Name: Modélisation des métastases cérébrales par injection veineuse de cellules inflammatoires du cancer du sein (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: Découvrez une méthode d'injection veineuse de cellules de cancer du sein inflammatoire pour modéliser les métastases cérébrales chez la souris. Cette technique reproduit fidèlement les étapes de colonisation métastatique.

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Nous remercions Christine F. Wogan, MS, ELS, de la Division de radio-oncologie de MD Anderson pour la révision scientifique du manuscrit, et Carol M. Johnston de la Division d’histologie chirurgicale de MD Anderson pour son aide avec la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine. Nous sommes reconnaissants envers le noyau de médecine et de chirurgie vétérinaires de MD Anderson pour son soutien aux études sur les animaux. Ces travaux ont été financés par les subventions suivantes : Susan G. Komen Career Catalyst Research grant (CCR16377813 à BGD), American Cancer Society Research Scholar grant (RSG-19–126–01 à BGD) et State of Texas Rare and Aggressive Breast Cancer Research Program. Également soutenu en partie par Cancer Center Support (Core) Grant P30 CA016672 du National Cancer Institute, National Institutes of Health, au MD Anderson Cancer Center de l’Université du Texas.

La méthode décrite ici a été approuvée par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du MD Anderson Cancer Center et est conforme aux directives des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Le flux de travail schématique, avec toutes les étapes incluses, est présenté sous forme de figure 1.
1. Préparation cellulaire
REMARQUE : La lignée cellulaire MDA-IBC3 (ER-/PR-/HER2+), générée dans le laboratoire24 du Dr Woodward, a été transduite de façon stable avec un plasmide de la protéine fluorescente vert luciférase (Luc-GFP).
<ol><li>La culture a transduit des cellules dans les milieux F-12 de Ham, complétées par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 1 μg/mL d’hydrocortisone, 5 μg/mL d’insuline et 1 % d’antibiotiques-antimitotiques.</li>
	<li>Plaquer les cellules MDA-IBC3-Luc-GFP à 37 °C et 5 % de CO2 dans une fiole T-75 jusqu’à confluence. Changez de milieu tous les 3 jours avant que les cellules ne soient suffisamment confluentes pour passer.</li>
	<li>Récolter les cellules en retirant le milieu, en lavant chaque fiole avec 10 ml de 1 solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco (c.-à-d. sans calcium ni magnésium) et en ajoutant 2 mL d’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,25 %. Incuber pendant 3-5 min à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se détachent.</li>
	<li>Ajouter 5 mL de média complet dans le ballon pour recueillir les cellules et transférer tout le contenu dans un tube à centrifuger de 15 mL (optimisé pour un tube à centrifuger de 50 mL selon le nombre total de cellules nécessaires). Centrifuger à 290 x g pendant 5 min pour hydrater les granulés. REMARQUE : Le milieu complet est le milieu F-12 de Ham complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 1 μg/mL d’hydrocortisone, 5 μg/mL d’insuline et 1 % d’antibiotique-antimitotique.</li>
	<li>Jetez le surnageant. Ensuite, lavez les cellules avec 10 ml de 1x DPBS. Centrifuger à 290 x g pendant 5 min pour granuler les cellules et jeter soigneusement le surnageant. Remettez les cellules en suspension avec 1 mL de 1x DPBS frais et mélangez bien en pipetant de haut en bas.</li>
	<li>Pour fabriquer des suspensions unicellulaires, filtrez les cellules à travers des crépines à cellules stériles de 40 μm.</li>
	<li>Calculez la densité de cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. NOTE: Pour réduire les erreurs de comptage, créez différentes dilutions de cellules et comptez-les séparément, et calculez la valeur moyenne pour déterminer la concentration de cellules (nombre de cellules / mL).<ol><li>Prélever 2 μL de suspension cellulaire + 8 μL de 1x DPBS pour faire un échantillon de dilution 1:5.</li>
		<li>Prélever 1 μL de suspension cellulaire + 9 μL de 1x DPBS pour faire un échantillon de dilution 1:10.</li>
		<li>Ajouter 10 μL de coloration bleue trypan à 0,4%. Bien mélanger le mélange d’échantillons en le pipetant de haut en bas plusieurs fois.</li>
