Name: Vitrification d’ovocytes mûris in vitro prélevés sur des ovaires adultes et prépubéraux chez des moutons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Découvrez la vitrification d'ovocytes mûris in vitro prélevés sur des ovaires de moutons adultes et prépubéraux. Ce protocole optimise la survie et la compétence développementale pour la biotechnologie animale.

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Les auteurs n’ont reçu aucun financement spécifique pour ce travail. La professeure Maria Grazia Cappai et la Dre Valeria Pasciu sont reconnaissantes pour la voix off vidéo et pour la mise en place du laboratoire pendant la réalisation de la vidéo.

Le protocole animal et les procédures mises en œuvre décrites ci-dessous sont conformes aux lignes directrices éthiques en vigueur à l’Université de Sassari, conformément à la Directive 86/609/CE de l’Union européenne et à la recommandation de la Commission des Communautés européennes 2007/526/CE.
1. Préparation du support pour la manipulation des ovocytes
<ol><li>Préparer le milieu pour le transport des ovaires recueillis en complétant la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco avec 0,1 g/L de pénicilline et 0,1 g/L de streptomycine (PBS).</li>
	<li>Préparer le milieu pour la collecte et la maturation des ovocytes en diluant 9,5 g de milieu de culture tissulaire (MTC) 199 en poudre avec 1 L d’eau Milli-Q complétée par de la pénicilline (0,1 %) et la streptomycine (0,1 %).<ol>
<li>Après dilution, filtrer 100 mL de milieu et le conserver à 4 °C comme milieu de maturation du stock (SMM) à utiliser pendant une semaine.</li>
		<li>Préparer le milieu de collecte (CM) en complétant les 900 mL restants avec 25 mM hepes, 0,36 g/L de bicarbonate et 0,1 % (p/v) d’alcool polyvinylique (PVA) (pH 7,3, osmolalité 290 mOsm/kg).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer le milieu de maturation avec du SMM complété par 0,021 g/L de bicarbonate, 10 % de sérum de mouton d’oestrus traité thermiquement, 1 UI/mL de FSH, 1 UI/mL de LH, 100 μL de cystéamine et 8 mg/mL de pyruvate. NOTA: Le milieu de maturation d’un volume de 10 mL doit être incube aux conditions normales (dans une atmosphère humidifiée maximale à 39 °C dans 5 % deCO2 dans l’air) pendant au moins 4 h avant utilisation.</li>
	<li>Préparer le milieu de base (BM) pour la manipulation de l’ovocyte après maturation in vitro, constitué en PBS sans Ca++ et Mg++,complété par 20% de sérum de veau fœtal (FCS).</li>
</ol>2. Prélèvement et maturation des ovocytes
<ol><li>Récupérer les ovocytes des ovaires juvéniles (30-40 jours, poids corporel 6-10 kg) et adultes.</li>
	<li>Transporter les ovaires collectés de l’abattoir commercial au laboratoire dans un délai de 1 à 2 h dans du PBS à 27 °C.</li>
	<li>Après le lavage dans un milieu frais PBS, trancher les ovaires en CM à l’aide d’une micro-lame pour libérer la teneur en follicules.</li>
	<li>Dans le cadre d’un examen stéréomicroscope avec un grossissement 60x, sélectionnez les complexes cumulus-ovocytes (COC) pour la maturation in vitro en choisissant ceux avec 4-10 couches de cellules de granulosa, l’ovocyte avec un cytoplasme uniforme, la distribution homogène des gouttelettes lipidiques dans le cytoplasme et avec le diamètre extérieur d’environ 90 μm (moyenne).</li>
	<li>Lavez les COC sélectionnés trois fois en CM et transférez-les enfin dans un milieu de maturation. REMARQUE: Pour les ovocytes juvéniles, pour améliorer la survie après vitrification, compléter le milieu de maturation avec 100 μM de tréhalose.</li>
	<li>Pour la maturation in vitro, transférer 30 à 35 COC dans 600 μL de milieu de maturation dans des boîtes de Petri à quatre puits, recouvertes de 300 μL d’huile minérale et les incuber pendant 22 (ovocytes adultes)/24 (ovocytes juvéniles) h dans 5 % deCO2 dans l’air à 39 °C.</li>
	<li>Après maturation in vitro, denude COCs des cellules de cumulus en pipetting doucement. Suite à l’examen sous stéréomicroscope à grossissement 60x, sélectionnez uniquement ceux montrant l’extrusion sur le premier corps polaire, et donc au stade de métaphase II (MII), pour la vitrification.</li>
