Protocoles de PCR numérique en gouttelettes à transcription inverse en deux étapes pour la détection et la quantification du SRAS-CoV-2

Ces protocoles peuvent être utilisés pour développer en interne des tests de ddPCR multiplex pour la détection du SARS-CoV-2 à l’aide d’un système de ddPCR bicolore. Ceci est utile pour les personnes qui souhaitent développer leurs propres kits pour la détection du SARS-CoV-2 et d’autres agents pathogènes. Par rapport à la RT-qPCR de référence, la RT-ddPCR peut être utilisée pour quantifier plusieurs gènes du SRAS-CoV-2 sans avoir besoin d’une courbe standard.

Étant donné que la ddPCR est une technique émergente, la démonstration visuelle est importante pour aider les utilisateurs actuels et futurs à comprendre et à développer facilement des tests multiplex pour la détection du SRAS-CoV-2 et d’autres agents pathogènes. Pour la synthèse de l’ADNc, ajoutez deux microlitres de mélange maître de transcription inverse 5X, cinq microlitres de l’échantillon d’ARN d’intérêt et trois microlitres d’eau distillée double sans RNase dans un tube PCR de 100 ou 200 microlitres à un volume final de 10 microlitres comme solution, et placez le tube sur de la glace. Lorsque les réactifs éteints ont été ajoutés, chargez l’échantillon dans un thermocycleur et réglez l’instrument pour exécuter une transcription inverse à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes, une inactivation thermique de la transcription inverse pendant 5 secondes à 85 degrés Celsius et une maintien, à l’infini final, à quatre degrés Celsius.

Avant d’effectuer la PCR numérique par gouttelettes, ajoutez 19,8 microlitres de mélange principal fraîchement préparé au nombre approprié de puits d’une plaque de PCR numérique à 96 puits sans nucléase de gouttelettes. Ajouter 2,2 microlitres d’ADNc à chaque puits de mélange maître à un volume final de 22 microlitres de mélange réactionnel par puits et sceller la plaque avec un scellant à plaques PCR jetable. Ensuite, vortex la plaque pendant 15 à 30 secondes dans la centrifugeuse pendant 10 à 15 secondes pour recueillir le contenu du puits au fond de la plaque.

Pour la génération automatisée de gouttelettes sur l’écran tactile du générateur de gouttelettes automatisé, cliquez sur Configurer la plaque d’échantillonnage et sélectionnez les colonnes dans lesquelles les échantillons sont situés sur la plaque d’échantillonnage. Cliquez sur OK et ouvrez le couvercle du générateur de gouttelettes automatisé. Chargez les plaques de génération d’échantillons et de gouttelettes et les autres matériaux nécessaires à l’expérience aux endroits respectifs de l’instrument et fermez la porte.

Lorsque l’écran tactile devient vert, indiquant que tous les matériaux ont été chargés dans leurs positions correctes, sélectionnez l’huile pour les sondes et commencez à générer des gouttelettes. Attendez que la génération de gouttelettes se termine selon l’heure indiquée à l’écran. Lorsque l’écran indique Gouttelettes prêtes, ouvrez la porte pour retirer la plaque contenant les gouttelettes et utilisez un scellant de plaque pendant cinq secondes à 180 degrés Celsius pour sceller la plaque avec un joint en aluminium perçable.

Dans les 30 minutes suivant la génération de gouttelettes, placez la plaque de gouttelettes scellée dans un cycleur thermique à puits de 96 profondeurs. Réglez le volume de l’échantillon à 40 microlitres et la température du couvercle à 105 degrés Celsius. Ensuite, la PCR amplifie les gouttelettes.

Pour la lecture des gouttelettes, après l’amplification, transférer la plaque de 96 puits à cycle thermique dans un lecteur de gouttelettes et ouvrir le logiciel d’accompagnement sur un ordinateur connecté au lecteur de gouttelettes. Dans le mode de configuration, sélectionnez Nouveau et double-cliquez sur n’importe quel puits pour ouvrir la boîte de dialogue de l’éditeur de puits. Sélectionnez les puits à lire et réglez l’expérience sur la quantification absolue, supermix sur la PCR numérique en gouttelettes supermix pour les sondes.