		<li>Pipeter doucement 10 μL de l’échantillon dans la zone de chargement de l’échantillon en forme de demi-lune des lames de la chambre de comptage. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles à l’intérieur; Attendez 30 s pour permettre aux cellules de s’installer dans la chambre avant de compter.</li>
	</ol></li>
	<li>Diluer les cellules avec 1x DPBS à une densité de 5 x 105 ou 1 x 106 cellules par 100 μL. Transférer la suspension cellulaire dans des tubes microcentrifugeuses de 1,7 mL pour l’injection de la veine résiduelle. Placer les cellules sur la glace jusqu’à l’injection pour maintenir la viabilité.</li>
</ol>2. Injection veineuse de la queue
<ol><li>Utilisez des souris athymiques SCID/Beige femelles âgées de 4 à 6 semaines.</li>
	<li>Préparez une seringue de 30 G pour aspirer 100 μL de suspension cellulaire. Enlevez toutes les bulles d’air.</li>
	<li>Placez la souris dans un appareil de retenue pour rongeurs (diamètre d’environ 1 pouce) pour faciliter l’injection de la veine de la queue et prévenir les blessures dues au mouvement pendant le processus d’injection.</li>
	<li>Utilisez des tampons de coton à base d’alcool (faits d’éthanol à 70%) pour essuyer doucement la queue de la souris 3-4 fois et maintenez-la pendant 5-10 s pour rendre la veine de la queue plus clairement visible.</li>
	<li>Insérez la seringue dans la queue de la souris à un angle de 15-30°. Poussez lentement la suspension cellulaire dans la veine de la queue.</li>
	<li>Retirez doucement la seringue et utilisez le coton pour tenir la queue pendant quelques secondes afin d’arrêter tout saignement.</li>
	<li>Remettez les souris dans leurs cages et vérifiez-les 2 à 4 heures après l’injection pour vous assurer qu’aucun effet indésirable ne se produit.</li>
</ol>3. Évaluation du fardeau des métastases cérébrales
<ol><li>Préparer une solution de D-luciférine diluée. NOTA : La concentration stock-stock est de 47,6 mM (15,15 mg/mL) et la concentration utilisée est de 1,515 mg/mL.<ol><li>Ajouter 5 ml de 1x DPBS dans le flacon de D-luciférine.</li>
		<li>Placer 2,5 mL de la solution dans chacun des deux tubes coniques de 50 mL.</li>
		<li>Ajouter encore 5 ml de 1x DPBS dans le flacon de D-luciférin à nouveau pour le rincer. Mettez 2,5 mL dans chaque tube conique de 50 mL.</li>
		<li>Placez encore 5 ml de 1x DPBS dans le flacon et rincez-le à nouveau. Répétez le processus de rinçage deux fois.</li>
		<li>Ajouter 1x DPBS à chaque tube de 50 mL pour un total de 66 mL (environ 33 mL par tube). Il devrait y avoir environ 33 mL de la solution dans chaque tube.</li>
		<li>Bien mélanger les tubes, puis combiner les deux dans une unité de filtration stérile (filtre PES de 150 ml 0,45 μm).</li>
		<li>Filtrer la solution, puis aliquote la solution filtrée dans des microtubes ambrés stériles de 1,7 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Détection des métastases cérébrales par imagerie de la luciférase.<ol><li>Décongeler la D-luciférine en restant sur la glace, et vortex avant l’injection dans les souris.</li>
		<li>Nettoyez la zone d’injection avec des tampons de coton alcoolique et injectez 100 μL de D-luciférine par souris par voie intrapéritonéale à l’aide d’une seringue à insuline de 0,5 mL, une seringue pour chaque cage.</li>
		<li>Après 10 min, anesthésier les souris avec de l’isoflurane (2% O 2-2,5% d’isoflurane) pendant 5 min à l’aide du vaporisateur vétérinaire connecté à la chambre d’induction du petit animal.</li>
		<li>Activez le système d’imagerie in vivo. Pendant que les souris de la première cage sont sous anesthésie, injectez la D-luciférine dans les souris de la cage suivante.</li>
		<li>Mettez des souris dans la machine du système d’imagerie in vivo et obtenez des images ventrales et dorsales. Sélectionnez un temps d’exposition de 2 min et, dans la vue de champ, choisissez l’option E (corps entier). Appuyez sur Acquérir. Ensuite, enregistrez l’image (Figure 2). REMARQUE: Si l’image montre une saturation de la luminescence, réduisez le temps d’exposition.</li>
	</ol></li>
	<li>Détection des métastases cérébrales par imagerie GFP.<ol><li>Préparation des tissus cérébraux.<ol><li>Environ 8 à 10 semaines après l’injection de cellules ou lorsque les souris sont moribondes en raison de la charge de métastases cérébrales, euthanasier les souris par inhalation d’une surdose d’isoflurane suivie d’une luxation cervicale, conformément aux protocoles approuvés par l’IACUC.</li>