</ol>3. Procédures de collecte, de congélation et de décongélation du sperme
<ol><li>Préparer le milieu de base pour la cryoconservation du sperme consistant en un prolongateur de bélier (Tris 200 mM; acide citrique 70 mM; fructose 55 mM; pH 7,2, osmolalité 300 mOsm/kg) complété par du jaune d’œuf 20% (v/v).</li>
	<li>Collectez le sperme uniquement pendant la saison de reproduction des moutons (octobre-novembre).</li>
	<li>Obtenir des éjaculages par vagin artificiel à partir de béliers adultes (âgés de 2 à 5 ans), maintenus dans un environnement extérieur et nourris avec une ration d’entretien de poids vif. Gardez les béliers isolés dans des enclos séparés, mais avec un contact visuel entre eux.</li>
	<li>Répéter la collecte de sperme une fois par semaine pendant toute la saison de reproduction pour obtenir au moins 8 éjaculages de chaque mâle.</li>
	<li>Transporter les échantillons de sperme au laboratoire à la température ambiante dans les 5 minutes suivant le prélèvement et les traiter immédiatement. Regroupez les éjaculats de deux-trois béliers et évaluez la spectrophotométrie de concentration des spermatozoïdes.</li>
	<li>Après mise en commun, diluer les éjaculats jusqu’à 400 x 106 spermatozoïdes/mL avec milieu de base pour cryoconservation du sperme complété par 4% de glycérol. Refroidir ensuite le sperme dilué à 4 °C sur une période de 2 h et l’équilibrer pendant 20 min avant de le congeler.</li>
	<li>Congeler les échantillons de sperme sous forme de granulés (0,25 mL) sur de la glace carbonique, puis les plonger dans de l’azote liquide.</li>
	<li>Pour la décongélation, mettez la pastille dans un faucon en verre stérilisé et plongez-la au bain-marie pendant 20 s à 39 °C.</li>
</ol>4. Fécondation in vitro et culture d’embryons
<ol><li>Préparer les stocks pour la constitution du liquide oviductal synthétique (SOF).<ol>
<li>Préparer le stock A : 99,4 mL d’eau MilliQ; 6,29 g de NaCl; 0,534 g de KCl; 0,161 g deKH2PO4; 0,182 g de MgSO4·7H2O ; et 0,6 mL de lactate de sodium. Conserver à 4 °C jusqu’à 3 mois.</li>
		<li>Préparer le stock B : 10 mL d’eau MilliQ; 0,210 g de NaHCO3; et 2-3 g de rouge de phénol. Conserver à 4 °C pendant 1 mois.</li>
		<li>Préparer le stock C : 10 mL d’eau MilliQ; et 0,051 g de pyruvate de sodium. Conserver à 4 °C pendant 1 mois.</li>
		<li>Préparer le stock D : 10 mL d’eau MilliQ; et 0,262 g deCaCl2 2H2 O. Conserver à 4 °C pendant 1 mois.</li>
		<li>Préparer 10 mL de SOF comprenant 7,630 mL d’eau MilliQ, 1 mL de stock A, 1 mL de stock B, 0,07 mL de stock C et 0,7 mL de stock D.</li>
		<li>Préparer le milieu de fécondation in vitro (FIV) : SOF complété par 2 % de sérum de mouton œstrus traité thermiquement, 10 μg/mL d’héparine et 1 μg/mL d’hypoutarine (osmolalité 280-290 mOsm/kg). NOTA : Le milieu FIV d’un volume de 10 mL doit être incube aux conditions normales (dans une atmosphère humidifiée maximale à 39 °C à 5 % deCO2,5 %D’O2 et 90 % deN2)au moins 4 h avant utilisation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transférer les aliquotes de sperme congelées/décongelées dans un tube conique en verre stérilisé sous 1,5 mL de milieu de FIV chauffé et les incuber pendant 15 min à 39 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % deCO2 dans l’air.</li>
	<li>Après incubation, les spermatozoïdes mobiles nagent vers la partie apicale de la colonne liquide. Recueillir la couche supérieure et observer pour l’évaluation de la motilité des spermatozoïdes. NOTA : Les paramètres de motilité des spermatozoïdes doivent être évalués à l’aide d’un système d’analyse assistée par ordinateur des spermatozoïdes (CASA) avec les paramètres suivants : 25 images acquises pour éviter le chevauchement des trajectoires des spermatozoïdes, contraste minimal de 10, vitesse minimale du trajet moyen de 30 μm/s et motilité progressive > recyté de 80 %. Ce système a une configuration spécifique pour l’évaluation des spermatozoïdes de bélier. Pour chaque échantillon, 5 μL de sous-échantillon de suspension de spermatozoïdes sont chargés dans une chambre d’analyse préchauffée d’une profondeur de 10 μm. La motilité des spermatozoïdes est évaluée à 37 °C à 40x à l’aide d’un microscope à contraste de phase et un minimum de 500 spermatozoïdes par sous-échantillon doit être analysé dans au moins quatre champs microscopiques différents. Le pourcentage de sperme mobile et mobile total progressif ont été évalués. Pour la FIV, le pourcentage de spermatozoïdes mobiles progressifs doit être ≥ 30%.</li>
