Criblage de fragments basé sur la RMN dans un échantillon minimum mais un mode d’automatisation maximal

Nous menons des études de résonance magnétique nucléaire. Cela nous permet de déterminer les structures des protéines, de l’ARN et de l’ADN en solution. Ces biomolécules sont les constituants, sont les composants de nos cellules, et nos protocoles que nous présentons ici concernent le criblage de petites molécules et leur liaison à ces cibles.

De ces molécules, notre chimie médicinale et notre biologie structurale peuvent dériver de nouveaux médicaments qui combattent les maladies. Le principal avantage de notre technique est que nous avons un contrôle total sur la qualité des cibles moléculaires, comme les protéines, et nous avons un contrôle total sur la qualité des fragments de petites molécules et des médicaments, et nous pouvons également cribler les protéines pour la liaison d’un large éventail d’affinités, ce qui est un avantage par rapport à d’autres méthodologies. Pour préparer des échantillons de criblage pour la mesure RMN, utilisez un robot de préparation d’échantillons pour distribuer 768 composés dans huit plaques de 96 puits afin d’obtenir 64 mélanges contenant 12 fragments à une concentration finale de 4,2 millimolaires par mélange.

Transférer la cible biomoléculaire d’intérêt, diluée dans un tampon de criblage approprié, dans le nombre approprié de tubes changeurs d’échantillons RMN à haut débit à code à barres de trois millimètres, et utiliser le robot pour transférer 10 microlitres de chaque mélange de ligands dans chaque tube de biomolécule cible. Ensuite, demandez au robot de bien mélanger les solutions. Pour l’acquisition RMN, chargez l’échantillon dans le spectromètre.

Ouvrez le logiciel du spectromètre, puis sélectionnez le jeu de paramètres et les séquences d’impulsions pour les expériences basées sur les ligands. Pour toutes les expériences répertoriées, sélectionnez la sculpture d’excitation comme suppression de l’eau. Pour le criblage du fluor 19, sélectionnez les expériences 1D et T2.

Sélectionnez la largeur spectrale à 220 parties par million, la fréquence d’excitation à 140 parties par million et le temps d’analyse entre une et cinq heures. Pour T2, le temps CPMG devrait alterner entre 5 et 100 millisecondes. Enregistrez les expériences T1r et T2.

Enregistrez la différence de transfert de saturation sous forme de pseudo 2D. Pour traiter les deux spectres 1D simples, utilisez la fonction ProcStd du programme AU, avec ou sans l’option relax. Le WaterLOGSY est un 1D unique qui doit être phasé avec un signal négatif pour le solvant.

Pour analyser les données de criblage de l’hydrogène, suivez les instructions de l’outil de criblage à base de fragments pour stocker les données RMN par résonance magnétique biomoléculaire des campagnes de criblage, de sorte que chaque mélange de criblage ait son répertoire dans lequel un sous-répertoire contient les différentes expériences mesurées sur l’échantillon. Stockez les spectres de référence, en ayant toutes les données enregistrées à partir des échantillons sans la cible biomoléculaire, mais avec les mélanges et le composé unique dans des répertoires différents. Créez un chemin direct vers le répertoire contenant les données acquises et sélectionnez le répertoire RMN dans lequel tous les mélanges doivent avoir un répertoire distinct.

Assurez-vous que le fichier CSV, l’écran de fragments, le document XML et les fichiers BAC sont également copiés dans le répertoire RMN des données. Pour utiliser l’outil de filtrage basé sur des fragments pour un échantillon filtré, faites glisser le symbole du projet de filtrage basé sur des fragments au milieu de la fenêtre d’analyse. Le symbole doit apparaître si les jeux de données précédemment enregistrés y ont été copiés.