			<li>Après l’euthanasie à l’isoflurane suivie d’une luxation cervicale, vaporisez les souris avec une solution d’éthanol à 70% et retirez la fourrure de la tête et des oreilles avec des ciseaux. Ensuite, faites une incision dans la région cervicale du cou (en prenant soin de ne pas décapiter la souris). Coupez le crâne et retirez-le. Ensuite, retirez soigneusement le cerveau.</li>
			<li>Placez les cerveaux collectés dans des cassettes de tissu.</li>
			<li>Transférer les cassettes dans un récipient avec 1x DPBS froid. REMARQUE: Les échantillons de cerveau ne doivent pas être conservés dans 1x DPBS pendant plus de 1 heure. Si plusieurs échantillons de cerveau doivent être prélevés en même temps, euthanasier seulement quelques souris à la fois (10 par tour).</li>
		</ol></li>
		<li>Imagerie stéréomicroscopique.<ol><li>Transférer tout le cerveau sur un couvercle de tissu de 100 cm.</li>
			<li>Allumez le stéréomicroscope et la lumière UV, en position 3 avec la lentille 0,5x, pour permettre la visualisation de l’ensemble du cerveau comme le montre la figure 3A (carré rouge).</li>
			<li>Appuyez sur Live view (Figure 3A, carré vert).</li>
			<li>Concentrez la vue pendant que le cerveau est en position ventrale.</li>
			<li>Sélectionnez GFP (si les cellules sont marquées GFP) ou TXRED (si les cellules sont marquées RFP) (Figure 3A, carré jaune) dans le logiciel, sélectionnez le filtre approprié sur le microscope et prenez une photo. REMARQUE: Maintenez le réglage de la source lumineuse SOLA à environ 30%; si la GFP est trop brillante, réduire jusqu’à ce que le signal approprié soit observé.</li>
			<li>Sans déplacer l’échantillon, allumez la lumière vive et sélectionnez BF (Figure 3A, carré jaune). Prenez une photo.</li>
			<li>Répétez les étapes précédentes avec le cerveau en position dorsale. REMARQUE: Selon la taille, la même lésion de métastase cérébrale GFP positive peut apparaître dans les positions ventrale et dorsale. Dans un tel cas, éviter la quantification en double de la même lésion. Enregistrez les images avec une extension TIFF (qui conserve toutes les informations dans le fichier image).</li>
			<li>Enregistrez les images avec une extension TIFF (qui conserve toutes les informations dans le fichier image).</li>
			<li>Répétez les étapes pour tous les échantillons.</li>
			<li>Convertissez les images TIFF en JPEG afin que les fichiers puissent être ouverts avec n’importe quel ordinateur sur lequel le logiciel associé n’est pas installé (Fichier | Import/Export | convertir des fichiers).</li>
			<li>Pour fusionner l’image fluorescente avec l’image en champ clair, ouvrez les deux images et accédez à Fichier | Fusionner les canaux. Sélectionnez les composants appropriés, vert pour GFP et fond clair pour BF, puis appuyez sur OK. Enregistrez l’image fusionnée.</li>
			<li>Pour quantifier la zone tumorale cérébrale, utilisez l’image fluorescente. Sélectionner une mesure | Mesure manuelle | de la région. Sélectionnez la sélection automatique (Figure 3B, carré vert), déplacez la flèche vers la zone GFP positive et cliquez pour créer automatiquement une sélection. Cliquez à nouveau pour confirmer la sélection, puis toutes les mesures s’afficheront (Figure 3B, carré rouge). Si plus d’une zone positive à la GFP est présente, répétez la procédure.</li>
		</ol></li>
		<li>Une fois les images cérébrales obtenues, passez aux protocoles de fixation tissulaire de routine en utilisant du formol tamponné neutre à 10%.<ol><li>Une fois les cerveaux fixés, procéder à une section histologique standard suivie d’une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine pour confirmer la présence de métastases cérébrales et de coloration immunohistochimique pour détecter les marqueurs sélectionnés. REMARQUE: L’immunocytochimie a été réalisée au laboratoire de pathologie de base du UT MD Anderson Cancer Center qui a normalisé le protocole pour la coloration immunohistochimique des marqueurs connus.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Le protocole comprend plusieurs étapes critiques. Les cellules ne doivent pas être conservées sur la glace plus de 1 heure pour maintenir leur viabilité. Des tampons de coton alcoolique doivent être utilisés pour essuyer la queue des souris avant l’injection, en prenant soin de ne pas essuyer trop fort ou trop souvent pour éviter d’endommager la peau de la queue. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est présente dans la suspension cellulaire, pour empêcher les souris de mourir des emboles des vaisseaux sanguins. Maintene...