	<li>Diluer les spermatozoïdes mobiles dérivés de swim-up à 1 x 106 spermatozoïdes/mL concentration finale et les co-incuber avec des ovocytes MII dans 300 μL de milieu de FIV recouvert d’huile minérale dans des boîtes de Petri à quatre puits.</li>
	<li>Après 22 h transférer les zygotes présumés dans quatre puits boîtes de Petri contenant SOF complété avec 0,4% albumine sérique bovine et acides aminés essentiels et non essentiels à la concentration oviductal comme rapporté par16 sous huile minérale et les mettre en culture dans des conditions standard jusqu’à l’étape blastocyste.</li>
	<li>À 22- , 26- et 32- h post-insémination, enregistrer le nombre d’ovocytes clivés, montrant deux blastomères distincts, par l’examen sous un stéréomicroscope avec le grossissement 60x.</li>
	<li>Observez les embryons tous les jours à partir du cinquième au neuvième jour de la culture et les blastocystes nouvellement formés doivent être enregistrés par l’examen sous un stéréomicroscope avec un grossissement 60x.</li>
</ol>5. Vitrification et réchauffement des ovocytes
REMARQUE: Effectuer la vitrification en suivant la méthode du volume essentiel minimum (MEV) en utilisant le dispositif cryotops17.
<ol><li>Équilibrer un groupe de cinq ovocytes à 38,5 °C pendant 2 min en BM. L’utilisation de BM garantit une faible concentration en calcium([Ca2++] 2,2 mg/dl)10.</li>
	<li>Déshydrater les ovocytes avec une exposition de 3 minutes à une solution d’équilibrage contenant 7,5% (v/v) de diméthylsulfoxyde (DMSO) et 7,5% (v/v) d’éthylène glycol (EG) dans bm.</li>
	<li>Transférer les ovocytes dans la solution de vitrification contenant 16,5% (v/v) de DMSO, 16,5% (v/v) d’EG et 0,5 M de tréhalose dans BM avant de les charger dans un dispositif cryotop et de les plonger directement dans de l’azote liquide dans les 30 s.</li>
	<li>Pour réchauffer à une température biologique, transférer la teneur de chaque dispositif de vitrification de l’azote liquide dans des gouttes de 200 μL de tréhalose de 1,25 M dans bm pendant 1 min à 38,5 °C, et agiter doucement pour faciliter le mélange.</li>
	<li>Pour favoriser l’élimination des cryoprotecteurs intracellulaires, transférer les ovocytes par étapes dans des gouttes de 200 μL de solutions de tréhalose décroissantes (0,5 M, 0,25 M, 0,125 M de tréhalose dans BM) pendant 30 s à 38,5 °C avant d’être équilibré pendant 10 min à 38,5 °C dans BM.</li>
</ol>6. Évaluation de la qualité des ovocytes après le réchauffement
<ol><li>Après réchauffement, incuber les ovocytes pendant 6 h dans du PBS sans Ca++ et Mg++ plus 20% de FCS (BM) dans 5% deCO2 dans l’air à 38,5 °C. REMARQUE: La capacité des ovocytes à restaurer les caractéristiques biologiques et structurelles après vitrification est en relation avec les espèces et les classes d’ovocytes utilisés.</li>
	<li>Étant donné que la capacité des ovocytes à récupérer les dommages causés par la cryoconservation dépend du temps, évaluez la qualité des ovocytes à différents points temporels de la culture in vitro (0 h, 2 h, 4 h, 6 h) après le réchauffement, afin de définir la fenêtre de temps optimale pour la fécondation des ovocytes. REMARQUE: Chez l’ovocyte des moutons adultes, le temps optimal est de 4 h après le réchauffement; pour l’ovocyte prépubertal, le temps optimal est de 2 h après le réchauffement.</li>
</ol>7. Évaluation de la survie des ovocytes
