Name: Un test basé sur la spectroscopie de fluorescence à temps efficace pour évaluer l’état de polymérisation de l’actine dans les tissus cérébraux des rongeurs et des humains (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Découvrez un test fluorométrique rapide pour évaluer la polymérisation de l'actine dans les tissus cérébraux de rongeurs et d'humains. Cette méthode utilise la phalloïdine marquée pour quantifier directement l'actine filamenteuse.

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Ce travail a été soutenu par la Neurological Foundation of New Zealand (1835-PG), le New Zealand Health Research Council (#16-597) et le Département d’anatomie de l’Université d’Otago, en Nouvelle-Zélande. Nous sommes redevables à la Banque de tissus neurologiques de HCB-IDIBAPS BioBank (Espagne) pour les tissus cérébraux humains. Nous remercions Jiaxian Zhang pour son aide dans l’enregistrement et le montage de la vidéo.

Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux règlements du Comité d’éthique de l’Université d’Otago sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (Protocole d’éthique No. AUP95/18 et AUP80/17) et le parlement néo-zélandais. Les tissus cérébraux humains ont été obtenus à partir de la banque de tissus neurologiques de la biobanque Clínic-IDIBAPS de l’hôpital de Barcelone, en Espagne. Tous les protocoles de prélèvement de tissus ont été approuvés par le comité d’éthique de l’hôpital Clínic de Barcelone et le consentement éclairé des familles a été obtenu.
1. Préparation des tampons et des réactifs
<ol><li>Préparer les tampons suivants pour l’homogénéisation du tissu cérébral et la préparation d’une fraction enrichie de terminaux synaptiques: Tampon d’homogénéisation : HEPES 5 mM, pH 7,4 complété par du saccharose 0,32 M Tampon de remise en suspension : Tris 5 mM, pH 7,4 complété par du saccharose 0,32 M Tampon de lavage: 5 mM Tris, pH 8.1 1,2 M saccharose 1,0 M saccharose 0,85 M saccharose</li>
	<li>Ajouter un mélange maison ou commercial d’inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase. REMARQUE: Nous avons utilisé la version sans EDTA du mélange Complete Protease Inhibitor (1 comprimé par tampon de 10 mL) et du cocktail IV d’inhibiteurs de phosphatase (1:100; volume: volume).</li>
	<li>Préparer les tampons et réactifs suivants pour la fixation, la perméabilisation et la liaison de la phalloïde: Tampon de Krebs: 118,5 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgCl2,2 mM CaCl2,0,1 mM KH2PO4,5 mM NaHCO3,10 mM glucose, 20 mM HEPES, pH 7,4 1 M KCl Glutaraldéhyde à 25 % (solution mère) Tampon de Krebs contenant 0,1 % de Triton X-100 et 1 mg/mL de NaBH4 400x Alexa Fluor 647 Phalloïde dans DMSO Tampon de Krebs contenant 0,32 M de saccharose 50 μM de latrunculinE A dans le DMSO (solution mère) 1 M KCl (solution mère) ATTENTION : La phalloïde est toxique(DL 50 = 2 mg/kg) et doit être manipulée avec précaution. L’inhalation de glutaraldéhyde est toxique et doit être manipulée dans une hotte.</li>
	<li>Conserver les tampons à 4 °C et la phalloïde et la latrunculine A à -20 °C pour un stockage à long terme. Remarque : stockage à long terme des tampons n’est pas recommandé. Le protocole peut être suspendu ici.</li>
</ol>2. Homogénéisation des tissus cérébraux
<ol><li>Homogénéiser le tissu cérébral de rat cryoconservé ou fraîchement disséqué dans 10 volumes de tampon d’homogénéisation dans un tube de verrePotter-Elvehjem et un pilon sur glace. REMARQUE: L’homogénéisation optimale est obtenue par 15-20 coups du pilon à la main pour les tissus cérébraux. L’homogénéisation réussie peut être confirmée par un écoulement fluide de la suspension à travers le tube de verre. Le protocole peut être suspendu ici.</li>
