Name: Collecte de données microscopiques d’éclairage cryostructuré à partir de cellules cryogéniquement préservées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Découvrez la microscopie SIM cryogénique pour l'imagerie super-résolution de cellules entières. Cette méthode permet de visualiser les mitochondries et les microtubules dans des cellules U2OS avec une résolution élevée.

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Ce projet a reçu un financement du projet Horizon 2020 iNEXT-Discovery de la Commission européenne. I.M. Dobbie reconnaît le financement du Wellcome Trust (107457/Z/15/Z). Ce travail a été réalisé avec le soutien de la source lumineuse Diamond, instrument B24 (proposition BI25512). Nous remercions le personnel de Micron et tous nos excellents utilisateurs et collaborateurs de nous avoir aidés à établir le cryoSIM et son potentiel corrélatif.

<ol><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+demystified%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li>
<li>Ball, G., Demmerle, J., Kaufmann, R., Davis, I., Dobbie, I. M., Schermelleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMcheck%3A+A+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">SIMcheck: A toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15915(2015).</li>
<li>Kounatidis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Correlative+cryo-structured+illumination+fluorescence+and+soft+X-ray+microscopy+elucidates+reovirus+intracellular+release+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">3D Correlative cryo-structured illumination fluorescence and soft X-ray microscopy elucidates reovirus intracellular release pathway.</a> Cell. 182 (2), 515-530 (2020).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Rego, E. H., Shao, L., Rego, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Practical structured illumination microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 1251(2015).</li>
<li>Phillips, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoSIM%3A+super-resolution+3D+structured+illumination+cryogenic+fluorescence+microscopy+for+correlated+ultrastructural+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging.</a> Optica. 7 (7), 802(2020).</li>
<li>Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+and+fiducial-marker-free+correction+for+three-dimensional+chromatic+shift+in+biological+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy.</a> Scientific Reports. 8, 7583(2018).</li>
<li>Kaufmann, R., Hagen, C., Grünewald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+cryo-microscopy%3A+current+challenges+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence cryo-microscopy: current challenges and prospects.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 20, 86-91 (2014).</li>
<li>Phillips, M. A., Pinto, D. M. S., Dobbie, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPEKcheck-fluorescence+microscopy+spectral+visualisation+and+optimisation%3A+a+web+application%2C+javascript+library%2C+and+data+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Wellcome+Open+Research%22%5BJournal%5D)">SPEKcheck-fluorescence microscopy spectral visualisation and optimisation: a web application, javascript library, and data resource.</a> Wellcome Open Research. 3, 92(2018).</li>
<li>Demmerle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategic+and+practical+guidelines+for+successful+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy.</a> Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