<ol><li>Immédiatement après le réchauffement et pour chaque point temporel de la culture post-réchauffement, évaluer morphologiquement les ovocytes à l’aide d’un microscope inversé avec un grossissement 100x. REMARQUE: Les ovocytes présentant des altérations structurelles, tels que le cytoplasme faible, les dommages à la zone pellucide et/ou à la membrane doivent être classés comme dégénérés.</li>
	<li>Valider l’évaluation de l’intégrité de la membrane à l’aide d’une double coloration fluorescente différentielle.</li>
	<li>Incuber les ovocytes dans 2 mL de BM contenant de l’iodure de propidium (PI; 10 μg/mL) et du Hoechst 33342 (10 μg/mL) pendant 5 min dans 5 % deCO2 dans l’air à 38,5 °C.</li>
	<li>Après lavage trois fois en BM frais, observer les ovocytes sous un microscope fluorescent à l’aide d’un filtre d’excitation de 350 nm et d’une émission de 460 nm pour Hoechst 33342 et d’un filtre d’excitation de 535 nm et d’une émission de 617 nm pour PI. REMARQUE: Les ovocytes avec une membrane intacte peuvent être reconnus par la fluorescence bleue de l’ADN coloré avec Hoechst 33342. Les ovocytes avec des membranes endommagées montrent une fluorescence rouge due à la coloration de l’ADN avec PI.</li>
</ol>8. Évaluation de l’activité mitochondriale et des niveaux intracellulaires de ROS par microscopie confocale à balayage laser
<ol><li>Préparez la sonde MitoTracker Red CM-H2XRos (MT-Red).<ol>
<li>Diluer la teneur en 1 flacon (50 μg) avec 1 mL de DMSO pour obtenir une solution de 1 mM. Conservez le flacon dilué dans de l’azote liquide.</li>
		<li>Diluer la solution de 1 mM avec du DMSO pour obtenir la solution mère de 100 μM et la stocker à -80 °C dans l’obscurité.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer la sonde de diacétate de 2′,7′-dichlorodihydrofluorescéine(H2DCF-DA).<ol>
<li>Diluer leH2DCF-DA dans 0,1 % de polyvinyl pyrrolidone (PVA)/PBS pour obtenir la première solution de 100 mM. Gardez la solution à -80 °C dans l’obscurité.</li>
		<li>Diluer la première solution dans 0,1 % de PVA/PBS pour obtenir la solution mère de 100 μM. Conservez-le à -20 °C dans l’obscurité.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer le milieu de montage (MM) : pour 10 mL de MM, ajouter 5 mL de glycérol, 5 mL de PBS et 250 mg d’azide de sodium. Conservez-le à -20 °C jusqu’à son utilisation.</li>
	<li>Incuber les ovocytes pendant 30 min à 38,5 °C dans bm avec 500 nM MT-Rouge (solution mère : 100 μM dans le DMSO).</li>
	<li>Après incubation avec sonde MT-Red, laver les ovocytes trois fois dans BM et incuber pendant 20 min dans le même milieu contenant 5 μMH2DCF-DA (solution mère : 100 μM dans BM).</li>
	<li>Après exposition aux sondes, laver les ovocytes dans BM et fixer dans 2,5% glutaraldéhyde/PBS pendant au moins 15 min.</li>
	<li>Après fixation, laver les ovocytes trois fois dans BM et les monter sur des lames de verre dans une goutte de MM de 4 μL avec 1 mg/mL hoechst 33342 à l’aide de coussins de cire pour éviter la compression des échantillons.</li>
	<li>Entreposer les diapositives à 4 °C dans l’obscurité jusqu’à évaluation.</li>
	<li>Effectuez l’analyse des sections immunomarquées à l’l’l’utilisation d’un microscope confocal à balayage laser. Le microscope est équipé de lasers Ar/He/Ne, utilisant un objectif d’huile 40/60x. Analyser les sections par excitation séquentielle.</li>
	<li>Pour l’évaluation mitochondriale, observez les échantillons avec un laser multiphotonique pour détecter MT-Red (exposition: 579 nm; émission: 599 nm).</li>
	<li>Utilisez un rayon laser d’ions argon à 488 nm et le filtre B-2 A (exposition de 495 nm et émission de 519 nm) pour signaler la dichlorofluorescéine (DCF)18.</li>
	<li>Dans chaque ovocyte individuel, mesurer les intensités de fluorescence MT-Red et DCF au plan équatorial19.</li>
	<li>Maintenir les paramètres liés à l’intensité de fluorescence à des valeurs constantes lors de toutes les acquisitions d’images (énergie laser 26%, Paramètres séquentiels 1: Gain PMT1 649-PMT2 gain 482; Réglage séquentiel 2: gain PMT1 625-PMT2 gain 589; décalage 0; taille du trou d’épingle: 68).</li>
	<li>Effectuer une analyse quantitative de l’intensité de fluorescence à l’aide du logiciel d’analyse d’image Leica LAS AF Lite, en suivant les procédures normalisées par20.</li>