	<li>Déterminer la concentration en protéines dans l’homogénat à l’aide d’un dosage de Bradford31. REMARQUE: D’autres tests faits maison ou commerciaux pour l’estimation des protéines peuvent également être utilisés.</li>
	<li>Diluer les échantillons homogénésés dans le tampon de Krebs à une concentration de 2-3 mg de protéines/mL dans un volume de 50 μL. REMARQUE: Dans certaines de nos expériences, nous incubons des homogénats avec de la latrunculine A ou DMSO (témoins) à 2 μM à 37 °C pendant 1 h. Pour cela, les homogénats sont remises en suspension dans 48 μL de tampon de Krebs, et 2 μL de latrunculinE A de 50 μM ou 2 μL de DMSO sont ajoutés. De plus, pour l’immunoblotting, une petite quantité d’échantillon (10 μg) est prélevée après l’incubation.</li>
	<li>Fixer les échantillons homogénésés (section 5).</li>
</ol>3. Préparation de terminaux nerveux isolés
<ol><li>Préparation de synaptosomes REMARQUE: Les protocoles alternatifs32,33 pour les synaptosomes peuvent également être utilisés.<ol>
<li>Le cerveau de la centrifugeuse s’homogénéate à 1 200 x g pendant 10 min à 4 °C.</li>
		<li>Jetez la pastille, qui est la fraction nucléaire brute.</li>
		<li>Centrifuger ensuite le surnageant (S1) obtenu à l’étape 3.1.1 à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C.</li>
		<li>Retirez le surnageant (S2), qui est la fraction cytosolique soluble.</li>
		<li>Ressusciter la pastille (P2) obtenue à l’étape 3.1.3, qui est la fraction synaptosomale brute dans le tampon de resuspension. REMARQUE: Le volume du tampon de remise en suspension dépend de la quantité de tissu de départ et de la quantité de granulés obtenue. Par exemple, en commençant avec 150-300 mg de tissus cérébraux, la pastille obtenue peut être remise en suspension dans 200 μL de tampon de remise en suspension.</li>
		<li>Chargez les synaptosomes bruts ressuscités sur un gradient de saccharose discontinu constitué de volumes égaux de saccharose de 0,85-1,0-1,2 M de saccharose. REMARQUE: Nous utilisons généralement 1 mL de chacune des solutions de saccharose (pour 150-300 mg de tissu). Cela peut être modifié en fonction de plus grandes quantités de tissus. Les gradients discontinus peuvent être réalisés à l’aide d’une seringue 25G pressée contre la paroi interne du tube ultracentrifuge et d’une couche douce des couches de saccharose.</li>
		<li>Centrifuger à 85 000 x g pendant 2 h à 4 °C. REMARQUE: En raison de la vitesse élevée de centrifugation, une ultracentrifuge capable de créer un vide pour réduire le chauffage est nécessaire.</li>
		<li>Recueillir la fraction synaptosomique à l’interface entre 1,0 et 1,2 M de saccharose à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL.</li>
		<li>Laver la fraction synaptosomique avec un tampon de lavage glacé par centrifugation à 18 000 x g pendant 10 minutes à 4 °C. NOTA : Pour le lavage, la fraction synaptosomique obtenue à l’interface de saccharose 1,0 et 1,2 M est recueillie dans un tube frais de 1,5 mL, et un volume égal de tampon de lavage est ajouté, assurant l’élimination du saccharose élevé du milieu.</li>
		<li>Laver à nouveau le culot synaptosomal avec un tampon d’homogénéisation glacé à 12 000 g pendant 10 minutes à 4 °C.</li>
		<li>Ressusciter les synaptosomes dans le tampon d’homogénéisation sur la glace. Remarque : le protocole peut être brièvement suspendu ici.</li>
		<li>Déterminer la concentration en protéines à l’aide d’un test de Bradford.</li>
		<li>Ressusciter les synaptosomes dans le tampon de Krebs à une concentration de 2-3 mg de protéines/mL dans un volume de 50 μL (47,5 μL si les synaptosomes doivent être dépolarisés par KCl; voir la section 4). REMARQUE: Pour la remise en suspension, la fraction synaptosomique est d’abord filée à 12 000 x g pendant 5 min à 4 °C et le surnageant (tampon) est retiré. La pastille synaptosomique est ensuite remise en suspension dans le tampon de Krebs par pipetage doux à l’aide d’une pointe de pipet de 200 μL.</li>