La fenêtre des options de filtrage basées sur les fragments devrait s’ouvrir automatiquement. Sélectionnez un fichier cocktail CSV contenant les noms des mélanges, les noms de chaque fragment et la division de chaque fragment en mélanges. Définissez un dossier de spectres de ligand de référence avec tous les spectres mesurés des fragments individuels et définissez un dossier d’expérience de référence vierge, qui contient généralement les jeux de données des mélanges sans la cible étudiée.

Pour définir les spectres étudiés et les couleurs d’affichage des spectres, ouvrez l’onglet Types de spectres et définissez le type de spécification en fonction des données de processus. Dans l’onglet Disposition de l’affichage, définissez les spectres qui seront comparés en fonction des types de spécifications. Ensuite, cliquez sur OK pour démarrer le projet.

Pendant le traitement des données, une fenêtre séparée avec le tableau résumant tous les mélanges de cocktails et les ligands de chaque mélange s’ouvrira. Double-cliquez sur une cellule pour ouvrir les jeux de données respectifs. Avant d’attribuer des liants, assurez-vous que les pics de référence correspondent les uns aux autres et ont le même décalage chimique.

Si des différences sont observées, ouvrez l’onglet Processus et utilisez l’option de traitement série pour les corriger. Pour la première analyse sur les mélanges de fluor 19, ouvrez l’onglet Analyser et sélectionnez la fonction d’intégration. Assurez-vous qu’une zone d’intégration claire pour le signal de fluor 19 correspondant est définie pour chaque fragment du mélange.

Enregistrez les régions d’intégration d’exportation pour exporter le fichier d’intégration pour une utilisation ultérieure et enregistrez tous les fichiers d’intégration utilisés dans le répertoire d’installation approprié. Pour les données sur le fluor 19, ouvrez un jeu de données avec ou sans la cible étudiée et, sous l’onglet Analyser, cliquez sur Intégrer et lire les régions d’intégration d’importation pour charger le fichier d’intégration correspondant dans le spectre actuel. Cliquez ensuite sur Enregistrer et revenir pour rechercher une liste des régions intégrées dans l’onglet Intégrales, puis copiez ces informations dans une feuille de calcul pour une analyse en aval.

La structure moléculaire ou la constitution des ligands dans la bibliothèque de fragments est analysée à l’aide d’un logiciel de confiance moléculaire tel que démontré, et les résultats sont présentés sous forme de sortie graphique. Une couleur orange indique que le fragment présente une incohérence dans la structure ou la concentration. Les puits de couleur verte indiquent que le fragment est cohérent.

Dans cette analyse représentative, 103 fragments contenant un ou plusieurs groupes fluorés de la bibliothèque interne ont été divisés en cinq mélanges de 20 à 21 fragments par mélange. Des expériences de relaxation transversale au fluor 19 ont été mesurées pour chaque mélange appliquant des trains d’impulsions CPMG. Les seuils sont utiles pour définir le liant, le liant faible ou le non-liant dans le mélange, comme observé dans ces spectres typiques de tyrosine kinase A et d’ARN de la protéine thiamine.

Dans cette analyse représentative, le premier coup a montré une diminution de T2 d’environ 50% et un décalage chimique supérieur ou égal à six hertz. Le WaterLOGSY n’a pas montré de changement significatif dans le signal pour être compté comme positif. Cependant, comme deux expériences sur trois étaient positives, ce fragment a été compté comme un succès.

Pour le deuxième coup, le T2 a montré une diminution d’environ 80% de l’intensité du signal. Un changement de signal clair a également été observé pour le WaterLOGSY. Le changement chimique n’était pas suffisant dans cette expérience, mais comme les deux critères précédents étaient positifs, il a quand même été compté comme un succès.

L’objectif final de ces méthodes est de développer de nouveaux médicaments ou des inhibiteurs de haute affinité, par exemple, des enzymes, et en cela, la chimie médicinale prend le relais et synthétise ces nouvelles molécules, mais la biologie de la structure, les techniques que vous appliquez ici peuvent guider la chimie médicinale et rendre cette approche beaucoup plus rapide.