	<li>Capturez les images une fois, en vous déplaçant sur l’axe Z, jusqu’à atteindre le plan équatorial.</li>
	<li>Pour chaque photo, la transformation en échelle de gris et la mise hors service du canal 1 (lié au bleu hoechst) ont été désactivées. Ensuite, dessinez manuellement une région d’intérêt (ROI) sur une zone circonscrite, c’est-à-dire autour du fuseau méiotique. Remarque : le logiciel peut lire automatiquement la valeur moyenne des pixels sur le canal 2 (FITC), en soustrayant la valeur de l’arrière-plan à partir de celui-ci.</li>
	<li>Enregistrez les valeurs moyennes des pixels et soumettez-les pour analyse statistique.</li>
</ol>9. Analyses statistiques
<ol><li>Analyser les différences suivantes : taux de survie dans les ovocytes juvéniles par rapport aux ovocytes adultes, taux de survie et compétence développementale dans les ovocytes juvéniles témoins et traités au tréhalose, taux de survie et d’activation parthénogénétique et compétence développementale des ovocytes adultes vitrifiés avec différents milieux de concentration de calcium, taux de fécondation et production d’embryons dans les ovocytes juvéniles vitrifiés avec une concentration de calcium faible ou élevée, phénotypes de mitochondries actives dans les ovocytes vitrifiés juvéniles au cours de différents points temporels de culture post-réchauffement et de taux d’activation parthénogénétique entre les ovocytes vitrifiés adultes et juvéniles à l’aide du test du Khi deux.</li>
	<li>Analyser le taux de clivage et la production d’embryons dans les ovocytes adultes vitrifiés au cours de différents points temporels de la culture post-réchauffement, l’intensité de fluorescence de l’activité mitochondriale et les niveaux intracellulaires de ROS dans les ovocytes vitrifiés juvéniles pendant différents points temporels de la culture post-réchauffement par ANOVA après analyse de l’homogénéité de la variance par le test de Levene. Utilisez un test post-hoc Test de Tukey pour mettre en évidence les différences entre les groupes.</li>
	<li>Effectuer une analyse statistique à l’aide du logiciel statistique et considérer une probabilité de P < 0,05 comme le niveau minimal de signification. Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± S.E.M.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La cryoconservation des ovocytes chez les animaux domestiques peut non seulement permettre la conservation à long terme des ressources génétiques féminines, mais aussi faire progresser le développement des biotechnologies embryonnaires. Ainsi, le développement d’une méthode standard pour la vitrification des ovocytes profiterait à la fois au bétail et au secteur de la recherche. Dans ce protocole, une méthode complète pour la vitrification adulte d’oocyte de mouton est présentée et pourrait représenter un point de départ...

Le stockage à long terme des gamètes femelles peut offrir un large éventail d’applications, telles que l’amélioration de l’élevage d’animaux domestiques par des programmes de sélection génétique, la contribution à la préservation de la biodiversité grâce au programme ex situ de conservation des espèces sauvages, et la stimulation de la recherche et des applications biotechnologiques in vitro grâce à la disponibilité d’ovocytes stockés à incorporer dans la production d’embryons in vitro ou les programmes de transplantation nucléaire1,2,3. La vitrification des ovocytes juvéniles augmenterait également le gain génétique en raccourcissant l’intervalle de génération dans les programmes de sélection4. La vitrification par refroidissement et réchauffement ultra-rapides des ovocytes est actuellement considérée comme une approche standard pour la cryoconservation des ovocytes de bétail5. Chez les ruminants, avant la vitrification, les ovocytes sont généralement mûris in vitro, après récupération à partir de follicules obtenus à partir d’ovaires dérivés d’abattoirs2. Les ovaires adultes, et surtout prépubéraux4,6,peuvent en effet fournir un nombre quasi illimité d’ovocytes à cryoconserver.
