Un test basé sur la spectroscopie de fluorescence à temps efficace pour évaluer l’état de polymérisation de l’actine dans les tissus cérébraux des rongeurs et des humains

L’actine est le composant principal du cytosquelette et régule de manière critique plusieurs aspects de la morphologie et de la physiologie cellulaires, y compris dans les neurones. L’actine se produit en équilibre entre ses deux formes, la G-actine globulaire monomère ou la F-actine filamenteuse polymère. Le statut de polymérisation de l’actine est strictement réglementé à plusieurs niveaux à la fois par les protéines de liaison à l’actine, ainsi que par sa propre régulation post-traductionnelle.

Aux contacts synaptiques interneuronal, les altérations dynamiques des niveaux de F-actine sont un événement régulateur clé, contrôlant la signalisation et la plasticité aux bornes synaptiques pré et post. Sans surprise, le dysfonctionnement d’actine est lié à plusieurs états neuropathological. Les avances récentes ont mené à une richesse de connaissance de l’actine dans la physiologie neuronale et la pathophysiologie.

Cependant, beaucoup de choses sont encore inconnues et doivent être concentrées. À cet égard, les analogues fluorescents de la phalloïde se sont avérés être un outil majeur dans la recherche sur l’actine. Cette phallotoxine se lie spécifiquement à l’actine filamenteuse, et peut donc être utilisée comme mesure directe des quantités de F-actine, et de son altération des états physiopathologiques.

Cette étude présente un essai fluorométrique rapide et efficace pour l’évaluation du statut de polymérisation de l’actine dans des échantillons biologiques ex vivo, tels que des homogénats en gros et des terminaux synaptiques biochimiquement isolés des tissus cérébraux. Il convient de noter que le test peut être appliqué à d’autres types de cellules et de tissus et à leur phénomène physiologique associé. Pour les recettes des tampons utilisés dans cette étude, veuillez vous référer au texte détaillé.

Des échantillons de tissu cérébral provenant de rats ou de sujets humains ont été homogénéisés dans un tube de verre Potter-Elvehjem et un pilon sur glace dans 10 volumes de tampon d’homogénéisation. Pour la préparation du synaptosome, l’homogénat a été filé d’abord à une vitesse lente, puis à une vitesse plus élevée pour obtenir une fraction mitochondriale synaptosomal brute. Des synaptosomes enrichis de cette fraction brute ont été obtenus suivant un gradient discontinu de saccharose.

Pour la préparation synaptoneurosomal, des homogénats ont été séquentiellement passés à travers deux 100 microns et un filtre de 5 microns. L’estimation des protéines a été réalisée à l’aide du réactif de Bradford et des échantillons ont été dilués dans du tampon de Krebs à une concentration de deux à trois milligrammes par protéine mL dans un volume final de 50 microlitres. La stimulation des bornes synaptiques d’isolement, synaptosomes ou synaptoneurosomes, ont été effectuées par une brève augmentation de 30 secondes de potassium extracellulaire à 37 degrés.

Pour cela, un chlorure de potassium molaire a été ajouté aux échantillons à une concentration finale de 15 millimolaires. Les homogénats sont non stimulés et des fragments synaptiques dépolarisés ont été fixés avec du glutaraldéhyde à 2,5%, par l’ajout du volume requis de solution mère de glutaraldéhyde à 25%. Les échantillons ont été incubés pendant deux, trois minutes à température ambiante.

Fixatif a été enlevé par centrifugation à 20, 000 G pendant cinq minutes. Les échantillons ont ensuite été procédé à la perméabilisation par remise en suspension dans un tampon de Krebs contenant 0,1 % de Triton X-100 et 1 mg par mL de borohydrure de sodium pendant deux à trois minutes à température ambiante. Le tampon de perméabilisation a été éliminé à nouveau par centrifugation et le culot a été lavé superficiellement avec du tampon krebs et remis en suspension dans le tampon Krebs contenant 1X phalloïdine Alexa Fluor 647, correspondant à 500 micro unités de phalloïdine.

La reliure a été autorisée à se poursuivre pendant 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité. L’excès de phalloïdine non liée a été retiré des échantillons par centrifugation à 20 000 G pendant cinq minutes, et les pastilles ont été superficiellement lavées avec du tampon de Krebs, et remises en suspension à nouveau dans le tampon de Krebs contenant du saccharose molaire 0,32 pour maintenir la flottabilité des synaptosomes ou des synaptoneurosomes. Des échantillons liés à la phalloïdine fluorescente ont été distribués dans une plaque noire de 96 puits pour la lecture fluorométrique dans un lecteur de plaque.

Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission ont été fixées à 645 nanomètres et 670 nanomètres respectivement. Pour chaque série d’expériences, nous avons inclus différentes quantités de phalloïde Alexa Fluor 647 dans le tampon Krebs contenant 0,32 saccharose molaire. Pour tenir compte de toute perte d’échantillons pendant les étapes de lavage, les échantillons ont été transférés du noir à la plaque transparente de 96 puits.

La capture des échantillons a ensuite été examinée à 440 nanomètres. La rétention de la phalloïde fluorescente est directement proportionnelle à la quantité de filaments d’actine ou aux niveaux de F-actine dans les échantillons. On a observé la linéarité de l’attache de phalloidin dans la gamme de 50 à 200 protéines de microgramme.

Comme preuve de principe, nous avons également testé l’efficacité de notre analyse dans des modèles de dépolymérisation de la F-actine en utilisant une perturbation pharmacologique des filaments d’actine par la latrunculine A, ainsi que la stimulation de la formation de F-actine par stimulation médiée par KCl de terminaux synaptiques isolés. L’émission de fluorescence de la phalloïdine liée peut être exprimée sous forme d’unités de phalloïde liée générée à partir de la courbe linéaire standard et est relative aux échantillons témoins. Pour la figure 4, les niveaux de F-actine sont exprimés en micro-unités de phalloïde liée.

D’autre part, pour la figure 5, les niveaux de F-actine dans les fragments synaptiques dépolarisés sont exprimés par rapport aux échantillons témoins non déco molaires. Nous décrivons une analyse robuste, rapide et à haut débit pour l’analyse des filaments d’actine, ou de la F-actine, et ses changements des états physiologiques et pathophysiologiques appropriés pour un format de plaque de puits 96. Le test est beaucoup plus rapide que les protocoles alternatifs existants et peut servir d’outil essentiel dans les études liées à l’actine, seul ou en combinaison avec l’immunohistochimie existante et les tests basés sur le buvard occidental.