La carte SIM 3D à des températures cryogéniques présente de nombreux avantages par rapport aux autres techniques d’imagerie SR pour l’imagerie de matériel biologique vitrifié. Il nécessite beaucoup moins d’images par tranche z par rapport aux autres méthodes SR, ce qui entraîne moins d’irradiation et moins de risque de formation de cristaux de glace pour les échantillons vitrifiés. Il est également capable d’imager des cellules entières et peut être corrélé avec la tomographie aux rayons X pour faire correspondre la structure à la fonction. Fait intéressant, la plupart des fluorophores et des étiquettes de fluorescence disponibles dans le commerce blanchissent moins dans des conditions cryogéniques qu’à température ambiante. Cependant, étant donné le rendement quantique élevé des fluorophores les plus courants à température ambiante (plus de 80% dans certains cas), le gain absolu détecté en photons n’est pas dû à des changements dans le rendement quantique, mais à une réduction des processus complexes de blanchiment. Plus d’informations sur le rendement des fluorophores à des températures cryogéniques peuvent être trouvées dans 8.
Il est essentiel que les échantillons arrivant au cryoSIM aient été prémélectionnés à l’aide d’un microscope à cryofluorescence conventionnel doté d’une capacité de champ lumineux pour produire une « carte » en grille qui comprend la mise en évidence de toutes les AOI potentielles pour une imagerie ultérieure(Figure 5). Le temps d’accès au cryoSIM est attribué via un processus concurrentiel qui implique la soumission d’une proposition, qui est ensuite évaluée pour la faisabilité de la technique et l’impact biomédical. Le temps passé à l’équipement est donc toujours « payant », et les grilles préappées permettent l’utilisation la plus efficace d’une allocation. Il est également essentiel que l’échantillon reste vitrifié, en particulier lors du transfert de l’échantillon du porte-échantillon à la plate-forme d’imagerie, afin de minimiser la formation de cristaux de glace et les dommages ultérieurs à l’échantillon. L’échantillon doit être de bonne qualité pour produire les meilleures images SIM. Un échantillon bien préparé sera caractérisé par les caractéristiques suivantes: (a) il n’aura pas de contamination par des cristaux de glace, (b) la grille utilisée sera une grille de recherche, (c) le support sera plat, (d) le maillage de la grille et la surface du substrat ne seront pas auto-fluorescents, et (e) il n’y aura pas de ruptures dans la membrane de support. Ces conditions préalables peuvent être obtenues en manipulant soigneusement les échantillons et en veillant à ce que les échantillons restent toujours vitrifiés.
Il est important de vérifier à l’avance si les fluorophores d’échantillon proposés donneront suffisamment de signal dans le microscope cryoSIM. Des outils tels que SPEKCheck9 peuvent aider à choisir les combinaisons optimales de fluorophores et de filtres. S’il y a des problèmes avec la collecte de données brutes ou le processus de reconstruction, des artefacts peuvent apparaître dans les images après la reconstruction. Des exemples de divers artefacts ont été documentés par Demmerle et al.10 Les paramètres de reconstruction d’image peuvent être examinés dans le fichier journal SoftWoRx si la reconstruction n’est pas optimale en ouvrant le fichier récapitulatif de reconstruction. Il doit y avoir un interligne cohérent entre les angles d’un canal donné et une amplitude relativement constante. Une variation de plus de 30 % et des valeurs significativement supérieures à 1 (si une compensation de la taille des billes est appliquée) devraient être étudiées de plus près et sont susceptibles d’indiquer l’échec des reconstructions. En outre, le logiciel SIMcheck2 aux Fidji peut également être utilisé pour effectuer diverses vérifications sur les données brutes et reconstruites afin de diagnostiquer la cause des erreurs dans les paramètres d’imagerie ou de reconstruction. SIM-check et sa carte de contraste de modulation peuvent également aider à évaluer la qualité des données reconstruites en interprétant quelles zones d’une image sont susceptibles d’être des structures réelles par rapport à des artefacts.
Un faible contraste de modulation (représenté par la couleur sombre, dans la figure 5E)dans la zone nucléaire signifie que cette région sera plus sensible aux artefacts de reconstruction, ce qui implique que les modèles de hachage montrés dans le noyau pourraient être classés(figure 5D)comme un artefact. Les zones de signal de fluorescence forte sont plus susceptibles de refléter avec précision les structures natives dans les données traitées. Dans les zones de signal faible où les fluorophores sont répartis sur des zones plus larges, telles que la surface totale d’une vésicule, il est probable que le signal réel coexiste avec les artefacts de traitement, et il convient de faire attention à l’interprétation de ces données. Après inspection des données reconstruites sur toute la gamme pour s’assurer qu’il n’y a pas d’artefacts étranges et que l’arrière-plan est généralement gaussien et centré près de zéro, les données sont généralement coupées à zéro, ou la valeur modale - le pic du signal de fond - devrait être très proche de zéro. Cela garantit que la plage dynamique de l’image affichée n’est pas dominée par des artefacts d’arrière-plan négatifs. Lorsqu’un signal plus faible est attendu, des précautions supplémentaires doivent être prises pour analyser les caractéristiques et s’assurer qu’il s’agit de structures réelles plutôt que d’artefacts de reconstruction.
Il existe certaines limites du système d’imagerie. Étant donné que l’étage de l’échantillon est plat, les échantillons d’épaisseur variable ou les grilles qui ne sont pas plates ne sont pas des sujets idéaux pour l’imagerie. De plus, si l’imagerie corrélative est effectuée à l’aide de la tomographie par rayons X mous, les cellules situées près des limites de la grille ne doivent pas être imagées car elles ne seront pas visibles au microscope à rayons X lors de l’acquisition de la série d’inclinaison. Enfin, la quantité de buvardage de l’échantillon avant la congélation en plongée a un impact significatif sur la qualité de l’imagerie; trop peu de buvardage entraîne des échantillons trop épais, ce qui donne des images SIM sous-optimales avec un bruit de fond élevé, tandis qu’un trop grand nombre de buvard peut rendre les cellules déformées et donc plus sensibles aux dommages causés par la chaleur du faisceau laser incident. En résumé, cryoSIM est un puissant outil de microscopie à fluorescence pour l’imagerie d’échantillons biologiques en 3D à un stade quasi natif et a de nombreuses applications dans de nombreux domaines.