		<li>Procéder à la dépolarisation (section 4).</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de synaptoneurosomes REMARQUE: Les protocoles alternatifs34,35 pour les synaptoneurosomes peuvent également être utilisés.<ol>
<li>Faire passer le cerveau à homogénéat à travers un filtre à filet pré-mouillé de 100 μm de pores dans un porte-filtre à l’aide d’une seringue de 1 mL. REMARQUE: Le pré-mouillage de tous les filtres est important pour éviter la perte d’échantillon et doit être effectué à l’aide d’un tampon d’homogénéisation. Pour cela, le tampon d’homogénéisation est passé à travers les filtres dans le porte-filtre à l’aide d’une seringue de 1 mL jusqu’à ce que le tampon s’écoule.</li>
		<li>Recueillir le filtrat (F1) dans un tube pré-refroidi de 1,5 mL sur de la glace.</li>
		<li>Répéter le procédé (étapes 3.2.1 et 3.2.2) pour la fraction F1 afin d’obtenir le second filtrat (F2).</li>
		<li>Passer F2 filtrer à travers un filtre net de 5 μm de pores.</li>
		<li>Recueillir le filtrat (F3) dans un tube pré-refroidi de 1,5 mL sur de la glace.</li>
		<li>Centrifuger filtrer F3 à 1 500 x g pendant 10 min à 4 °C.</li>
		<li>Réinstaurer la pastille (synaptoneurosomes) dans le tampon de Krebs sur de la glace à une concentration de 2-3 mg de protéines/mL dans un volume de 50 μL (47,5 μL si les synaptosomes doivent être dépolarisés par KCl; voir la section 4). Remarque : le protocole peut être brièvement suspendu ici.</li>
		<li>Estimer la concentration en protéines à l’aide d’un test de Bradford.</li>
		<li>Procéder à la dépolarisation (section 4).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Dépolarisation médiée par KCl de terminaux synaptiques isolés
<ol><li>Équilibrer synaptosomes/synaptoneurosomes à 37 °C pendant 5-10 min.</li>
	<li>Stimuler les synaptosomes/synaptoneurosomes en ajoutant du KCl pour augmenterK+ extracellulaire à 50 mM pendant 30 s à 37 °C et ajouter un volume égal de tampon de Krebs au jeu de contrôle non stimulé respectif. REMARQUE : Par exemple, ajoutez 2,5 μL de KCl de 1 M aux synaptosomes remises en suspension dans 47,5 μL de tampon de Krebs; et ajouter 2,5 μL de tampon de Krebs au synaptosome de contrôle non stimulé respectif. Pour les expériences dans lesquelles un grand nombre d’échantillons sont impliqués, procéder avec pas plus de 2 échantillons à la fois de sorte que le temps de dépolarisation ne dépasse pas 30 s.</li>
	<li>Mettre fin à la stimulation en ajoutant du glutaraldéhyde (section 5).</li>
</ol>5. Fixation et coloration à la phalloïde des échantillons
<ol><li>Ajouter le glutaraldéhyde aux échantillons homogénéaux/synaptosomal/synaptoneurosomal à une concentration finale de 2,5% pendant 2-3 min à température ambiante. NOTA : Nous avons ajouté 6 μL de solution de glutaraldéhyde à 25 % de sorte que la concentration finale de glutaraldéhyde dans les échantillons de 50 μL (homogénés/synaptosomes/synaptoneurosomes) était d’environ 2,5 %. La fixation est critique et doit être rapide et donc immédiatement après l’ajout de glutaraldéhyde, l’échantillon doit être vigoureusement vortexé.</li>
	<li>Sédimenter les échantillons à 20 000 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Retirez le surnageant. REMARQUE: Jetez le surnageant dans une hotte car le glutaraldéhyde est toxique.</li>
	<li>Perméabiliser le culot par remise en suspension dans 100 μL de tampon de Krebs contenant 0,1% de Triton X-100 et 1 mg/mL de NaHB4 pendant 2-3 min à température ambiante.</li>
