Cryo-EM et analyse monoparticule avec Scipion

Scipion fournit les outils pour créer l’ensemble du flux de travail de traitement de manière intégrative pour une analyse de particule unique en cryo-EM afin d’obtenir une reconstruction à haute résolution de l’échantillon biologique. Ce cadre permet de créer le workflow de traitement à l’aide de plusieurs packages de traitement d’images, favorisant l’interopérabilité, la traçabilité, la reproductibilité, et la combinaison d’informations véhiculées par différentes méthodes pour générer une sortie plus précise. Scipion est en croissance constante, y compris de nouvelles méthodes et de nouveaux emballages.

De plus, il a été étendu à la cryo-tomographie électronique et à la modélisation atomique, permettant également de créer des flux de travail pour traiter ces données. Pour créer un projet dans Scipion, cliquez sur Créer un projet pour créer le projet. Pour importer les films de microscope, sélectionnez Importer des films.

Une nouvelle fenêtre apparaîtra. Dans cette fenêtre, entrez le chemin d’accès aux données et réglez la tension du microscope sur 300 kilovolts, l’aberration sphérique sur deux millimètres, le contraste d’amplitude sur 0,1, le taux de grossissement sur 50 000, le mode taux d’échantillonnage sur L’image de et la taille du pixel sur 1,34 angstroms. Lorsque tous les paramètres ont été définis, cliquez sur Exécuter.

Une fois la méthode terminée, ouvrez l’onglet Résumé, cliquez sur Analyser les résultats. Une nouvelle fenêtre apparaîtra avec une liste des sorties générées par la méthode. Pour exécuter la méthode de flux optique pour l’alignement des films, ouvrez la méthode d’alignement optique xmipp3, sélectionnez les films importés comme films d’entrée et définissez les images sur aligner la plage de 2 à 13.

Sous Paramètres supplémentaires, définissez l’option Utiliser l’alignement du film précédent sur les images SOMME sur Non.Laissez toutes les autres options définies sur leurs valeurs par défaut et exécutez le programme. Cliquez sur Analyser les résultats pour vérifier les micrographies obtenues et la trajectoire des décalages estimés. Pour chaque micrographie, il est possible de vérifier la densité spectrale de puissance, les trajectoires obtenues pour aligner le film en coordonnées cartésiennes et polaires, et le nom de fichier de la micrographie obtenue.

Notez que les particules de l’échantillon sont beaucoup plus visibles dans la micrographie par rapport à une seule image du film. Pour le prélèvement de particules, ouvrez la méthode de prélèvement manuel xmipp3 et sélectionnez les micrographies précédemment obtenues comme micrographies d’entrée. Cliquez sur Exécuter.

Une nouvelle fenêtre interactive apparaîtra. Dans cette fenêtre, modifiez la taille des pixels à 150. La micrographie sélectionnée apparaîtra dans une fenêtre plus grande.

Choisissez toutes les particules visibles dans une région. Lorsque toutes les particules ont été sélectionnées manuellement, cliquez sur Activer la formation pour démarrer l’apprentissage. Les régions restantes de la micrographie seront automatiquement sélectionnées.

Vérifiez les particules cueillies. Pour inclure une particule supplémentaire, cliquez sur une particule d’intérêt. Pour supprimer les particules incorrectes, maintenez la touche Maj enfoncée et cliquez sur les particules si nécessaire.

Lorsque toutes les particules ont été automatiquement sélectionnées, sélectionnez les quatre micrographies suivantes une à la fois pour créer un ensemble d’entraînement représentatif. Les particules de chaque micrographie sélectionnée seront automatiquement sélectionnées, en vérifiant chaque micrographie pour inclure ou éliminer les particules si nécessaire. Lorsqu’un jeu d’entraînement a été acquis, cliquez sur Coordonnées pour enregistrer les coordonnées de toutes les particules sélectionnées.

Après avoir acquis l’ensemble d’entraînement, ouvrez xmipp3 auto-picking pour indiquer le picking manuel précédent dans Xmipp particle picking run et réglez Micrographs sur Pick sur Same comme supervisé. Cliquez sur Exécuter pour générer un ensemble d’environ 100 000 coordonnées. Pour appliquer l’approche consensuelle, ouvrez le prélèvement cryolo sphire et définissez les micrographies prétraitées comme micrographies d’entrée dans le modèle de prélèvement sur la valeur par défaut.