Les techniques d’imagerie SR sont devenues largement accessibles aux biologistes au cours de la dernière décennie1. Ils permettent l’imagerie à haute résolution d’échantillons marqués par fluorescence au-delà de la limite de diffraction. Cependant, il a été difficile d’adapter les méthodes de microscopie SR pour travailler avec des échantillons à des températures cryogéniques2. Cela serait avantageux pour l’imagerie corrélative en combinaison avec la tomographie par électrons ou rayons X. Récemment, sim a été adapté pour une utilisation avec des échantillons cryogéniques et a été démontré avec succès pour permettre des études corrélatives de cellules biologiques en conjonction avec la tomographie par rayons X mous (SXT)3 à la ligne de faisceau de cryo-imagerie corrélative B24 au synchrotron de source lumineuse Diamond (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html). SIM peut doubler la résolution de la microscopie à grand champ conventionnelle en éclairant l’échantillon avec des motifs de lumière rayés (franges Moiré) à trois angles et en cinq phases. L’interférence entre ces motifs lumineux et la fluorescence de l’échantillon peut être utilisée pour découvrir informatiquement des informations supplémentaires sur les structures de sous-diffraction4,5.
Il existe plusieurs avantages de la carte SIM par rapport aux autres techniques SR pour les applications cryogéniques. Tout d’abord, il peut fonctionner sans fluorophores clignotants spécialement conçus; les fluorophores conventionnels peuvent être utilisés, donnant accès à une gamme plus large d’agents de marquage fluorescents potentiels6. De plus, il ne nécessite que 15 images par tranche z (en 3D; 9 images pour la 2D), alors que d’autres méthodes SR prennent environ 1000 images par tranche, ce qui augmente les chances que l’échantillon soit chauffé et augmente donc le risque de formation de cristaux de glace, ce qui peut causer des artefacts. Enfin, cette technique permet d’imager des échantillons biologiques plus épais de plus de 10 μm, permettant d’imager des cellules entières dans leur état quasi natif6. Le cryoSIM a été construit à l’aide de composants optiques standard et avec un logiciel en libre accès pour l’imagerie, ce qui facilite la documentation et la duplication si vous le souhaitez6. Le cryoSIM a un objectif à ouverture numérique 100x/0,9 (voir le Tableau des matériaux); Phillips et al.6 Ici, ce protocole montre comment utiliser le microscope cryoSIM, y compris comment charger et décharger des échantillons sur la scène cryogénique, comment collecter des données au microscope et comment reconstruire les images SIM.

<table><tbody><tr><td>Grilles automatiques</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autogrids</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1036173</td><td></td></tr><tr><td>BioTracker 488 Colorant pour cytosquelette de microtubules verts</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCT142</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de cockpit</td> Université <td>d’Oxford</td><td></td><td>https://github.com/MicronOxford/cockpit</td></tr><tr><td>conteneur en polyuréthane compatible cryogénique</td><td>Jena bioscience</td><td>CC-FD-800</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de rangement en grille Cryo</td><td>TEM Thermo Fisher</td><td>Scientific Model#Microscope cryo-SIM AutoGrid</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sur mesure N</td><td>/A</td><td>Sur mesure, voir la référence suivante pour la conception :&nbsp ; Michael A. Phillips, Maria Harkiolaki, David Miguel Susano Pinto, Richard M. Parton, Ana Palanca, Manuel Garcia-Moreno, Ilias Kounatidis, John W. Sedat, David I. Stuart, Alfredo Castello, Martin J. Booth, Ilan Davis et Ian M. Dobbie, « CryoSIM : microscopie à fluorescence cryogénique à illumination structurée 3D super-résolution pour l’imagerie ultrastructurelle corrélée », Optica 7, 802-812 (2020). Dispose d’un Nikon TU Plan Apo 100x/0.9 NA.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Système de cryoétage</td><td>Linkam Scientific Instruments</td><td>CMS196</td><td></td></tr><tr><td>Pince chirurgicale à pointe fine</td><td>Ted Pella</td><td>38125</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Deep Red FM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M22426</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de microscope Python</td><td>Oxford University</td><td></td><td>https://www.python-microscope.org/</td></tr> <tr><td>Lingettes scientifiques pour papier sec</td><td>Kimberly-Clark 7551</td><td></td><td></td>2</tr><tr><td>Logiciel de reconstruction SIM</td><td>softWoRx, version GE Healthcare</td><td>&nbsp ; 6.5.2</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel StitchM</td><td>Source</td><td></td> lumineuse diamant <td>https://github.com/DiamondLightSource/StitchM</td></tr><tr><td>grilles TEM pour échantillons</td><td>Quantifoil Micro Tools</td><td>G200F1</td><td></td></tr></tbody></table>

