Microscopie confocale à balayage laser de la dynamique du calcium dans les tranches de tissu pancréatique aigu de souris

En combinaison avec l’imagerie calcique des cellules vivantes, la technique de la tranche de tissu pancréatique aigu permet d’étudier les ondes intercellulaires et la connectivité fonctionnelle multicellulaire avec une haute résolution sur de longues périodes. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est rapide, préserve l’architecture tissulaire et réduit les contraintes enzymatiques et mécaniques limitées tout en maintenant un rendement élevé de tissus. En détectant les changements fonctionnels et morphologiques au cours de la progression de la maladie, cette technique aide à comprendre les maladies liées au pancréas, telles que le diabète.

Cette technique de tranche de tissu peut être appliquée aux tissus cérébraux, hypophysaires et surrénaliens en mettant l’accent sur la préservation du contact intercellulaire, des interactions paracrines et de l’architecture tissulaire. Pour vous préparer à l’injection d’agarose dans le pancréas de la souris, remplissez une seringue de cinq millilitres avec de l’agarose liquide de 40 degrés Celsius et équipez la seringue d’une aiguille de calibre 30. Après avoir soigneusement recouvert l’aiguille d’un capuchon, placez l’extrémité de l’aiguille de la seringue vers le bas, avec tout le volume d’agarose sous la surface de l’eau, dans un bain-marie de 40 degrés Celsius.

Faire bouillonner une bouteille de solution extracellulaire avec du carbogène, en continu sur de la glace, à 1,5 millilitre par minute à pression barométrique et température ambiante pour assurer l’oxygénation et un pH de 7,4. Pour effectuer l’injection d’agarose, placez une souris adulte euthanasiée sous un stéréomicroscope et accédez à l’abdomen de la souris par laparotomie. Déplacez doucement l’intestin vers le côté gauche pour exposer le canal biliaire commun et utilisez une pince pour soulever légèrement l’extrémité duodénale du canal afin de localiser la papille de Vater.

Utilisez un hémostat pour serrer le canal biliaire au niveau de la papille duodénale afin d’éviter les fuites de l’agarose du canal dans le duodénum et utilisez une petite pince pointue pour atteindre sous le canal biliaire commun afin de briser la membrane qui attache le canal au tissu pancréatique. Après avoir éliminé autant de graisse et de tissu conjonctif que possible du canal, placez le canal perpendiculairement sur les extrémités d’une paire de pinces plus grandes et appuyez fermement sur le piston de la seringue, injectez l’agarose liquide visqueux dans l’extrémité proximale du canal biliaire commun pendant 20 à 30 secondes. Lorsque le tissu devient blanchâtre et légèrement distendu, retirez la seringue et versez lentement 20 millilitres de la solution extracellulaire glacée bouillonnante sur le pancréas pour refroidir le tissu et durcir l’agarose.

Pour acquérir des tranches de tissu pancréatique, utilisez des pinces et des ciseaux fins et durs pour transférer doucement le pancréas injecté d’agarose dans une boîte de Petri de 100 millimètres contenant 40 millilitres de solution extracellulaire glacée. Faites tourbillonner le plat pour rincer le tissu et transférer le pancréas dans un deuxième plat de solution extracellulaire glacée. Utilisez la pince et les ciseaux pour couper la section blanchâtre et bien injectée du pancréas en six morceaux de 0,1 à 0,2 centimètre cube restants et retirez tout tissu conjonctif et adipeux restant des morceaux de tissu.

Placez les blocs nettoyés dans une boîte de Petri à fond non collant de 35 millimètres contenant environ cinq millilitres d’agarose liquide de 40 degrés Celsius et placez immédiatement la boîte de Petri sur de la glace. Lorsque l’agarose a durci, tenez la boîte de Petri à l’envers sur le couvercle d’une boîte de Petri de 100 millimètres et utilisez la moitié d’une lame de rasoir pour couper soigneusement dans la marge entre la paroi latérale de la boîte de Petri et l’agarose pour éliminer l’agarose du plat. Utilisez la lame de rasoir pour couper des cubes individuels, chacun contenant un bloc tissulaire d’agarose, de l’agarose libérée et utilisez de la colle cyanoacrylate pour attacher les blocs à la plaque d’échantillon d’un vibratome.

Remplissez la chambre de coupe du vibratome avec 150 millilitres de solution extracellulaire glacée continuellement bouillonnée de carbogène. Fixez la plaque d’échantillon sur le vibratome et montez une nouvelle lame de rasoir. Entourez la chambre de glace et ajoutez deux glaçons de 10 millilitres de volume fabriqués avec une solution extracellulaire complétée par six millimolaires de glucose.

Réglez la trancheuse sur 0,05 à 1 millimètre par seconde et 70 hertz, puis commencez à trancher pour acquérir des tranches d’agarose de 140 microns d’épaisseur avec une surface de 20 à 100 millimètres carrés. Utilisez un pinceau fin pour transférer soigneusement chaque tranche dans une boîte de Petri de 100 millimètres remplie de 40 millimètres de tampon HEPES complété par six millimolaires de glucose. Pour la préparation du colorant calcique, dissoudre 50 microgrammes de colorant indicateur de calcium perméable aux cellules, 7,5 microlitres de DMSO, 2,5 microlitres du poloxamère et 6,667 millilitres de HBS dans un tube à bouchon à vis de 15 millilitres.