	<li>Sédimenter les échantillons à 20 000 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Retirez la mémoire tampon de perméabilisation.</li>
	<li>Laver le culot avec 200 μL de tampon De Krebs par centrifugation à 20 000 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Ressusciter et colorer la pastille avec 1x phalloïde Alexa Fluor 647 (correspondant à 500 μU) dans 100 μL de tampon Krebs pendant 10 minutes dans l’obscurité à température ambiante. REMARQUE: D’autres variétés d’analogues de la phalloïde fluorescente sont disponibles dans le commerce et peuvent être remplacées pour le dosage. La concentration de phalloïde et le volume total de l’échantillon d’incubation peuvent devoir être modifiés en fonction de la quantité et du type de tissu ou d’échantillon testé, et les conditions optimales doivent être normalisées en conséquence.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons colorés à 20 000 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Retirez la phalloïde non liée (surnageant).</li>
	<li>Laver l’échantillon avec 200 μL de tampon de Krebs par centrifugation à 20 000 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Remise en suspension dans 200 μL de tampon de Krebs contenant 0,32 M de saccharose. Remarque : le protocole peut être brièvement suspendu ici.</li>
</ol>6. Analyse fluorométrique et diffusion de la lumière
<ol><li>Distribuez les échantillons tachés de phalloïde Alexa Fluor 647 dans une plaque noire de 96 puits.</li>
	<li>Mesurer l’intensité de fluorescence à une longueur d’onde d’excitation de 645 nm et une longueur d’onde d’émission de 670 nm dans un lecteur de plaques à température ambiante.</li>
	<li>Transférer les échantillons de la plaque noire de 96 puits vers la plaque transparente de 96 puits à l’aide de pointes de pipet de 200 μL.</li>
	<li>Mesurer la diffusion de la lumière à 540 nm pour corriger les pertes qui auraient pu se produire au cours des étapes précédentes de fixation, de perméabilisation et de coloration. NOTA : Les variations du matériel biologique conservé dans les échantillons colorés pourraient être plus importantes pour de plus petites quantités de matières premières (voir discussion).</li>
	<li>Inclure un ensemble de phalloïde Alexa Fluor 647 dans le tampon de Krebs à différentes concentrations (0,05x, 0,1x, 0,25x, 0,35x, 0,75x, 0,5x et 1x correspondant à 25, 50, 125, 175, 250, 375 et 500 μU) pour chaque lot de l’essai en tant que courbe standard. REMARQUE : Il s’agit d’une étape facultative qui n’affecte pas les résultats de l’essai, en particulier lorsque les concentrations d’actine F sont exprimées de manière relative (section 7). Le protocole peut être suspendu ici.</li>
</ol>7. Analyse des données
<ol><li>La quantité de F-actine dans les échantillons est directement proportionnelle à l’intensité de fluorescence de la phalloïdine liée. Exprimer en termes absolus les unités de phalloïde liées calculées à partir de la courbe linéaire de la norme de phalloïdine marquée. REMARQUE : À titre d’exemple, voir les figures 2A-B, 3A, 4A-B et la figure supplémentaire 2.</li>
	<li>Exprimer les niveaux de F-actine sous la forme d’une fraction des échantillons de contrôle. REMARQUE : À titre d’exemple, voir les figures 5A à B.</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le dosage décrit ici, essentiellement adapté d’une étude précédente30 avec des modifications, utilise une phallotoxine, la phalloïde marquée d’une étiquette fluorescente. Les analogues de la phalloïde fluorescente sont considérés comme l’étalon-or pour la coloration des filaments d’actine dans les tissus fixes47,48,49. En fait, ce sont les outils les plus anciens pour identifier spécifiquement les filamen...