collecte de données microscopiques d’éclairage cryostructuré à partir de cellules cryogéniquement préservées

Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells

La microscopie à éclairage structuré (SIM) tridimensionnelle (3D) permet l’imagerie de structures cellulaires marquées par fluorescence à une résolution plus élevée que la microscopie à fluorescence conventionnelle. Cette technique de super-résolution (SR) permet de visualiser les processus moléculaires dans des cellules entières et a le potentiel d’être utilisée conjointement avec la microscopie électronique et la tomographie aux rayons X pour corréler les informations structurelles et fonctionnelles. Un microscope SIM pour échantillons cryogéniquement conservés (cryoSIM) a récemment été mis en service sur la ligne de faisceau corrélative de cryo-imagerie B24 du synchrotron britannique. 
Il a été conçu spécifiquement pour l’imagerie 3D d’échantillons biologiques à des températures cryogéniques d’une manière compatible avec l’imagerie ultérieure des mêmes échantillons par des méthodes de microscopie à rayons X telles que la tomographie aux rayons X cryo-mous. Cet article vidéo fournit des méthodes et des protocoles détaillés pour une imagerie réussie à l’aide du cryoSIM. En plus des instructions sur le fonctionnement du microscope cryoSIM, des recommandations ont été incluses concernant le choix des échantillons, des fluorophores et des paramètres. Le protocole est démontré dans des échantillons de cellules U2OS dont les mitochondries et la tubuline ont été marquées par fluorescence.

Un échantillon contenant des cellules U2OS a été coloré avec un mélange de colorant de cytosquelette de microtubules verts et de colorant de mitochondries rouges, ce qui a entraîné la coloration du composant microtubule du cytosquelette (vert) et des mitochondries (rouge). Des images ultérieures ont montré la localisation des mitochondries dans la cellule ainsi que la disposition des microtubules, mettant en évidence le cadre structurel qu’ils fournissent à la cellule et l’assemblage du cytosquelette autour d’organites tels que le noyau. La résolution dans cryoSIM est significativement plus élevée que celle en microscopie à épifluorescence standard(Figure 5). La figure 6 montre comment la « carte » fluorescente d’un microscope à épifluorescence conventionnel peut être utilisée pour localiser les zones d’intérêt pour l’imagerie et l’image reconstruite cryoSIM correspondante à partir d’un emplacement sur la grille.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig01.jpg"> Figure 1: Organigramme montrant les étapes du protocole d’imagerie cryoSIM. Abréviation : cryoSIM = Cryo-structured illumination microscopy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig02.jpg"> Figure 2: L’étage cryogénique. (A) La configuration du cryo-étage. (B) Grille d’échantillonnage représentée par des pinces inversées. (C) Composants de l’étage cryogénique. Les ports de connexion sont étiquetés, avec les couleurs correspondant à l’orange: alimentation, jaune: couvercle de scène chauffé, bleu: dewar externe, vert: connexion au PC. Abréviations : PC = ordinateur personnel; LN2 = azote liquide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig03.jpg"> Figure 3: Vues des panneaux logiciels du cockpit. (A) Panneau principal, (B) macro étape XY, (C) vue mosaïque, (D) vues de la caméra. Abréviation : SLM = modulateur de lumière spatiale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig04.jpg"> Figure 4: Vues des panneaux logiciels Cockpit. (A) Expérience sur un seul site de pile Z. (B) Expérience sur site unique SI. (C) Raccourcis clavier pour le logiciel de cockpit utilisé lors de l’acquisition d’images. (D) Le microscope cryoSIM est sur place à la ligne de faisceau B24 du synchrotron Diamond Light Source. Abréviation : cryoSIM = Cryo-structured illumination microscopy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig05.jpg"> Figure 5: Résolution du cryoSIM. (A) Vue en mosaïque d’une grille à l’étude. (B) Image en champ lumineux d’une zone d’intérêt (AOI). (C) Image pseudo-grand champ par rapport à son (D) image SIM montrant l’augmentation de la résolution. La flèche blanche indique les artefacts de reconstruction SIM. (E) Carte de contraste de modulation combinant les informations d’intensité en pixels de l’image reconstruite avec les informations de couleur des valeurs respectives du rapport contraste/bruit de modulation (MCNR) des données brutes générées par SIMCheck2. Les régions claires et sombres présentent un contraste élevé et faible, respectivement. Barre d’échelle = 10 μm. Paramètres d’imagerie CryoSIM : longueurs d’onde d’excitation/émission : 488/525 nm, puissance laser de 50 mW, temps d’exposition de 50 ms et 647/655 nm, puissance laser de 20 mW, temps d’exposition de 5 ms. Abréviation : cryoSIM = Cryo-structured illumination microscopy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig06.jpg"> Figure 6: Reconstruction d’images dans cryoSIM à partir d’un emplacement sur la grille dans une carte de fluorescence à partir d’une carte d’épifluorescence conventionnelle. (A, B) Superposition de cartes d’images en champ clair et en fluorescence générées avec un microscope d’épifluorescence conventionnel. Cette carte est utilisée pour localiser les régions d’intérêt à imager ultérieurement dans cryoSIM. (C) L’image cryoSIM reconstruite obtenue à l’emplacement indiqué au point (B). Abréviation : cryoSIM = Cryo-structured illumination microscopy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Ce protocole montre comment imager des échantillons biologiques cryo-préservés à l’aide de la microscopie à éclairage cryo-structuré. Nous démontrons la méthodologie en imageant le cytosquelette des cellules U2OS.