Utilisez une pipette pour bien mélanger la solution pendant 20 secondes avant d’immerger le tube dans une chambre de bain à ultrasons et de le vortexer, chacun pendant 30 secondes. Ensuite, aliquote 3,333 millilitres de la solution de colorant indicateur de calcium résultante dans une boîte de Petri de 5 millilitres pour 10 tranches de tissu à étiqueter. Pour le chargement de colorant, utilisez un pinceau doux et fin pour transférer jusqu’à 10 tranches de tissu à chaque plat de solution de colorant et placez les plats sur un agitateur orbital pendant 50 minutes à température ambiante et 40 tours par minute à l’abri de la lumière.

À la fin de l’incubation, transférer jusqu’à 20 tranches colorées dans des boîtes de Petri individuelles de 60 millilitres remplies de HBS sans colorant. Pour l’imagerie calcique par microscopie confocale, sélectionnez un grossissement de 20 ou 25 fois et réglez le mode d’acquisition sur l’imagerie time-lapse, le sténopé à 100 à 200 microns, ainsi que l’excitation et l’émission pour le fluorophore utilisé dans l’expérience. Montez la chambre d’enregistrement et le système de perfusion sur l’étage à température contrôlée du microscope et positionnez l’entrée et la sortie sur les bords éloignés de la chambre d’enregistrement.

Réglez les débits d’entrée et de sortie à un à deux millilitres par minute. Réglez la température du système de profusion à 37 degrés Celsius et initiez la profusion avec la solution non stimulante. Pour enregistrer la dynamique du calcium du tissu, placez une seule tranche de tissu dans la chambre d’enregistrement et immobilisez le tissu avec un poids en platine en forme de U avec une maille de nylon tendue.

Utilisez l’option de champ lumineux pour localiser la structure d’intérêt et utilisez l’imagerie en direct pour positionner les structures étudiées dans le champ de vision. Pour optimiser le rapport signal/bruit, ajustez la puissance du laser, l’amplification du détecteur et la moyenne des lignes tout en maintenant la puissance laser minimale. Ajustez le plan focal à 15 microns sous la surface coupée pour éviter l’enregistrement à partir de cellules potentiellement endommagées et acquérir les images.

Réglage de la fréquence d’échantillonnage à un à deux hertz pour permettre la détection initiale des oscillations individuelles et l’enregistrement d’une image haute résolution. Si disponible, utilisez un tableau en ligne pour obtenir un retour instantané sur la réponse de préparation, le suréclairage, le photoblanchiment et la dérive mécanique. Lorsque toutes les images ont été acquises, enregistrez les données pour une analyse ultérieure.

Ici, un exemple de tranche de tissu optimale peut être observé dans lequel le colorant indicateur de calcium perméable à la cellule a été chargé avec succès dans la tranche de tissu pancréatique. En revanche, ces tranches de tissu ne sont pas optimales pour l’imagerie en raison d’une pénétration infructueuse du colorant, d’un manque de cellules d’îlots ou d’une abondance de tissu nécrotique à la surface des échantillons. Les images à haute résolution d’une tranche de tissu pancréatique peuvent être utilisées pour délimiter des régions distinctes du tissu pancréatique, telles que les îlots de Langerhans, le tissu acineux ou le canal pancréatique.

Les stimuli peuvent être utilisés pour discriminer fonctionnellement entre différentes cellules d’îlots ou entre les cellules d’îlots et non-îlots. Par exemple, les cellules bêta répondent généralement à une stimulation du glucose à impulsion carrée en présentant une augmentation transitoire du calcium intracellulaire suivie d’oscillations rapides du calcium sur un plateau soutenu. En revanche, les cellules non bêta répondent avec des oscillations plus rapides et plus irrégulières.

Un retard dans l’apparition de l’augmentation du calcium intracellulaire après la stimulation, ainsi que l’hétérogénéité et les retards entre les cellules individuelles peuvent également être mesurés. Les mêmes paramètres peuvent être utilisés pour décrire la phase de désactivation. Ici, une présentation schématique de la durée, de la fréquence et du pourcentage de temps actif de l’oscillation calcique intracellulaire peut être observée.

Lors de l’imagerie à des taux d’acquisition supérieurs à 10 hertz, les ondes de calcium qui se propagent à plusieurs reprises sur l’îlot peuvent être clairement reconnues. Serrez le canal biliaire commun aussi près que possible du duodénum pour éviter d’obstruer accidentellement la branche qui pénètre dans le pancréas. De plus, n’arrêtez pas d’enfoncer le piston pendant l’injection, car l’agarose durcira immédiatement dans l’aiguille.

La technique de la tranche aiguë de tissu pancréatique de souris peut également être utilisée avec la méthode de la pince à patch pour étudier les courants de canaux ioniques et accéder à la cytose, ainsi que des études d’immunohistochimie et des études de secrétaire.