Méthodes de microscopie multi-temps pour la caractérisation de microbulles marquées par fluorescence pour la libération de médicaments déclenchée par ultrasons

Ce protocole peut être utilisé pour caractériser la réponse des microbulles marquées par fluorescence qui sont conçues pour les applications d’administration de médicaments déclenchées par ultrasons, y compris les mécanismes d’activation et les bioeffets. La clé réside dans la combinaison de techniques d’imagerie qui nous permet de démêler le problème multi-échelle de l’administration de médicaments déclenchés par ultrasons avec des bulles, à la fois à différentes échelles spatiales et à différentes échelles de temps. Pour l’imagerie à bulle unique par microscopie Brightfield, placez une aiguille de ventilation de calibre 19 et utilisez une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 19 pour retirer une petite quantité de la suspension de microbulles du flacon en verre dans un petit tube pour faciliter le pipetage à l’étape suivante.

À l’aide d’une pipette, diluer la solution de microbulles dans une solution saline tamponnée au phosphate filtré. Utilisez une seringue de 10 millilitres pour injecter l’échantillon dans une sortie du porte-échantillon jusqu’à ce que le support soit plein sans créer de bulles d’air, en injectant plus d’échantillon si nécessaire. Fermez les deux valves du porte-échantillon et placez le porte-échantillon perpendiculairement à l’axe optique du microscope.

Avant l’analyse de l’échantillon, réglez la fréquence d’entraînement des ultrasons et la pression acoustique souhaitées sur le générateur de forme d’onde arbitraire et en commençant par le champ de vision à un coin du porte-échantillon, utilisez l’étage XYZ pour déplacer le support afin de localiser des microbulles simples dans le champ de vision du microscope, puis fixez une fibre optique connectée à un bain-marie à une lumière stroboscopique et démarrez l’enregistrement. Répétez l’imagerie autant de fois que vous le souhaitez par réglage de l’échographie, en déplaçant le porte-échantillon d’au moins deux millimètres vers un champ de vision contenant des microbulles non coniques pour chaque analyse. Pour l’imagerie microscopique à fluorescence des microbulles, après avoir dilué la solution de microbulles dans une solution saline tamponnée au phosphate comme démontré, réglez la fréquence d’entraînement des ultrasons et la pression acoustique souhaitées sur le générateur de forme d’onde arbitraire et réglez le délai de déclenchement du laser sur le générateur de retard d’impulsion pour l’excitation de fluorescence des nanoparticules à partir des microbulles, puis utilisez l’étage XYZ pour déplacer le porte-échantillon afin de localiser les microbulles simples et de les mettre au centre de l’objectif, puis déclenchez l’enregistrement.

Répétez l’imagerie comme vous le souhaitez en modifiant les paramètres de l’échographie et en déplaçant le porte-échantillon vers le nouveau champ de vision comme illustré. Pour l’imagerie par microscopie intravitale, placez d’abord un support d’animal chauffé sur l’étage de positionnement XY entre le guide d’ondes et l’objectif et ajoutez du gel de couplage au guide d’ondes. Insérez un cathéter de veine caudale dans la veine caudale d’une souris anesthésiée porteuse de tumeur et placez la souris équipée d’une chambre de fenêtre dans le support chauffant.

Ajouter une gouttelette d’eau au couvercle. Pour visualiser le système vasculaire du tissu tumoral, injectez par voie intraveineuse 30 microlitres de quatre milligrammes par millilitre marqués par fluorescence 2 mégadaltons dextran dans le cathéter de la veine caudale et utilisez l’étape de traduction XY pour déplacer la souris jusqu’à ce qu’un champ de vision avec des vaisseaux sanguins appropriés puisse être localisé. Ajustez la fréquence d’images, le champ de vision et la durée de l’enregistrement en fonction des paramètres de l’expérience et enregistrez des images de base des navires.

Lorsque les images de base ont été acquises, réglez la fréquence d’entraînement des ultrasons, la longueur de l’impulsion et l’amplitude de la pression acoustique sur le générateur de forme d’onde arbitraire et injectez par voie intraveineuse 50 microlitres d’échantillon de microbulles dans la veine caudale. Ensuite, imaginez la vascularisation comme démontré. L’analyse des microbulles par microscopie confocale à fluorescence révèle une distribution de particules non uniforme de la coquille de microbulle.

La structure globale des microbulles peut être visualisée davantage par microscopie électronique à balayage. L’analyse de la dynamique radiale et du comportement phénoménologique des microbulles insonifiées par microscopie à fond clair permet d’évaluer le changement relatif du rayon des microbulles au fil du temps. Ici, une séquence d’images d’une livraison réussie typique de nanoparticules marquées par fluorescence est montrée.

Les nanoparticules incorporées dans la coquille de microbulles peuvent être observées à fluorescence lorsque la lumière laser atteint la bulle. Comme observé dans cette livraison infructueuse, cependant, les nanoparticules fluorescentes s’allument sur la coquille de la microbulle, qui reste intacte pendant l’exposition aux ultrasons. L’imagerie multiphotonique intravitale peut être utilisée pour déterminer l’extravasation spatiale et temporelle des nanoparticules pendant l’exposition aux ultrasons, ce qui peut être bénéfique pour comprendre et optimiser les mécanismes sous-jacents à l’administration de nanoparticules médiées par ultrasons.

Avec l’alignement parfait des voies optiques et acoustiques à toutes les échelles de temps et de longueur, un aperçu complet de l’administration de médicaments déclenchés par ultrasons est fourni. Les réponses apportées par nos expériences multi-échelles seront désormais traduites en pratique clinique. Les résultats fourniront des informations précieuses pour une gamme d’applications thérapeutiques, y compris le traitement du cancer.