Collecte de données microscopiques d’éclairage cryostructuré à partir de cellules cryogéniquement préservées

Three-dimensional (3D) structured illumination microscopy (SIM) allows imaging of fluorescently labelled cellular structures at higher resolution than ...

Cette méthode rend possible l’imagerie cryogénique à super résolution sur des cellules biologiques entières pour identifier avec précision les structures cellulaires. Il peut également être utilisé conjointement avec d’autres modalités dans le cadre d’un flux de travail d’imagerie corrélative. Les principaux avantages de cette technique sont que l’imagerie à super résolution peut être réalisée rapidement dans des conditions cryogéniques en utilisant des fluorophores conventionnels et des doses de lumière relativement faibles.CyroSIM est un outil puissant qui fournit des informations pour comprendre la dynamique de l’ultrastructure cellulaire en réponse à des signaux internes ou externes. Ses applications comprennent la production et le déploiement de vaccins, le contrôle de la qualité, la surveillance post-commercialisation, l’ingénierie et l’optimisation des anticorps, ainsi que la caractérisation des nanoparticules. Manœuvrer des échantillons dans la cryo-étape nécessite de la pratique pour assurer la sécurité du réseau.Il est également préférable de vous familiariser avec les commandes de la fenêtre Cockpit avant la collecte des données. Pour commencer, retirez le couvercle du Dewar externe de l’étage cryogénique et versez de l’azote liquide filtré jusqu’à ce qu’il soit rempli d’environ un quart. Attendez que l’ébullition initiale disparaisse avant d’en verser plus et remplissez le récipient à environ deux tiers plein.Remplacez soigneusement le couvercle en pointant la buse loin du manipulateur lorsque l’azote liquide bout. Une fois que l’azote liquide a cessé de sortir de la sortie, placez le tuyau de sortie au-dessus de l’étage Dewar sur l’étage cryogénique. Branchez la source d’alimentation, connectez le câble USB et branchez le Dewar externe à la scène.Après la livraison de l’azote liquide, appuyez sur le bouton de déverrouillage de l’étage cryogénique pour lui permettre d’entrer dans la chambre d’échantillonnage et attendez 30 à 45 minutes que le système refroidisse et se stabilise avant de commencer l’acquisition d’images. Utilisez la touche hexadétienne de l’outil cassette pour ouvrir les deux plaques de la cassette de transfert d’échantillons. Ouvrez les plaques assez largement pour laisser tomber la grille entre les deux plaques, mais ne les ouvrez pas à la position maximale.Utilisez de longues pinces pour soulever la boîte de grille d’échantillonnage de l’azote liquide. Tournez-le de sorte que l’encoche s’aligne sur la position de stockage à l’intérieur de la scène et placez-la sur la scène. Utilisez l’appareil approprié pour ouvrir le couvercle de la boîte de rangement à la bonne position de l’échantillon.À l’aide de pinces inversées, retirez la grille TEM du porte-échantillon, immergez-la à l’intérieur de l’azote liquide en vous assurant que le côté du film de carbone est placé de manière à ce qu’il soit finalement orienté vers l’objectif sur le pont d’échantillon et déposez-le en position dans la cassette de transfert d’échantillon. Fermez la cartouche d’échantillon à l’aide de la touche hexadétiste de l’outil cassette. Utilisez le point magnétique de l’outil de cassette pour soulever et monter la cartouche contenant la grille sur le pont d’échantillonnage.Gardez-le immergé ou près de l’azote liquide et dans la bonne orientation. Placez la cassette à plat dans les broches de positionnement du pont et poussez-la doucement pour vous assurer qu’elle est fixée. Fermez et retirez la boîte de stockage ainsi que les échantillons restants.Déplacez l’ouverture du couvercle de l’étage