Chez les bovins, après vitrification et réchauffement des ovocytes, des rendements en blastocystes à >10% ont été couramment rapportés par plusieurs laboratoires au cours de la dernière décennie3. Cependant, chez les petits ruminants, la vitrification des ovocytes est encore considérée comme relativement nouvelle pour les ovocytes juvéniles et adultes, et une méthode standard pour la vitrification des ovocytes des moutons reste à établir2,5. Malgré des avancées récentes, l’ovocyte vitrifié et réchauffé présente en effet plusieurs altérations fonctionnelles et structurelles qui limitent leur potentiel de développement 7,8,9. Ainsi, peu d’articles ont rapporté le développement de blastocystes à 10% ou plus dans les ovocytes de mouton vitrifiés/réchauffés2. Plusieurs approches ont été étudiées pour réduire les altérations précitées : optimisation de la composition des solutions de vitrification et de décongélation10,11; expérimenter l’utilisation de différents cryo-dispositifs8,12,13; et l’application de traitements spécifiques lors de la maturation in vitro (IVM)4,14,15 et/ou pendant le temps de récupération après réchauffement6.
Ici nous décrivons un protocole pour la vitrification des ovocytes de moutons rassemblés des donateurs juvéniles et adultes et mûris in vitro avant cryopreservation. Le protocole comprend toutes les procédures allant de la maturation in vitro des ovocytes à la vitrification, au réchauffement et à la période de culture post-réchauffement.

<table><tbody><tr><td>2&prime ;,7&prime ;-Diacétate de dichlorofluorescine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-6883</td><td></td></tr><tr><td>Albumine bovine fraction V, sans protéase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Bisbenzimide H 33342 trichlorhydrate (Hoechst 33342)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium (CaCl2 2H20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser</td><td>Leica Microsystems GmbH,Wetzlar</td><td>TCS SP5 DMI 6000CS</td><td></td></tr><tr><td>Cryotop Kitazato</td><td>Medical Biological Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cysteamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9768</td><td></td></tr><tr><td>D- (-) Fructose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>D(+)Tréhalose déshydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Phosphate salin tamponné</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Jaune d’oeuf</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3556</td><td></td></tr><tr><td>Éthylène glycol (EG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>324558</td><td></td></tr><tr><td>FSH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4021</td><td></td></tr><tr><td>Acide glutamique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5638</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8790</td><td></td></tr><tr><td>Héparine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4149</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Hypoutarine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1384</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Diaphot, Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Alanine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3534</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3784</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4284</td><td></td></tr><tr><td>Acide L-Aspartique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4534</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystéine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8786</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>LH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6420</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9511</td><td></td></tr><tr><td>L-Isoleucine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7383</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1512</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1137</td><td></td></tr><tr><td>L-Méthionine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2893</td><td></td></tr><tr><td>L-Ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O6503</td><td></td></tr><tr><td>L-Phénylalanine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5030</td><td></td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4655</td><td></td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5511</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1020</td><td></td></tr><tr><td>L-Valine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V6504</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium heptahydraté (MgSO4.7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de comptage Makler</td><td>Sefi-Medical Instruments ltd. Biosigma S.r.l.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5017</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Rouge CM-H2XRos</td><td>ThermoFisher</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau nouveau-né inactivé thermiquement (FCS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4762</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline G sel de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Rouge phénolique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>Alcool polyvinylique (hydrolysé à 87-90 %, poids molaire moyen 30 000-70 000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Iodure de propidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de mouton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2202</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr> Sirop de solution <tr><td>de dl-lactate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4263</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Analyseur de classe de sperme</td><td>Microptic S.L.</td><td>S.C.A. v 3.2.0</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel statistique Minitab 18.1</td><td>2017 Minitab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Olimpus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7146</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15 456-3</td><td></td></tr></tbody></table>

vitrification d’ovocytes mûris in vitro prélevés sur des ovaires adultes et prépubéraux chez des moutons

Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep

Chez le bétail, les systèmes de production d’embryons in vitro peuvent être développés et maintenus grâce au grand nombre d’ovaires et d’ovocytes qui peuvent être facilement obtenus à partir d’un abattoir. Les ovaires adultes portent toujours plusieurs follicules antraux, tandis que chez les donneurs pré-pubertaires, le nombre maximal d’ovocytes est disponible à l’âge de 4 semaines, lorsque les ovaires portent un nombre maximal de follicules antraux. Ainsi, les agneaux âgés de 4 semaines sont considérés comme de bons donneurs, même si la compétence développementale des ovocytes prépubéraux est inférieure à celle de leur homologue adulte. 