Ciblez un type sur le canal 1 inconnu et ciblez deux types sur le canal 2 inconnu. Attribuez les noms d’échantillon en fonction de la disposition de la plaque et cliquez sur Appliquer et OK. Après avoir enregistré le modèle, cliquez sur Exécuter.

Lorsque le logiciel vous y invite, sélectionnez la couleur FAM/HEX. À la fin de l’acquisition des données, retirez la plaque du lecteur. Avant d’analyser les données, vérifiez les données de tous les puits pour obtenir le nombre total de gouttelettes.

Et définissez un seuil pour accepter un nombre minimum de gouttelettes à compter comme résultats positifs ou négatifs. Pour l’analyse des essais recto et duplex, double-cliquez sur le fichier QLP à analyser et sélectionnez Analyser. Utilisez les outils d’amplitude 1D et de seuil d’amplitude 2D pour distinguer les gouttelettes positives et négatives pour chaque puits dans le bon canal, en utilisant le contrôle de modèle de nœud et les échantillons de contrôle positif comme guide.

Ensuite, exportez les résultats sous forme de fichier CSV pour une analyse supplémentaire. Pour un test de mélange de sonde triplex, ouvrez le fichier QLP et sélectionnez les puits à analyser dans l’onglet éditeur de plaques. Définissez le type d’expérience sur la quantification directe et le test sur sonde mélange triplex, puis entrez le nom de la cible.

Cliquez ensuite sur Appliquer. Utilisez les outils graphiques pour attribuer des couleurs spécifiques à différents clusters cibles, comme indiqué par les suggestions contextuelles de la fenêtre Sélectionner pour affecter un cluster. Lorsque toutes les couleurs cibles ont été attribuées, les données de quantification seront affichées dans la fenêtre des données du puits.

Exportez les données sous forme de fichier CSV pour une analyse en aval. Pour un test quadruplex, définissez le type d’expérience sur la quantification directe et le test sur le multiplex d’amplitude. Entrez le nom de la cible et cliquez sur Appliquer.

Utilisez les outils graphiques pour attribuer des couleurs spécifiques à différents clusters cibles, comme indiqué par les suggestions contextuelles de la fenêtre Sélectionner pour affecter un cluster. Lorsque toutes les couleurs cibles ont été attribuées, les données de quantification seront affichées dans la fenêtre des données du puits. Exportez les données sous forme de fichier CSV pour une analyse supplémentaire.

Comme on l’a observé dans cette analyse représentative du gradient de température, des températures d’agenouillement plus élevées n’ont pas permis de distinguer clairement les gouttelettes positives des gouttelettes négatives lorsqu’un essai duplex a été effectué. Cependant, avec une diminution de la température à genoux, une séparation optimale entre les gouttelettes positives et négatives a été obtenue. À l’aide d’un système de détection numérique par PCR de gouttelettes RT à deux couleurs, il est possible de détecter une, deux, trois et quatre cibles SARS-CoV-2 dans un seul échantillon.

Un échantillon de contrôle sans gabarit peut être utilisé pour localiser les gouttelettes négatives afin d’aider à définir le seuil négatif dans les tests simplex. Dans les tests duplex, l’analyse peut être effectuée dans des canaux individuels ou dans l’amplitude 2D. Bien que l’analyse des données des essais multiplex d’ordre supérieur ne soit pas simple, ces essais sont utiles, car ils permettent d’évaluer jusqu’à huit grappes de gouttelettes dans les essais de mélange de sondes triplex et jusqu’à 16 grappes de gouttelettes pour les essais basés sur l’amplitude quadruplex.

Selon le dosage à développer, assurez-vous que les concentrations correctes de l’amorce cible et de la sonde sont ajoutées au mélange principal. En utilisant cette procédure, on peut alterner les cibles pour développer de nouveaux tests RT-ddPCR. Ces tests peuvent être utilisés à différentes fins de recherche ou pour le diagnostic de maladies infectieuses émergentes.

Depuis son développement, cette technique a été utilisée pour la détermination précise des copies d’acides nucléiques viraux dans différentes normes, le corps humain et les échantillons environnementaux.