L’actine protéique cytosquelettique est impliquée dans de multiples fonctions cellulaires, y compris le soutien structurel, le transport cellulaire, la motilité cellulaire et la division. L’actine se présente en équilibre sous deux formes : l’actine globulaire monomère (G-actine) et l’actine filamenteuse polymérisée (F-actine). Les changements rapides dans l’état de polymérisation de l’actine (interconversion entre ses formes G et F) entraînent un assemblage et un désassemblage rapides du filament et sous-tendent ses rôles régulateurs dans la physiologie cellulaire. L’actine forme le composant majeur de la structure cytosquelettique neuronale et influence un large éventail de fonctions neuronales1,2. Il convient de noter que le cytosquelette d’actine fait partie intégrante de la plate-forme structurelle des terminaux synaptiques. En tant que tel, il est un déterminant majeur de la morphogenèse et de la physiologie synaptiques et joue un rôle fondamental dans le contrôle de la taille, du nombre et de la morphologie des synapses3,4,5. En particulier, la polymérisation-dépolymérisation dynamique de l’actine est un déterminant clé du remodelage synaptique associé à la plasticité synaptique sous-jacente aux processus de mémoire et d’apprentissage. En effet, tant les fonctions présynaptiques (telles que la libération de neurotransmetteurs6,7,8,9,10)que postynaptiques (remodelage dynamique lié à la plasticité11,12,13,14)s’appuient de manière critique sur des changements dynamiques dans le statut de polymérisation du cytosquelette d’actine.
Dans des conditions physiologiques, les niveaux de F-actine sont régulés dynamiquement et étroitement par une voie multimodale impliquant une modification post-traductionnelle4,15,16 ainsi que des protéines de liaison à l’actine (ABPs)4,17. Les AOP peuvent influencer la dynamique de l’actine à plusieurs niveaux (tels que l’initiation ou l’inhibition de la polymérisation, l’induction de la ramification des filaments, la section des filaments en morceaux plus petits, la promotion de la dépolymérisation et la protection contre la dépolymérisation), et sont à leur tour sous un contrôle modulatoire rigoureux sensible à divers signaux extra- et intracellulaires18,19,20. De tels contrôles de réglementation à plusieurs niveaux dictent une réglementation stricte de la dynamique d’actine au cytosquelette synaptique, en affinant les aspects pré- et postsynaptic de la physiologie neuronale à la fois aux états basiques et induits par l’activité.
Compte tenu des rôles importants de l’actine dans la physiologie neuronale, il n’est pas surprenant que plusieurs études aient fourni des preuves d’altérations de la dynamique de l’actine en tant qu’événements pathogènes critiques liés à un large éventail de troubles neurologiques, y compris la neurodégénérescence, les maladies psychologiques ainsi que les affections neurodéveloppementales3,21,22, 23,24, 25,26,27. Malgré la richesse des données de recherche pointant vers des rôles clés de l’actine dans la physiologie neuronale et la physiopathologie, cependant, des lacunes importantes subsistent dans la compréhension de la dynamique de l’actine, en particulier au niveau du cytosquelette synaptique. D’autres études de recherche sont nécessaires pour avoir une meilleure compréhension de l’actine neuronale et de ses altérations dans des conditions pathologiques. L’un des principaux domaines d’intérêt dans ce contexte est l’évaluation de l’état de polymérisation de l’actine. Il existe des trousses commerciales occidentales à base de buvards (trousse biochimique d’essai in vivo de G-Actine/F-Actine; Cytosquelette SKU BK03728,29) et des tests faits maison pour l’évaluation des niveaux de F-actine6. Cependant, parce que ceux-ci exigent l’isolement biochimique de la F-actine et de la G-actine et parce que leur quantification suivante est basée sur des protocoles d’immunoblotting, ils peuvent prendre du temps. Nous rapportons ci-dessus un dosage spectroscopie-basé sur la fluorescence adapté d’une étude précédente30 avec des modifications qui peuvent être employées pour évaluer les deux niveaux basiques de F-actine, aussi bien que les changements dynamiques de son assemblage-démontage. Notamment, nous avons modifié efficacement le protocole original qui exige des échantillons adaptés à une cuvette de 1 mL au format actuel de plaque de 96 puits. Le protocole modifié a donc considérablement réduit la quantité de tissu/échantillon requise pour l’essai. De plus, nous fournissons des preuves que le protocole convient non seulement aux homogénats de tissu cérébral, mais également aux fractions subcellulaires telles que les terminaux synaptiques isolés (synaptosomes et synaptoneurosomes). Enfin, le test peut être utilisé pour les tissus cérébraux de rongeurs fraîchement disséqués et les échantillons de cerveau humain post mortem stockés à long terme. Il convient de noter que, bien que le test soit présenté dans un contexte neuronal, il peut être étendu de manière appropriée à d’autres types de cellules et processus physiologiques qui leur sont associés.