Les métastases cérébrales sont une complication courante et mortelle des tumeurs malignes systémiques. La plupart des métastases cérébrales proviennent de tumeurs primaires du poumon, du sein ou de la peau, qui représentent collectivement 67 à 80 % descas1,2. Les estimations de l’incidence des métastases cérébrales varient entre 100 000 et 240 000 cas, et ces chiffres peuvent être sous-estimés car l’autopsie est rare chez les patients décédés d’un cancer métastatique3. Les patients présentant des métastases cérébrales ont un pronostic plus sombre et une survie globale plus faible par rapport aux patients sans métastases cérébrales4. Les options de traitement actuelles pour les métastases cérébrales sont en grande partie palliatives et ne parviennent pas à améliorer les résultats de survie pour la plupart des patients5. Ainsi, les métastases cérébrales restent un défi, et le besoin demeure pressant de mieux comprendre les mécanismes de progression des métastases cérébrales afin de développer des thérapies plus efficaces.
L’utilisation de modèles expérimentaux a fourni des informations importantes sur les mécanismes spécifiques de la progression métastatique du cancer du sein vers le cerveau et a permis d’évaluer l’efficacité de diverses approches thérapeutiques 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . Cependant, très peu de modèles peuvent récapituler avec précision et intégralité les subtilités du développement des métastases cérébrales. Plusieurs modèles expérimentaux in vivo ont été générés par inoculation de cellules cancéreuses chez la souris par différentes voies d’administration, y compris les injections orthotopiques, veineuses de la queue, intracardiaques, artérielles intracarotides et intracérébrales. Chaque technique présente des avantages et des inconvénients, comme examiné ailleurs3. Aucun de ces modèles murins, cependant, ne peut reproduire complètement la progression clinique des métastases cérébrales.
Les métastases cérébrales sont particulièrement fréquentes chez les patientes atteintes d’un cancer inflammatoire du sein (CIS), une variante rare mais agressive du cancer du sein primitif. Le CIS représente 1% à 4% des cas de cancer du sein, mais il est responsable d’un pourcentage disproportionné de 10% des décès liés au cancer du sein aux États-Unis17,18. Le CIS est connu pour métastaser rapidement; en effet, un tiers des patients atteints de CIS présentent des métastases à distance au moment du diagnostic19,20. En ce qui concerne les métastases cérébrales, les patients atteints de CIS ont une incidence plus élevée de métastases cérébrales que les patients atteints de CIS21. Récemment, nous avons démontré que la lignée cellulaire MDA-IBC3, dérivée du liquide d’épanchement pleural malin d’un patient atteint d’un IBC ER/PR-/HER2+ qui récapitule les caractéristiques du CIS dans les xénogreffes de souris, a une propension accrue à développer des métastases cérébrales plutôt que des métastases pulmonaires chez la souris lorsqu’elles sont injectées par la veine de la queue, faisant de cette lignée cellulaire un bon modèle pour étudier le développement des métastases cérébrales16.
Nous décrivons ici les procédures permettant de générer des métastases cérébrales par injection de cellules MDA-IBC3 dans la veine de la queue et d’évaluer la charge métastatique par microscopie stéréofluorescente et imagerie par luciférase. Cette méthode a été utilisée pour découvrir les médiateurs clés des métastases du cancer du sein au cerveau et pour tester l’efficacité des interventions thérapeutiques 16,22,23. L’inconvénient de cette technique est qu’elle ne récapitule pas toutes les étapes du processus métastatique cérébral. Néanmoins, ses principaux avantages comprennent la robustesse et la reproductibilité, l’implication de la biologie des métastases pertinentes de l’intravasation, la traversée des poumons et l’extravasation dans le cerveau, et sa relative simplicité en termes de technique.

