Impression 3D de microporteurs d’hydrogel in vitro par jet de force visqueuse-inertielle alternée

Nous proposons un procédé bio-imprimé doux pour la préparation de microporte-porteuses avec une bonne contrôlabilité et biocompatibilité. Après encapsulation par les cellules, les porteurs peuvent également être utilisés dans l’expansion cellulaire in vitro et la construction de microtissus fonctionnels. Un déplacement limité, plutôt que des forces sévères dans des conditions similaires, agissent sur la buse pendant le processus d’impression, en maintenant au maximum les propriétés physiques / chimiques d’origine de la bio-encre.

En plus des microtransporteurs conventionnels, des unités avec distribution cellulaire interne ou des structures de capsule encapsulées dans la tritosine peuvent être construites et appliquées à l’assemblage de différentes structures tissulaires. Pour la préparation de la buse, chargez des micropipettes en verre sur l’extracteur conformément aux instructions du fabricant et définissez les paramètres de traction de l’extracteur. Utilisez une microforge pour couper la buse au diamètre désigné afin d’obtenir le diamètre de pointe spécifique pour l’expérience, et stérilisez la buse dans de l’alcool pendant cinq minutes.

Ensuite, rincez la buse trois fois avec de l’eau stérile pour éliminer tout alcool résiduel. Pour préparer la bio-encre d’hydrogel, diluer la solution mère d’alginate de sodium stérilisée à 4 % dans du chlorure de sodium à 0,9 % à des concentrations de 0,5, 1, 1,5 et 2 % poids par volume. Pour la formation de microgouttelettes, chargez cinq millilitres de bio-encre dans une seringue stérile jetable et installez la seringue sur une pompe à seringue.

À l’aide d’un tuyau de diamètre intérieur d’un millimètre, connectez la seringue et la buse d’impression. Serrez la vis de serrage pour fixer la buse en place et appuyez rapidement sur la pompe à seringue pour charger la bio-encre dans la buse. Réglez les paramètres du générateur de signaux et préréglez la trajectoire de mouvement et le mode de déclenchement de la vibration pour qu’ils tombent à la demande.

Imprimez ensuite les gouttelettes en suivant les motifs prédéfinis. Pour la formation de microporteurs, ajoutez cinq millilitres de solution de réticulation à une boîte de Pétri et placez la boîte sous la buse d’impression comme substrat. Après l’impression, reliez les microtransporteurs pendant trois minutes avant de transférer la suspension du microtransporteur dans un tube de centrifugeuse.

Ensuite, enrichissez les microporteurs par centrifugation et remettez-les en suspension dans un milieu de culture approprié à environ 600 microporteurs par millilitre. Avant leur inoculation, remplacez le surnageant d’une culture cellulaire A549 par cinq millilitres de milieu sans sérum complété par un colorant CMFDA vert tracker de cellules 10 micromolaires pour une incubation de 30 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire. À la fin de l’incubation, remplacer la solution de colorant par un milieu frais et remettre les cellules en suspension à une densité de 1,6 fois 10 à six cellules par millilitre de milieu.

Ajouter un millilitre de suspension de microporteur aux cellules et un millilitre de cellules A549 à chaque puits d’une plaque de culture à six puits peu adhérente. Placez la plaque sur un agitateur dans l’incubateur de culture cellulaire à 30 tours par minute. À la fin de l’incubation, retirez la plaque du shaker et laissez les microtransporteurs se déposer pendant 30 minutes avant d’observer et de mesurer la buse d’impression, les boîtes de Petri et les cellules inoculées par microtransporteur par microscopie à fluorescence confocale et à champ lumineux.

À l’aide d’une buse à pointe de 30 micromètres, plusieurs types de bio-encre, y compris le PBS, l’alginate à 1,5% et la gélatine à 1,5%, peuvent être imprimés de manière stable sur des boîtes de Pétri. À mesure que la viscosité des encres augmente, le processus d’impression devient de plus en plus difficile et des forces motrices plus importantes sont nécessaires pour obtenir des gouttelettes plus grosses. Les paramètres d’impression peuvent être définis pour imprimer les gouttelettes dans des arrangements 2D spécifiques, comme observé dans cette expérience d’impression.

Le diamètre de la pointe de la buse a un impact direct de la taille du microporteur qui peut être imprimé. Comme on l’observe dans ces images en champ lumineux et confocales, les cellules A549 adhèrent aux microtransporteurs d’alginate-collagène après deux jours de culture. Après six jours, les cellules A549 couvrent presque entièrement les surfaces des microtransporteurs.

Suite à cette procédure, nous avons recouvert la surface du microtransporteur de chitosane et utilisé du gluconate pour dissoudre le gel d’alginate afin de former une structure kystique qui peut être appliquée pour construire des structures creuses telles que les alvéoles. Le processus d’impression pour la préparation des microporteurs est assez doux, ainsi, cette méthode peut être largement utilisée pour imprimer des microporteurs contenant des cellules.