<table><tbody><tr><td>Tube en polycarbonate à paroi épaisse de 3,5 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>349622</td><td>Pour la centrifugation par gradient (préparation des synaptosmes)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloïdine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A22287</td><td>Ligand spécifique de l’actine F</td></tr><tr><td>Anticorps contre &nbsp ; b-actine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-47778</td><td>Pour l’évaluation des taux d’actine totale par immunobuvard</td></tr><tr><td>Anticorps contre le GAPDH</td><td>Abcam</td><td>Ab181602</td><td>Pour l’évaluation des taux de GAPDH par immunobuvardage</td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td>Bradford Estimation des protéines basée sur</td></tr> le <tr><td>chlorure de calcium dihydraté (CaCl2&middot ; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td>Composant tampon Krebs</td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, sans EDTA Cocktail d’inhibiteurs de protéase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001</td><td>Pour l’inhibition de l’activité de la protéase endogène pendant la préparation de l’échantillon</td></tr><tr><td>Corning 96 puits Polystyrène transparent à fond plat</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>Pour les mesures de diffusion de la lumière</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Composant tampon de Krebs</td></tr><tr><td>Sulfoxyde de diméthyle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td>Solvant pour la phalloïdine et la latrunculine A</td></tr><tr><td>Scanner à plat fluorescent (scanner infrarouge Odyssey)</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>Pour la détection de signaux immunoréactifs sur les immunoblots</td></tr><tr><td>Solution de glutaraldéhyde (25 % dans l’eau) Grade II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td>Fixateur</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Ingrédient tampon pour la préparation d’échantillons et composant tampon Krebs</td></tr><tr><td>Latronculine A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5163</td><td>Dépolymériseur de filaments d’actine</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl2&middot ; 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>Composant tampon Krebs</td></tr><tr><td>Microplaques</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtre à membrane Mitex 5 mm</td><td>Millipore</td><td>LSWP01300</td><td>Préparation des synaptoneurosomes</td></tr><tr><td>Nunc F96 MicroWell Black Plate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>237105</td><td>Pour les mesures fluorométriques</td></tr><tr><td>Filtre en nylon 100 mm</td><td>Millipore</td><td>NY1H02500</td><td>Préparation de synaptoneurosomes</td></tr><tr><td>Cocktail inhibiteur de la phosphatase IV</td><td>Abcam</td><td>ab201115</td><td>Pour l’inhibition de l’activité de la phosphatase endogène pendant la préparation de l’échantillon</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>Composant tampon de Krebs et pour la dépolarisation des terminaisons synaptiques</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique ((KH2PO4 )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>Composant tampon Krebs</td></tr><tr><td>Borohydrure de sodium (NaBH4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71320</td><td>Composant du tampon de perméabilisation</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>LabServ (Thermo Fisher Scientific)</td><td>BSPSL944</td><td>Composant tampon Krebs</td></tr><tr><td>Hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO3)</td><td>LabServ (Thermo Fisher Scientific)</td><td>BSPSL900</td><td>Composant tampon Krebs</td></tr><tr><td>SpectraMax i3x</td><td>Dispositifs</td><td></td> moléculaires <td>Pour les mesures fluorométriques</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/8600/60</td><td>Ingrédient tampon pour la préparation d’échantillons</td></tr><tr><td>Porte-filtre Swimnex</td><td>Millipore</td><td>Sx0001300</td><td>Préparation de synaptoneurosomes</td></tr><tr><td>Broyeur de tissus 5 mL Potter-Elvehjem</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>358034</td><td>Pour l’homogénéisation des tissus</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Composant du tampon de perméabilisation</td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td>Ingrédient tampon pour la préparation des échantillons</td></tr></tbody></table>

un test basé sur la spectroscopie de fluorescence à temps efficace pour évaluer l’état de polymérisation de l’actine dans les tissus cérébraux des rongeurs et des humains

A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues

L’actine, le composant principal du cytosquelette, joue un rôle essentiel dans le maintien de la structure et de la fonction neuronales. Sous les états physiologiques, l’actine se présente en équilibre sous ses deux formes : globulaire monomère (G-actine) et filamenteuse polymérisée (F-actine). Aux bornes synaptiques, le cytosquelette d’actine forme la base des fonctions pré- et post-synaptiques critiques. De plus, les changements dynamiques dans le statut de polymérisation de l’actine (interconversion entre les formes globulaires et filamenteuses d’actine) sont étroitement liés aux altérations liées à la plasticité de la structure et de la fonction synaptiques. Nous rapportons ici une méthodologie basée sur la fluorescence modifiée pour évaluer le statut de polymérisation de l’actine dans des conditions ex vivo. Le test utilise de la phalloïde marquée par fluorescence, une phallotoxine qui se lie spécifiquement aux filaments d’actine (F-actine), fournissant une mesure directe de l’actine filamenteuse polymérisée. Comme preuve de principe, nous fournissons des preuves de la pertinence de l’essai à la fois dans les homogénats de tissu cérébral humain de rongeur et post mortem. En utilisant la latrunculinE A (un médicament qui dépolymérise les filaments d’actine), nous confirmons l’utilité du test dans la surveillance des altérations des niveaux de F-actine. De plus, nous étendons le dosage aux fractions biochimiques des terminaux synaptiques isolés dans lesquels nous confirmons une polymérisation accrue de l’actine lors de la stimulation par dépolarisation avec un K+extracellulaire élevé.