<table><tbody><tr><td>Culture cellulaire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1000 & micro ; Pointe de pipette en L filtrée Genesee</td><td>Scientific</td><td>23430</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipettes sérologiques</td><td>Genesee Scientific</td><td>12-112</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique-antimycosique&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>1 %</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger 15 mL en vrac</td><td>Genesee Scientific</td><td>28103&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp ; 500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine</td><td>GIBICO Inc. USA</td><td>MT10080CV</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Compteur de cellules automatisé (Invitrogen)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf centufuge 5810R</td><td>Eppendorf&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>GIBICO Inc. États-Unis</td><td>16000044</td><td>10 %</td></tr><tr><td>Fisherbrand &nbsp ; Filtres à cellules stériles (40 &mu ; m)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td>1 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>d’insuline&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12585014</td><td>5 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>d’Invitrogen&nbsp ; Lames de chambre de comptage de cellules Countess</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Lignées cellulaires MDA-IBC3</td><td>MD Anderson Cancer Center</td><td></td><td>Généré par le laboratoire du Dr Woodward24</td></tr><tr><td>Luciferase&ndash ; protéine fluorescente verte (Luc&ndash ; GFP) plasmide</td><td>System Biosciences</td><td>BLIV713PA-1</td><td></td></tr><tr><td>microtubes transparents stériles 1,7 mL</td><td>Genesee Scientific</td><td>24282S</td><td></td></tr><tr><td>Olympus 10 &micro ; L Reach Barrier Tip, à faible liaison, en rack, stérile</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-401C&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Fioles traitées TC (T75), 250 ml, Vent</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-209</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0,4 %) à utiliser avec le compteur de cellules automatisé Countess</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>Injection de veine de queue</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J - SCID/Beige</td><td>Envigo</td><td>SCID/beige</td><td></td></tr> souris <tr><td>BD Seringue à insuline avec l’aiguille ultra-fine BD 0,5 ml 30Gx1/2" (12,7 mm)</td><td>BD</td><td>328466</td><td></td></tr><tr><td>Plas Labs &nbsp ; Dispositifs de contention pour rongeurs de type broome</td><td>Plas Labs 551BSRR</td><td>01-288-32A</td><td>Commander parThermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95 % SDA (190 Proof)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50420872</td><td>70 % used</td></tr><tr><td>Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp ; Lo-Dose&nbsp ; U-100 Seringues à insuline</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Unités de filtre PES jetables 0,45 & micro ; m</td><td>Fisherbrand</td><td>FB12566501</td><td>système de filtration pour stériliser la D-luciférine</td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>Biosynth</td><td>L8220-1g</td><td>concentration en stock = 47,6 mM (15,15 mg/mL) ; concentration d’utilisation = 1,515 mg/mL</td></tr><tr><td>1,7 mL microtube ambré</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-282AM</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Veterinary</td><td>NDC-14043-704-06</td><td>Anesthésique liquide à utiliser dans un vaporisateur d’anesthésique</td></tr><tr><td>IVIS 200&nbsp ;</td>Machine <td>PerkinElmer</td><td></td><td>pour l’imagerie de la luciférase, jusqu’à 5 souris en même temps, avec appareil d’anesthésie</td></tr><tr><td>Récipients en plastique avec couvercles&nbsp ;</td><td>Fisherbrand</td><td>02-544-127</td><td></td></tr><tr><td>Cassettes de mouchoirs</td><td>Thermo Scientific</td><td>1000957</td><td></td></tr><tr><td>Webcol Alcohol Prep&nbsp ;</td><td>Covidien</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>Imagerie stéréomicroscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope AZ100&nbsp ;</td>Modèle <td>Nikon</td><td>AZ-STGE</td><td>logiciel NIS-ELEMENT</td></tr><tr><td>Formalin 10 %</td><td>Fisher Chemical</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>TC paraboles traitées 100x20 mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25202</td><td></td></tr></tbody></table>