cryogénique vers la position d’imagerie et éteignez la lumière de la chambre d’échantillonnage. Faites glisser la scène vers l’optique pour l’aligner sous la lentille de l’objectif, puis laissez doucement tomber l’objectif en position à l’aide du levier, en vous assurant qu’il repose dans le couvercle du cryo-étage, mais ne le touche pas. Couvrez la scène et l’optique avec un rideau noir opaque, puis démarrez le logiciel de contrôle Cockpit sur le PC cryoSIM. Cliquez sur le bouton du mode de lecture pour chaque caméra et réglez-le sur CONV3 mégahertz.Vérifiez que la température de chaque caméra est de 80 degrés Celsius et que le ventilateur de la caméra est éteint. Allumez la caméra réfléchie, sous la lumière, choisissez ambiant et sous linkam, vérifiez le condenseur, puis cliquez sur le bouton du mode vidéo. Dans la fenêtre mosaïque, effectuez un zoom arrière pour afficher le contour de la grille.Cliquez sur Trouver une scène si elle ne peut pas être vue et centrez la grille en double-cliquant à gauche au milieu du cercle. Utilisez les touches haut et bas pour focalisation de l’échantillon jusqu’à ce que le film de support de grille ou toute autre fonction pertinente soit mis au point. Utilisez les neuf et trois touches du pavé numérique pour modifier l’étape Z.Une fois la scène centrée, désactivez le mode vidéo. Collectez une mosaïque de lumière visible en cliquant sur Exécuter la mosaïque dans la vue mosaïque pour produire des tuiles d’images de lumière visible qui tournent en spirale vers l’extérieur à partir du centre. Enregistrez la vue en cliquant sur Enregistrer la mosaïque.Inspectez la mosaïque de champ lumineux à côté de toutes les images cartographiques de fluorescence précédentes en éteignant la lumière ambiante et le condenseur ainsi que le mode vidéo, puis allumez le laser d’excitation requis et choisissez la caméra et le filtre correspondants, initialement à 50 milliwatts pour un temps d’exposition de 50 millisecondes. Appuyez sur zéro pour accrocher une image et étoile pour contraster automatiquement. Vous pouvez également ajuster manuellement le contraste à l’aide du curseur en bas de l’image.Une fois que des cellules biologiquement intéressantes avec une fluorescence appropriée ont été trouvées, marquez leurs positions à l’aide du bouton marquer le site dans la vue Mosaïque. Continuez à marquer tous les sites potentiels avant de commencer l’acquisition d’images. Enregistrez à nouveau la mosaïque avec les sites marqués en cliquant sur Enregistrer les sites dans le fichier.Pour assembler l’image de mosaïque à l’aide du logiciel stitchEm, faites glisser et déposez le fichier de mosaïque de texte dans le fichier stitchEm avec l’extension BAT et enregistrez l’image TIF combinée des mosaïques dans le même dossier. Pour enregistrer une image avec les sites marqués, faites glisser et déposez le fichier texte mosaïque et le fichier texte des marqueurs dans l’icône en même temps. Réglez le temps d’exposition laser en fonction des nombres et de la plage dynamique dans l’image de fluorescence au bas de la fenêtre de vue de la caméra.Choisissez le filtre à appliquer et optimisez les paramètres pour chaque longueur d’onde de lumière d’excitation à utiliser, en allumant chaque laser séparément. Cliquez sur les deux caméras pour les allumer. Revenez à l’un des sites marqués et concentrez-vous à nouveau sur la profondeur souhaitée.Une fois au point dans une zone d’intérêt, déplacez-vous hors de la mise au point à l’aide de la touche fléchée vers le haut dans la fenêtre XY de la scène macro pour choisir la hauteur de la pile Z à acquérir et cliquez sur Enregistrer en haut. Déplacez-vous hors de la mise au point à l’aide de la touche fléchée vers le bas, cliquez sur Enregistrer en bas, puis sur Aller au centre, vérifiez que l’image est toujours