dans lesquels le système neuromusculaire des animaux est altéré. Pour analyser l’activité locomotrice de C.elegans en milieu liquide sur des lames de verre après avoir synchronisé le contrôle dans des souches de vers mutants sur des plaques NGM avec et sans traitements médicamenteux d’intérêt pour le stade L4, utilisez un pic à vis et un stéréomicroscope pour choisir cinq vers par souche et conditionner en 20 microlitres individuels de solution S.basal sur une lame de verre. Ajoutez des vers de la même condition expérimentale provenant de différentes plaques NGM à plusieurs gouttelettes sur la même lame pour obtenir plusieurs répliques techniques.

Lorsque tous les vers ont été collectés, laissez les animaux s’acclimater sur la glissière pendant une minute à température ambiante avant d’enregistrer l’activité de nage des vers dans chaque goutte pendant une minute à 15 images par seconde et par goutte. Pour analyser l’activité locomotrice enregistrée de C.elegans à l’aide du logiciel ZebraLab, utilisez l’option ZEBRALAB AVI pour télécharger des vidéos dans le logiciel. Cliquez sur l’option Quantification avec les fichiers AVI.

Pour créer un nouveau protocole, sélectionnez Paramètres, Paramètres de protocole et Heure, puis définissez la durée de l’expérience sur une minute. Sélectionnez No Time Bin et désélectionnez Période d’intégration en fonction de la sortie de données souhaitée et sélectionnez Fichier et Ouvrir un film pour télécharger chaque fichier vidéo précédemment enregistré. Pour créer une seule zone de détection, utilisez l’outil Cercle pour créer une zone autour de la goutte de liquide entière dans laquelle se trouvent les vers.

L’activité de tous les vers dans la zone sélectionnée sera détectée. Pour indiquer la distance à étalonner, tracez une ligne horizontale de gauche à droite de la zone vidéo et sélectionnez Étalonnage, Dessin et Appliquer au groupe. Pour permettre l’analyse de toutes les différentes souches de vers C.elegans, désélectionnez l’icône Zone et ajustez la sensibilité de détection dans le seuil d’activité.

Pour visualiser les traces effectuées par les animaux pendant l’analyse de l’activité, définissez l’échelle d’affichage sur 70 et sélectionnez Appliquer au groupe. Pour analyser les vidéos, cliquez sur Lecture, puis sélectionnez Expérimenter, puis Exécuter pour entrer un nom de fichier pour la vidéo. Après l’enregistrement, une fenêtre apparaîtra vous demandant s’il faut analyser la vidéo à la vitesse maximale de l’ordinateur.

Cliquez sur Oui. La fenêtre d’expérience en cours d’exécution s’ouvre. Cliquez sur Démarrer.

Une fois l’analyse d’enregistrement terminée, cliquez sur Expérimenter et arrêtez pour enregistrer l’activité analysée dans la gouttelette dans une feuille de calcul. Pour analyser l’activité locomotrice de C.elegans en milieu liquide dans un format de plaque à 96 puits, lorsque les vers ont atteint le stade L4, ajoutez 50 microlitres de 2% de poids par volume d’E.coli OP50 et de milieu basal S. à chaque puits d’une microplaque à fond plat clair de 96 puits. Utilisez le stéréomicroscope pour choisir manuellement 15 vers synchronisés par puits de la plaque de 96 puits et permettre aux vers de s’acclimater pendant 20 minutes.

À la fin de la période d’acclimatation, utilisez un scanner à plat standard pour numériser chaque microplaque deux fois avec moins de 10 secondes entre les numérisations Pour analyser les numérisations, utilisez un logiciel open source pour aligner les deux numérisations séquentielles et acquérir les données de changement de pixel entre les deux images et le score relatif de balayage par ver pour déterminer les changements de réponse locomotrice en fonction de l’intensité lumineuse produite par le scanner lorsqu’il est réglé sur un pixel seuil de cinq. Dans cette analyse de l’activité locomotrice de C.elegans dans une seule goutte de milieu liquide, les vers de la maladie du complexe mitochondrial I ont démontré une diminution significative de 38% de leur activité locomotrice au stade L4 par rapport aux vers de type sauvage. De même, l’analyse par balayage des vers des mêmes populations a montré une réduction significative de l’activité locomotrice pour les vers modèles de la maladie au stade L4 par rapport aux vers de type sauvage N2 Bristol.

Cette perte d’activité locomiale a également été observée chez les vers adultes de la maladie du complexe mitochondrial I au stade I, tels qu’évalués par analyse par tomodensitométrie. Il est essentiel de ne pas oublier d’utiliser le bon nombre de vers lors de la configuration de chaque test. À la suite de cette procédure, notre laboratoire effectue fréquemment un dépistage de drogue.

Ces deux techniques sont utilisées dans notre laboratoire pour évaluer les effets des médicaments d’intérêt sur l’activité des vers dans les modèles animaux précliniques de maladie mitochondriale.