Une méthode d’inoculation simple et flexible pour évaluer avec précision les phénotypes d’oïdium d’Arabidopsis et d’autres plantes

L’oïdium est une maladie importante des plantes. La détermination précise du phénotype de la maladie nécessite une inoculation uniforme de l’agent pathogène. Comme les méthodes existantes sont inefficaces, nous avons développé ce protocole.

Notre méthode d’inoculation des spores peut facilement atteindre une inoculation uniforme, et elle est simple et évolutive. Par conséquent, tout laboratoire travaillant avec de l’oïdium peut facilement utiliser cette méthode. Les chercheurs peuvent également monter un treillis sur une boîte en carton et l’utiliser pour l’inoculation des spores.

Comment déloger les spores et les brosser à travers les mailles est une étape critique. Donc, démontrer cela sur vidéo pourrait être très utile. Pour ce protocole, procurez-vous un rouleau de maille de membrane en nylon de 50 micromètres ou un treillis en acier inoxydable de 48 micromètres.

Coupez le contreplaqué de grande taille et de densité moyenne en morceaux de 24,5 X 10 pouces et 12 X 10 pouces pour faire une boîte d’inoculation. Pour faire un couvercle supérieur amovible avec un treillis, coupez le long goujon carré en bois en deux ensembles de 26 pouces et 12,75 pouces. Collez et clouez les quatre pièces pour les adapter autour de la boîte.

Prenez des feuilles d’acrylique et assemblez toutes les feuilles d’acrylique dans une boîte, à l’aide de huit pinces d’angle. Coupez une fenêtre ouvrante de 7 X 2 pouces sur la face avant de la feuille d’acrylique de la boîte. Pour préparer des spores fraîches d’oïdium comme inocula, cultivez des plantes mutantes Arabidopsis immunodéprimées pad4-1 dans une chambre de croissance à 22 degrés Celsius et 65% d’humidité relative pendant six à huit semaines.

Cultivez les plantes pour déterminer les phénotypes d’infection dans les appartements standard. Inoculer une ou la moitié des plants de pad4-1 pour produire suffisamment de spores fraîches d’oïdium. Lorsque des spores fraîches de plantes infectées sont disponibles, déplacer un plat de plantes dans la boîte d’inoculation à l’intérieur de la chambre d’inoculation pour un test d’infection.

Coupez 15 à 20 feuilles d’Arabidopsis fortement infectées et laissez-les sécher s’il y a de l’eau condensée. Tenez une à deux feuilles à l’envers dans une main avec une paire de pinces longues. Ensuite, passez les deux mains à travers l’ouverture de la chambre et frappez doucement le bras de la pince avec une paire de ciseaux, tout en déplaçant lentement les feuilles au-dessus du filet monté sur la boîte d’inoculation.

Brossez les spores avec de fines brosses mélangeuses à ventilateur sur toute la surface du maillage dans différentes directions pour maximiser la répartition uniforme des spores sur les plantes. Tapotez doucement le filet plusieurs fois avec les brosses pour secouer les spores coincées dans le filet. Une fois que les spores se sont installées, sortez l’appartement contenant les plantes inoculées de la boîte d’inoculation.

Couvrez l’appartement avec un dôme en plastique et placez-le dans une chambre de croissance à 22 degrés Celsius et 65% d’humidité relative. Le phénotypage de la maladie peut être effectué 5 ou 8 à 12 jours après l’inoculation. Convertissez les boîtes en carton en boîte d’inoculation en enlevant les côtés supérieur et inférieur de la boîte, en collant le coin pour la raffermir et en montant un maillage de 50 micromètres sur le dessus avec de la colle.

Déplacez l’appartement contenant les plantes à l’intérieur de la chambre d’inoculation et placez la plus petite boîte d’inoculation sur le dessus de l’appartement pour couvrir les plantes. Ensuite, délogez et brossez les spores. Faites une mini boîte d’inoculation légèrement plus grande qu’une boîte de Pétri.

Conservez les assiettes à quatre degrés Celsius au réfrigérateur jusqu’à utilisation. Coupez une ou deux feuilles complètement expansées à partir de la base du pétiole pour chaque plante à tester. Insérez le pétiole des feuilles détachées dans le milieu gélosé à un angle de 30 degrés.

Inoculer les feuilles à l’intérieur de la chambre d’inoculation et déplacer la plaque avec le couvercle vers une chambre de croissance. Pour évaluer les phénotypes d’infection, transférer les feuilles dans une nouvelle plaque aseptique de gélose MS quatre ou cinq jours après l’inoculation. Couper la base du pétiole avant d’insérer les feuilles dans le milieu gélosé frais.

Évaluer les phénotypes de la maladie huit ou neuf jours après l’inoculation. L’analyse microscopique a montré une répartition uniforme des spores sur les lames microscopiques au fond de l’appartement. La densité calculée des spores, réparties à six endroits différents après inoculation de lumière, n’a montré aucune différence significative.

Des résultats similaires ont été obtenus après des inoculations lourdes avec des spores. La régularité de l’inoculation a été examinée parmi différents génotypes de plantes 12 jours après l’inoculation lourde. Les plantes pad4-1 ont montré une sensibilité accrue aux maladies par rapport à Columbia 0, les plantes de type sauvage.

L’utilisation de spores fraîches adéquates, produites environ 10 jours après l’inoculation, sur les plantes sensibles, est importante, car les spores fraîches sont plus faciles à déloger et plus susceptibles d’établir une colonisation. L’oïdium ne colonise que les cellules épidermiques des plantes. L’isolement des cellules infectées par l’oïdium par pelage de l’épiderme, ou microdissection laser, permettrait une étude transcriptomique et protéomique plus ciblée des réponses de l’hôte.

Cette méthode aidera les chercheurs à déterminer plus efficacement les phénotypes d’infection par le mildiou en poudre et, par conséquent, devrait faciliter des études fonctionnelles plus efficaces sur les interactions entre l’oïdium des plantes.