La recherche fondamentale et les applications commerciales seraient stimulées par la possibilité de cryoconserver avec succès des ovocytes vitrifiés obtenus à partir de donneurs adultes et prépubères. La vitrification des ovocytes prélevés auprès de donneurs prépubéraux permettrait également de raccourcir l’intervalle de génération et ainsi d’augmenter le gain génétique dans les programmes de sélection. Cependant, la perte de potentiel de développement après cryoconservation fait des ovocytes de mammifères probablement l’un des types de cellules les plus difficiles à cryoconserver. Parmi les techniques de cryoconservation disponibles, la vitrification est largement appliquée aux ovocytes animaux et humains. Malgré les progrès récents de la technique, les expositions à des concentrations élevées d’agents cryoprotecteurs ainsi que les dommages de refroidissement et le stress osmotique induisent encore plusieurs changements structurels et moléculaires et réduisent le potentiel de développement des ovocytes de mammifères. Ici, nous décrivons un protocole pour la vitrification des ovocytes de moutons rassemblés des donateurs juvéniles et adultes et mûris in vitro avant cryopreservation. Le protocole comprend toutes les procédures allant de la maturation in vitro des ovocytes à la vitrification, au réchauffement et à la période d’incubation post-réchauffement. Les ovocytes vitrifiés au stade MII peuvent en effet être fécondés après réchauffement, mais ils ont besoin de plus de temps avant la fécondation pour restaurer les dommages dus aux procédures de cryoconservation et pour augmenter leur potentiel de développement. Ainsi, les conditions et le moment de la culture post-réchauffement sont des étapes cruciales pour la restauration du potentiel de développement des ovocytes, en particulier lorsque les ovocytes sont prélevés auprès de donneurs juvéniles.

La cryo-tolérance des ovocytes provenant de donneurs juvéniles est plus faible que chez les adultes. Le premier effet observé est un taux de survie post-réchauffement plus faible par rapport aux ovocytes adultes(figure 1A; χ2 test P&lt;0,001). Les ovocytes juvéniles ont montré une intégrité membranaire inférieure après réchauffement (Figure 1B). L’utilisation du tréhalose dans le milieu de maturation visait à vérifier si ce sucre pouvait réduire les c...

Le protocole vise à fournir une méthode standard pour la vitrification des ovocytes de moutons adultes et juvéniles. Il comprend toutes les étapes de la préparation du milieu de maturation in vitro à la culture post-réchauffement. Les ovocytes sont vitrifiés au stade MII en utilisant Cryotop pour assurer le volume essentiel minimum.

Vitrification d’ovocytes mûris in vitro prélevés sur des ovaires adultes et prépubéraux chez des moutons

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily ...

Le maintien de la viabilité potentielle des ovocytes après le stockage à long terme représente un outil de grande opportunité, car il améliorerait l’élevage d’animaux domestiques par des programmes de sélection génétique, contribuerait à préserver la biodiversité grâce à la conservation des espèces sauvages et augmenterait la recherche en biotechnologie. La vitrification des ovocytes juvéniles était beaucoup plus courte dans l’intervalle de génération dans les programmes de reproduction. La vitrifaction par refroidissement et réchauffement ultrarapides est considérée comme une approche standard dans la préservation des ovocytes du bétail.Cependant, chez les moutons, cette procédure est encore considérée comme relativement nouvelle et une méthode standard fait défaut. Dans ce vidéo, nous décrivons un protocole pour la vitrification de l’ovocyte de mouton, recueilli des donateurs juvéniles et adultes, et in vitro mûri avant cryopreservation. Le protocole comprend toutes les procédures de maturation in vitro, de vitrification, de réchauffement et de culture post-réchauffement.Après avoir récupéré le complexe d’ovocytes Cumulus, où mûri in vitro pendant 24 heures dans un état statique qui comprennent pour les ovocytes juvéniles, la supplémentation avec une centaine de micromolaires de tréhalose dans le milieu de maturation. Après maturation in vitro, les ovocytes ont été dénudés des cellules de Cumulus mécaniquement par pipetting doucement et examinés au microscope stéréo, avec le grossissement de 60x. La sélection des ovocytes à soumettre aux procédures de vitrification représente la première étape importante pour garantir l’application réussie de cette procédure.Seuls ceux avec le cytoplasme uniforme, avec une distribution homogène des gouttelettes lipidiques, l’intégrité de l’ensemble Emma large et continu pivot dans l’espace, zone compacte pellucida le diamètre extérieur d’environ 19 micromètres et montrant l’extrusion du premier corps polaire, et donc à la M2, stade doivent être sélectionnés. La vitrification a été réalisée en utilisant