au point. Dans la fenêtre Cockpit, sélectionnez Expérience sur un seul site.Dans la liste déroulante, sélectionnez Éclairage structuré. Modifiez la hauteur de la pile pour qu’elle soit égale à la hauteur Z plus un micromètre. Entrez les temps d’exposition en millisecondes pour les lasers de 405 et 488 nanomètres dans la rangée supérieure pour la caméra réfléchie et les temps d’exposition pour les lasers de 561 et 647 nanomètres dans la rangée inférieure pour la caméra transmise.Entrez un nom de fichier et cliquez sur mettre à jour pour produire un nouveau fichier contenant la date et l’heure sans remplacer les fichiers précédents, puis cliquez sur Démarrer. Si l’azote liquide Dewar remplit l’étage cryogénique lors de l’acquisition de l’image, abandonnez le processus en cliquant sur le bouton ABORT du logiciel Cockpit. À chaque position, collectez une pile Z à l’aide de la lumière visible en éteignant les lasers et en allumant la lumière ambiante et le condenseur.Sous Expérience sur un seul site, sélectionnez Z-stack et réglez la lumière ambiante sur une exposition de 20 millisecondes, en maintenant la hauteur Z. Répétez ce processus pour tous les sites marqués. Une fois l’imagerie terminée, désamarrer la scène et retirer tous les échantillons.Éteignez le voyant de la chambre d’échantillonnage. Débranchez le Dewar externe et décantez tout l’azote liquide restant dans un autre récipient cryocompatible, ce qui permet au Dewar de revenir en toute sécurité à une température normale. Attendez que l’option de cuisson de l’écran cryo-étage soit disponible après qu’il ne reste plus d’azote liquide dans la scène Dewar.Appuyez sur le bouton de cuisson pour passer en mode chauffage. Placez le bouchon du couvercle sur la cryo-scène. La résolution dans cryoSIM est significativement plus élevée que celle de la microscopie à épifluorescence standard.La carte de fluorescence d’un microscope à épifluorescence conventionnel peut être utilisée pour localiser des zones d’intérêt pour l’imagerie et l’image cryoSIM correspondante peut être obtenue à partir d’un emplacement sur la grille. Un échantillon contenant des cellules U2OS a été coloré avec un mélange de colorant de cytosquelette de microtubules verts et de colorant de mitochondries rouges, ce qui a entraîné la coloration du composant microtubule du cytosquelette et des mitochondries. Des images ultérieures ont montré la localisation des mitochondries dans la cellule, ainsi que la disposition des microtubules, mettant en évidence le cadre structurel qu’ils fournissent à la cellule et l’assemblage du cytosquelette autour des organites.Le processus de reconstruction SIM peut produire des artefacts qui peuvent être identifiés à l’aide de SIMCheck, un plugin imageJ gratuit. Cette carte de contraste de modulation générée à l’aide de SIMCheck montre les zones de faible contraste de modulation dans la zone du noyau, indiquant que cette région sera plus sensible aux artefacts de reconstruction. La flèche blanche indique un artefact de reconstruction.Lorsque vous tentez ce protocole, assurez-vous que l’échantillon reste immergé ou proche de l’azote liquide en tout temps pour éviter la dévitrification. Faites également attention aux temps d’exposition et aux comptes dans la plage dynamique, car cela affecte la qualité des données et évite les dommages laser à l’échantillon. Après l’imagerie cryogénique, les mêmes échantillons peuvent être imagés avec d’autres modalités telles que la tomographie aux rayons X cryo-doux, que nous avons ici à la ligne de faisceau B24.En combinant des images cryoSIM avec des images contenant des informations structurelles sur la cellule, nous pouvons répondre à des questions supplémentaires clés sur l’ultrastructure et la fonction cellulaires.

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