Livraison du complexe de ribonucléoprotéines Cas9/sgRNA dans des cellules immortalisées et primaires via des particules de type viral (« nanolames »)

Les nanolames ont permis une administration rapide, efficace et dose-dépendante du complexe Cas9 et ARN guide, à la fois dans les cellules immortalisées et primaires, et en l’absence d’anti-transgène. Le principal avantage de cette méthode est que les nanolames sont faciles et relativement peu coûteuses à préparer. Ils peuvent délivrer le cas9 et guider le complexe d’ARN de manière dose-dépendante et transitoire, limitant ainsi les effets hors cible, tout en permettant une édition efficace du génome.

Le protocole de préparation des nanolames est très simple. Cependant, la qualité des cellules productrices, ainsi que leur origine et leur ensemencement avant la transfection, sont essentiels pour obtenir des rendements élevés de particules virales. Laura Guiguettaz, une ingénieure de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Le premier jour, ensemencez 3,5 à 4 millions de cellules HEK 293T dans 10 millilitres de DMEM modifié et de streptomycine de pénicilline dans un plat de culture cellulaire de 10 centimètres. Après 24 heures, lorsque les cellules atteignent 70% de confluence, remplacez le milieu par du DMEM frais et utilisez une pipette P-1000 pour ajouter une solution de réactif de transfection par goutte. Commencez à récolter des nanolames le quatrième jour en collectant le surnageant du milieu de culture avec une pipette de 10 millilitres.

Il est normal que la couleur du milieu de culture devienne jaune à ce stade. Centrifuger le surnageant collecté à 500 G pendant cinq minutes pour éliminer les débris cellulaires et récupérer neuf millilitres du surnageant sans perturber la pastille cellulaire. Enduire les nanolames dans une ultracentrifugeuse à 209, 490 G pendant 75 minutes à quatre degrés Celsius.

Après centrifugation, aspirez lentement le milieu et remettez en suspension la pastille blanche avec 100 microlitres de PBS froid. Couvrir le tube avec un parafilm et incuber pendant une heure à quatre degrés Celsius avec une légère agitation. Ensuite, remettez en suspension le granulé à nouveau en pipetant de haut en bas.

Préparez une solution de saccharose à 10 % dans du PBS et filtrez-la à travers un filtre à seringue de 0,2 micromètre. Placer 2,5 millilitres de saccharose à 10 % dans un tube ultracentrifuge. Inclinez le tube et ajoutez lentement les neuf millilitres d’échantillon contenant du VLP avec une pipette à basse vitesse tout en soulevant progressivement le tube en position verticale.

Placez les tubes dans les godets du rotor, puis centrifugez les échantillons à 209, 490 G pendant 90 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, retirez soigneusement le surnageant et placez le tube à l’envers sur du papier de soie pour éliminer tout liquide restant. À des fins didactiques et une meilleure visualisation de la pastille virale, des nanolames chargées de la protéine fluorescente mCherry peuvent être préparées.

Après une minute, ajoutez 100 microlitres de PBS. Placez le tube avec un couvercle de parafilm dans un porte-tube sur une table d’agitation pendant une heure à quatre degrés Celsius et remettez la pastille en pipetant de haut en bas. Préparer le tampon de dilution en ajoutant un volume de tampon de lyse contenant un tensioactif non ionique dans quatre volumes de PBS.

Diluer brièvement deux microlitres de nanolames concentrées dans 50 microlitres de tampon de dilution et de vortex. Transférer 25 microlitres du mélange dans un nouveau tube contenant 25 microlitres de tampon de dilution et répéter la procédure pour avoir six tubes de dilutions de nanolames. Faites le contrôle standard en ajoutant deux microlitres de nucléase Cas9 recombinante dans 50 microlitres de tampon de dilution, en le vortex brièvement et en effectuant huit dilutions en série.

Repérez 2,5 microlitres de chaque dilution VLP et 2,5 microlitres de chaque étalon sur une membrane de nitrocellulose avec soin avec une pipette multicanal. Une fois les particules absorbées, bloquez la membrane avec tbST complété par du lait sec non gras à 5% pendant 45 minutes à température ambiante. Jetez le TBST et incubez la membrane pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec l’anticorps cas9 contre la peroxydase de raifort.

Lavez la membrane trois fois avec TBST et visualisez le signal à l’aide d’un kit de substrat chimiluminescent amélioré. Pour la transduction des cellules cibles avec des nanolames, remplacez le milieu de culture cellulaire par 500 microlitres du milieu contenant des nanolames purifiées. Après quatre à six heures d’incubation cellulaire, remplacez le milieu par la quantité normale de milieu frais.

Dans le protocole, les cellules ont été ensemencées pour une distribution homogène avec une confluence de 70 à 80% le jour de la transfection, formant une syncytie conduisant à des cellules plus grandes avec plusieurs noyaux après 24 heures. 40 heures après la transfection, la plupart des cellules ont formé une syncytie et ont commencé à se détacher de la plaque. La quantité de Cas9 chargée dans les nanolames a été quantifiée à l’aide d’un transfert de points sur une membrane de nitrocellulose, qui présentait une chimiluminescence améliorée par rapport au Cas9 recombinant de référence.

Une courbe d’étalonnage a été tracée pour le signal de chimiluminescence quantifié pour les dilutions Cas9 recombinantes par rapport à la quantité connue de Cas9. Ensuite, la concentration de protéine Cas9 dans chaque préparation de nanolame a été cartographiée, révélant différentes concentrations de Cas9 d’un lot à l’autre. Le test de l’endonucléase T7 a démontré que l’efficacité des nanolames peut varier d’un lot à l’autre.

Par exemple, un lot a été observé pour avoir une efficacité d’édition globale de 20%, tandis que l’autre lot affichait une efficacité de 60%. Les protéines Flag-DDX3 ont été immuno-précipitées à l’aide de billes d’agarose anti-drapeau, suivies d’une analyse par transfert Western des protéines récupérées à l’aide d’un anticorps anti-drapeau. L’insertion dirigée par site de l’étiquette d’indicateur dans le locus DDX3 a également été testée par PCR à l’aide soit d’amorces flanquant le site d’insertion, soit d’amorces avant et arrière spécifiques au locus DDX3 en aval du site d’insertion de drapeau.

Il est important de placer les cellules à une confluence correcte et d’obtenir une distribution uniforme des cellules. Lors de la centrifugation des nanolames, il est également important de remettre en suspension la pastille et d’obtenir un échantillon homogène de particules virales concentrées. Les nanolames ont permis aux scientifiques d’étudier le mécanisme de réparation de la rupture de l’ADN double brin en délivrant le complexe d’ARN Cas9 et en guidant vers des loci génomiques spécifiques de manière rapide et coordonnée.

Ils ont également permis d’inactiver de longs ARN non codants dans les cellules primaires du système immunitaire inné afin d’étudier leur rôle.