la méthode du volume essentiel minimum, avec un dispositif Cryotops. Après sélection, un groupe de cinq ovocytes juvéniles ont été conditionnés à 38.5 degrés Celsius dans le milieu de base pendant deux minutes.Les ovocytes ont ensuite été déshydratés par une exposition de trois minutes à une solution d’étalonnage. Le chargement de l’ovocyte dans le dispositif de vitrification utilisé est une étape importante et critique. Cryotop utilise une bande de polypropylène fixée à un support.Dans cette méthode, les ovocytes de la solution de vitrification, moins de 0 point millilitre, sont rapidement chargés d’un capillaire en verre sur le dessus de la bande de film. Ensuite, la solution doit être retirée, laissant derrière elle une fine couche suffisante pour couvrir les cellules à cryoconserver. Avant d’être chargé dans l’appareil Cryotop et directement plongé dans l’azote liquide dans les 30 secondes.Pour la température biologique intérieure chaude, la teneur de chaque dispositif de vitrification a été transférée de l’azote liquide dans 200 gouttes microlitres de solution de tréhalose décroissante. Les ovocytes ont été transférés ensemble était, traînant les ovocytes avec une mince, pipette de verre, pour favoriser l’élimination des cryoprotectants intracelulaires. Enfin, les ovocytes ont été pré-reproduits dans un milieu de base en incubateur dans 5% de dioxyde de carbone.Immédiatement après le réchauffement, et pour chaque point temporel de la culture post-réchauffement, les ovocytes ont été morphologiquement évalués à l’aide d’un microscope inversé avec un grossissement de 100x. La tolérance cryo des ovocytes des donneurs juvéniles est plus faible comparée à ceux altérés avec l’intégrité inférieure de membrane après réchauffement. L’utilisation de tréhalose dans le milieu de maturation induite dans les ovocytes juvéniles une intégrité membranaire plus élevée, augmentant les taux de survie après vitrification.Cependant le clivage, la fertilisation, et les taux de développement des ovocytes juvéniles n’ont pas été augmentés par la supplémentation de tréhalose. L’utilisation de milieux avec une concentration en calcium égale à 2,2 milligrammes de décilitre pour la vitrification des ovocytes juvéniles, devrait des taux de fécondation plus élevés par rapport aux ovocytes vitrifiés avec la concentration de calcium, mais aucune différence n’a été trouvée permettant la production. En comparant la culture post-réchauffement sur différentes durées, nous avons montré qu’après quatre heures de culture, les ovocytes collectés auprès de deux personnes âgées sont capables de récupérer les liaisons énergétiques et la configuration microtubulaire, et de restaurer la compétence développementale avec un clivage plus élevé et des déchets de blastocytes.L’activité mitochondriale était plus élevée dans les ovocytes juvéniles chauds vitrifiés après quatre heures de culture poteau-réchauffante, comparé à d’autres points de temps. La répartition mitochondriale a également changé pendant six heures de culture post-réchauffement. D’ailleurs, les niveaux intracellulaires réactifs d’espèces de l’oxygène étaient sensiblement inférieurs dans les ovocytes juvéniles à deux heures de culture poteau-chaude comparée à 0, 4, et 6 heures.Cependant, et contrairement à ce qui a été trouvé dans d’autres ovocytes, les taux d’activation parthenogentic spontanée ont augmenté pendant la culture de poteau-réchauffement dans les ovocytes juvéniles. L’un des principaux avantages de la méthode proposée est qu’elle comprend toutes les étapes de la collecte des ovocytes à la maturation in vitro, à la vitrification et au réchauffement. De plus, il comprend une période de culture post-réchauffement pour permettre la récupération des ovocytes des dommages subis lors de la procédure de vitrification.Choisir le moment optimal pour la fertilisation est difficile, et cela peut avoir un impact sur le résultat du programme de vitrification. Il faut également considérer que, contrairement à la congélation lente, la vitrification est une technique manuelle, et dépend donc de l’opérateur. Pour cette raison, un défi majeur est le besoin de techniciens et de chercheurs qualifiés qui tiennent compte de l’effet de l’opérateur dans l’évaluation des résultats du programme de vitrification.D’autres études de notre laboratoire permettront de tenter de normaliser la procédure de vitrification et la sélection des ovocytes, et de mieux adapter la composition des milieux aux besoins de l’ovocyte juvénile. Un mépris sur l’utilisation de la culture et du caractère et antioxydant nous offrons des opportunités prometteuses.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

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Analyse de la ségrégation chromosomique, de l&#39;acétone d&#39;histone et de la morphologie de la broche dans les ovocytes

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