Linéarité du test pour l’évaluation des niveaux de F-actine Tout d’abord, une courbe standard pour l’augmentation linéaire de la fluorescence de la phalloïde Alexa Fluor 647 a été établie et répétée pour chaque ensemble d’expériences(Figure 1). Pour étudier la plage linéaire de l’essai, différentes quantités d’homogénats cérébraux provenant de rongeurs(figures 2A et 2B)et de sujets humains post mortem(figures 3A</stro...

Nous rapportons une analyse simple, rapide et à haut débit basée sur la spectroscopie de fluorescence pour la quantification des filaments d’actine dans des échantillons biologiques ex vivo des tissus cérébraux des rongeurs et des sujets humains.

Un test basé sur la spectroscopie de fluorescence à temps efficace pour évaluer l’état de polymérisation de l’actine dans les tissus cérébraux des rongeurs et des humains

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin ...

L’actine est le composant principal du cytosquelette et régule de manière critique plusieurs aspects de la morphologie et de la physiologie cellulaires, y compris dans les neurones. L’actine se produit en équilibre entre ses deux formes, la G-actine globulaire monomère ou la F-actine filamenteuse polymère. Le statut de polymérisation de l’actine est strictement réglementé à plusieurs niveaux à la fois par les protéines de liaison à l’actine, ainsi que par sa propre régulation post-traductionnelle.Aux contacts synaptiques interneuronal, les altérations dynamiques des niveaux de F-actine sont un événement régulateur clé, contrôlant la signalisation et la plasticité aux bornes synaptiques pré et post. Sans surprise, le dysfonctionnement d’actine est lié à plusieurs états neuropathological. Les avances récentes ont mené à une richesse de connaissance de l’actine dans la physiologie neuronale et la pathophysiologie.Cependant, beaucoup de choses sont encore inconnues et doivent être concentrées. À cet égard, les analogues fluorescents de la phalloïde se sont avérés être un outil majeur dans la recherche sur l’actine. Cette phallotoxine se lie spécifiquement à l’actine filamenteuse, et peut donc être utilisée comme mesure directe des quantités de F-actine, et de son altération des états physiopathologiques.Cette étude présente un essai fluorométrique rapide et efficace pour l’évaluation du statut de polymérisation de l’actine dans des échantillons biologiques ex vivo, tels que des homogénats en gros et des terminaux synaptiques biochimiquement isolés des tissus cérébraux. Il convient de noter que le test peut être appliqué à d’autres types de cellules et de tissus et à leur phénomène physiologique associé. Pour les recettes des tampons utilisés dans cette étude, veuillez vous référer au texte détaillé.Des échantillons de tissu cérébral provenant de rats ou de sujets humains ont été homogénéisés dans un tube de verre Potter-Elvehjem et un pilon sur glace dans 10 volumes de tampon d’homogénéisation. Pour la préparation du synaptosome, l’homogénat a été filé d’abord à une vitesse lente, puis à une vitesse plus élevée pour obtenir une fraction mitochondriale synaptosomal brute. Des synaptosomes enrichis de cette fraction brute ont été obtenus suivant un gradient discontinu de saccharose.Pour la préparation synaptoneurosomal, des homogénats ont été séquentiellement passés à travers deux 100 microns et un filtre de 5 microns. L’estimation des protéines a été réalisée à l’aide du réactif de Bradford et des échantillons ont été dilués dans du tampon de Krebs à une concentration de deux à trois milligrammes par protéine mL dans un volume final de 50 microlitres. La stimulation des bornes synaptiques d’isolement, synaptosomes ou synaptoneurosomes, ont été effectuées par une brève augmentation de 30 secondes de