Définissez le seuil de confiance sur 0,3 et la taille de la boîte sur 150, puis cliquez sur Exécuter. La méthode devrait également générer environ 100 000 coordonnées. Ensuite, ouvrez la sélection de consensus profond xmipp3 et définissez les coordonnées d’entrée pour inclure la sortie de la sphire cryolo et de la sélection automatique xmipp3, le type de modèle Select à pré-entraîné et l’entraînement Skip et marquez directement avec le modèle pré-entraîné sur Oui, puis cliquez sur Exécuter.

À la fin de l’exécution, cliquez sur Analyser les résultats. Dans la nouvelle fenêtre, cliquez sur l’icône en forme d’œil. Une deuxième nouvelle fenêtre s’ouvrira avec une liste de toutes les particules.

Les valeurs du score Z dans la colonne donneront un aperçu de la qualité de chaque particule, car une valeur faible indique une mauvaise qualité. Pour classer les particules du score Z le plus élevé au score Z le plus bas, cliquez sur Xmipp Z-score deep learning et sélectionnez les particules dont le Z-score est supérieur à 0,75. Cliquez ensuite sur Coordonnées pour créer un nouveau sous-ensemble avec environ 50 000 coordonnées.

Pour calculer la résolution localement, ouvrez xmipp3 local MonoRes et réglez le volume d’entrée sur la sortie de la dernière étape de raffinement, le Souhaitez-vous utiliser des demi-volumes sur Oui et la plage de résolution de 1 à 10 angstroms. Une fois les paramètres définis, cliquez sur Exécuter. Une fois la résolution calculée, cliquez sur Analyser les résultats et sélectionnez Afficher l’histogramme de résolution et Afficher les tranches colorées.

La résolution dans les différentes parties du volume sera affichée. La plupart des voxels des parties centrales des structures devraient représenter des résolutions autour de trois angströms, tandis que les pires résolutions seront observées dans les régions extérieures des structures. Un histogramme des résolutions par voxel avec un pic autour ou en dessous de trois angströms sera également affiché.

Pour appliquer une netteté, ouvrez la netteté de l’écrou local xmipp3 et sélectionnez la sortie de la dernière étape d’affinement en tant que carte d’entrée, puis définissez la carte de résolution sur la carte MonoRes obtenue. Une fois la commande exécutée, double-cliquez sur l’ensemble des volumes générés en sortie dans l’onglet Résumé. Les volumes générés dans chaque itération peuvent être vérifiés.

Il est également recommandé d’ouvrir le volume avec d’autres outils, tels que UCSF Chimera, pour mieux observer les caractéristiques du volume en 3D. Dans cette figure, on peut observer une corrélation de coquille de Fourier de trois angströms, qui est très proche de la limite de Nyquist. Comme illustré, les tranches de volume 3D reconstruites présentent un haut niveau de détail et des structures bien définies.

Après analyse locale, la plupart des voxels centraux atteignent une résolution inférieure à trois angströms. Les régions extérieures des tranches de résolution locales présentent toutefois une résolution inférieure, ce qui est cohérent avec le flou observé dans ces zones. Après post-traitement, les fréquences plus élevées du volume de la carte 3D peuvent être observées, révélant plus de détails et améliorant la représentation.

Lorsque la résolution obtenue est suffisamment élevée, même certaines parties biochimiques de la structure peuvent être observées. Si la structure obtenue a une faible résolution et ne peut pas évoluer vers une meilleure, un volume flou avec une faible corrélation de coquille de Fourier, une courbe de résolution et un histogramme de l’estimation locale peuvent être observés. Après le prélèvement, la classification 2D peut être vérifiée pour évaluer la qualité des particules.

Par exemple, dans cette classification, les particules sont bruyantes, non centrées ou couplées, ce qui indique que le prélèvement était incorrect. Un autre point de contrôle peut être effectué lors de l’estimation initiale du volume. Dans cet exemple, une mauvaise estimation a été créée à l’aide d’une configuration incorrecte pour la méthode.

Une fois qu’une carte 3D avec une résolution suffisante est produite, l’étape suivante consiste à proposer un modèle atomique pour la carte. Cela peut être fait dans Scipion en utilisant les plugins de modélisation. Cette technique peut être utilisée pour reconstruire avec succès des macromolécules biologiques afin d’évaluer leurs interactions moléculaires et leur fonction d’ensemble biologique comme base pour la conception de médicaments.