modélisation des métastases cérébrales par injection veineuse de cellules inflammatoires du cancer du sein

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

La propagation métastatique au cerveau est une manifestation courante et dévastatrice de nombreux types de cancer. Rien qu’aux États-Unis, environ 200 000 patients reçoivent un diagnostic de métastases cérébrales chaque année. Des progrès significatifs ont été réalisés dans l’amélioration des résultats de survie des patientes atteintes d’un cancer du sein primitif et de tumeurs malignes systémiques; Cependant, le pronostic sombre pour les patients atteints de métastases cérébrales cliniques souligne le besoin urgent de développer de nouveaux agents thérapeutiques et stratégies contre cette maladie mortelle. Le manque de modèles expérimentaux appropriés a été l’un des principaux obstacles à l’avancement de notre compréhension de la biologie et du traitement des métastases cérébrales. Ici, nous décrivons un modèle murin xénogreffé de métastases cérébrales générées par injection veineuse de la queue d’une lignée cellulaire amplifiée endogène HER2 dérivée du cancer inflammatoire du sein (CIS), une forme rare et agressive de cancer du sein. Les cellules ont été marquées avec de la luciférase luciole et de la protéine de fluorescence verte pour surveiller les métastases cérébrales, et quantifiées la charge métastatique par imagerie par bioluminescence, stéréomicroscopie fluorescente et évaluation histologique. Les souris développent de manière robuste et cohérente des métastases cérébrales, ce qui permet d’étudier les médiateurs clés du processus métastatique et de développer des tests précliniques de nouvelles stratégies de traitement.

Avec la justification que les cellules marquées facilitent la surveillance et la visualisation des métastases cérébrales dans des modèles murins précliniques, nous avons marqué les cellules MDA-IBC3 avec Luc et avec GFP pour surveiller les métastases cérébrales et quantifier la charge métastatique en utilisant l’imagerie par bioluminescence et la stéréomicroscopie fluorescente. L’injection des cellules MDA-IBC3 marquées dans les veines caudales de souris immunodéprimées SCID/Beige a entraîné des pourcentages élevés de mé...

Nous décrivons un modèle murin xénogreffé de métastases cérébrales du cancer du sein générées par injection veineuse de la queue d’une lignée cellulaire de cancer inflammatoire du sein amplifiée par HER2 de manière endogène.

Modélisation des métastases cérébrales par injection veineuse de cellules inflammatoires du cancer du sein

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...