potassium extracellulaire à 37 degrés.Pour cela, un chlorure de potassium molaire a été ajouté aux échantillons à une concentration finale de 15 millimolaires. Les homogénats sont non stimulés et des fragments synaptiques dépolarisés ont été fixés avec du glutaraldéhyde à 2,5%, par l’ajout du volume requis de solution mère de glutaraldéhyde à 25%. Les échantillons ont été incubés pendant deux, trois minutes à température ambiante.Fixatif a été enlevé par centrifugation à 20, 000 G pendant cinq minutes. Les échantillons ont ensuite été procédé à la perméabilisation par remise en suspension dans un tampon de Krebs contenant 0,1 % de Triton X-100 et 1 mg par mL de borohydrure de sodium pendant deux à trois minutes à température ambiante. Le tampon de perméabilisation a été éliminé à nouveau par centrifugation et le culot a été lavé superficiellement avec du tampon krebs et remis en suspension dans le tampon Krebs contenant 1X phalloïdine Alexa Fluor 647, correspondant à 500 micro unités de phalloïdine.La reliure a été autorisée à se poursuivre pendant 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité. L’excès de phalloïdine non liée a été retiré des échantillons par centrifugation à 20 000 G pendant cinq minutes, et les pastilles ont été superficiellement lavées avec du tampon de Krebs, et remises en suspension à nouveau dans le tampon de Krebs contenant du saccharose molaire 0,32 pour maintenir la flottabilité des synaptosomes ou des synaptoneurosomes. Des échantillons liés à la phalloïdine fluorescente ont été distribués dans une plaque noire de 96 puits pour la lecture fluorométrique dans un lecteur de plaque.Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission ont été fixées à 645 nanomètres et 670 nanomètres respectivement. Pour chaque série d’expériences, nous avons inclus différentes quantités de phalloïde Alexa Fluor 647 dans le tampon Krebs contenant 0,32 saccharose molaire. Pour tenir compte de toute perte d’échantillons pendant les étapes de lavage, les échantillons ont été transférés du noir à la plaque transparente de 96 puits.La capture des échantillons a ensuite été examinée à 440 nanomètres. La rétention de la phalloïde fluorescente est directement proportionnelle à la quantité de filaments d’actine ou aux niveaux de F-actine dans les échantillons. On a observé la linéarité de l’attache de phalloidin dans la gamme de 50 à 200 protéines de microgramme.Comme preuve de principe, nous avons également testé l’efficacité de notre analyse dans des modèles de dépolymérisation de la F-actine en utilisant une perturbation pharmacologique des filaments d’actine par la latrunculine A, ainsi que la stimulation de la formation de F-actine par stimulation médiée par KCl de terminaux synaptiques isolés. L’émission de fluorescence de la phalloïdine liée peut être exprimée sous forme d’unités de phalloïde liée générée à partir de la courbe linéaire standard et est relative aux échantillons témoins. Pour la figure 4, les niveaux de F-actine sont exprimés en micro-unités de phalloïde liée.D’autre part, pour la figure 5, les niveaux de F-actine dans les fragments synaptiques dépolarisés sont exprimés par rapport aux échantillons témoins non déco molaires. Nous décrivons une analyse robuste, rapide et à haut débit pour l’analyse des filaments d’actine, ou de la F-actine, et ses changements des états physiologiques et pathophysiologiques appropriés pour un format de plaque de puits 96. Le test est beaucoup plus rapide que les protocoles alternatifs existants et peut servir d’outil essentiel dans les études liées à l’actine, seul ou en combinaison avec l’immunohistochimie existante et les tests basés sur le buvard occidental.

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