Nous avons utilisé la méthode de la veine de la queue pour générer des métastases cérébrales dans des modèles murins utilisant des lignées cellulaires dérivées de patientes atteintes d’un cancer inflammatoire du sein, ou IBC, une forme très agressive de cancer du sein primitif. La génération de métastases cérébrales dans des modèles murins implique généralement des injections artérielles intracardiaques ou intracarotidiennes. Cependant, la méthode de la veine de la queue offre un avantage par rapport à ces techniques car elle imite mieux les étapes de la colonisation des métastases cérébrales et est relativement simple à réaliser.Les docteurs Xiaoding Hu et Emilly Villodre, tous deux instructeurs dans mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour détecter les métastases cérébrales par imagerie GFP huit à 10 semaines après l’injection de cellules tumorales, désinfectez la souris avec de l’éthanol à 70% et retirez la fourrure de la tête et des oreilles. Coupez la région cervicale du cou.Excise et retirez le crâne pour permettre au cerveau d’être récolté. Placez le cerveau dans une cassette de tissu et placez la cassette dans un récipient de DPBS froid pendant pas plus d’une heure. Pour l’imagerie par stéréomicroscopie, transférer le cerveau dans un couvercle de tissu de 100 centimètres sous un stéréomicroscope équipé d’une lumière UV et sélectionner l’objectif 0,5x pour permettre la visualisation de l’ensemble du cerveau.Appuyez sur la vue en direct et concentrez-la pendant que le cerveau est en position ventrale. Sélectionnez le filtre approprié dans le logiciel et le microscope pour le marqueur fluorescent dans les cellules, et prenez une photo. Sans déplacer l’échantillon, passez à l’imagerie en fond clair et sélectionnez le filtre de fond clair.Prenez une photo. Ensuite, imagez le cerveau en position dorsale comme démontré précédemment. Pour analyser les images du cerveau entier, convertissez d’abord les fichiers image de TIFF en JPEG afin qu’ils puissent être ouverts avec n’importe quel ordinateur qui ne dispose pas du logiciel associé.Ensuite, ouvrez une paire d’images en fond clair et fluorescentes et sélectionnez Fichier et fusionner les canaux. Sélectionnez les composants appropriés, cliquez sur OK et enregistrez l’image fusionnée. Pour quantifier la zone de tumeur cérébrale dans l’image fluorescente, sélectionnez la sélection automatique.Déplacez la flèche vers la zone de position GFP et cliquez pour créer une sélection automatiquement. Cliquez ensuite à nouveau pour confirmer la sélection. Toutes les mesures seront affichées.Si plus d’une zone positive à la GFP peut être observée, répétez la mesure avec la zone suivante. Les lésions métastatiques cérébrales peuvent être détectées dès huit semaines après l’injection par imagerie par luciférase et microscopie stéréo-fluorescente. Après l’imagerie, des parties des métastases cérébrales peuvent être fixées au formol et traitées pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine afin de valider la présence de lésions de métastases cérébrales, et pour la coloration immunohistochimique afin de détecter des marqueurs protéiques spécifiques d’intérêt.Lors de l’essai de ce protocole, il est important de maintenir la viabilité cellulaire en gardant les cellules sur la glace pendant pas plus d’une heure, et d’éviter les bulles d’air dans la suspension cellulaire pour prévenir la formation d’embolies et la mortalité des souris. Après l’injection de la veine de la queue, nous surveillons la croissance et la progression des métastases cérébrales avec l’imagerie de la luciférase. Après euthanasie, la microscopie stéréo-fluorescente et l’histologie ont confirmé les lésions de métastases.

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Cette vidéo décrit une technique d’injection de cellules cancéreuses marquées par injection de veine de queue dans un modèle murin. Nous surveillons davantage la formation et la croissance des métastases du cancer du sein à l’aide de l’imagerie en temps réel d’animaux vivants in vivo.

Injection dans la veine caudale : méthode d’administration de cellules cancéreuses pour des études métastatiques dans un modèle murin

Source : Lim, M.,  et al. Modélisation des métastases cérébrales par injection de cellules cancéreuses dans l’artère carotide interne. J. Vis. Exp. (2022)Dans cette vidéo, une souris anesthésiée subit une intervention chirurgicale au cours de laquelle des cellules cancéreuses sont injectées dans l’artère carotide commune (ACC) pour faciliter l’administration ciblée au cerveau. La procédure implique une suture précise et une manipulation des artères carotides pour diriger les cellules injectées...

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L'approche décrite combine des tests expérimentaux de métastaser de veine de queue avec l'imagerie animale vivante in vivo pour permettre la surveillance en temps réel de la formation et de la croissance de métastes de cancer du sein en plus de la quantification du nombre et de la taille des métastes dans les poumons.

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Les métastases cérébrales sont une cause de morbidité et de mortalité sévères chez les patients atteints de cancer. La plupart des modèles murins de métastases cérébrales sont compliqués par des métastases systémiques confondant l’analyse de la mortalité et des résultats des interventions thérapeutiques. Présenté ici est un protocole pour l’injection carotidienne interne de cellules cancéreuses qui produit des tumeurs intracrâniennes cohérentes avec des tumeurs systémiques minimales.

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Modélisation des métastases cérébrales par injection veineuse de cellules inflammatoires du cancer du sein

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