Visualisation de la morphogenèse oculaire par microscopie Lightsheet à l’aide de rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Notre protocole fournit des informations visuelles et en temps réel sur la façon dont le processus de morphogenèse oculaire se produit dans des conditions normales et pathologiques. Notre protocole permet l’acquisition rapide de z-stacks, ce qui réduit le temps entre chaque image 3D dans l’ensemble de données. Cela fournit une résolution temporelle accrue de la façon dont la morphogenèse oculaire se produit.

Le positionnement de l’embryon dans le capillaire peut être difficile en raison de sa forme sphérique au stade de somite unique, il est donc important de charger plusieurs embryons dans le capillaire pour s’assurer qu’au moins un est dans la bonne orientation. Pour dépister la présence de somites 10 heures après la fécondation, placez les embryons sous un stéréomicroscope et utilisez un adaptateur de fluorescence pour confirmer la présence du transgène rx3:GFP. Une fois que trois à cinq embryons de somite uniques positifs à la GFP ont été identifiés, utilisez une pince fine pour décorionner les embryons.

Pour intégrer les embryons dans l’agarose, transférez les embryons dans un tube microcentrifuge contenant 500 microlitres de tampon embryonnaire E3 complété par 168 microgrammes par millilitre de tricaïne et ajoutez 500 microlitres d’agarose refroidie mais liquide à 2% à basse température de fusion et de tampon E3 au tube avec un mélange doux. Utilisez un capillaire en verre d’un millimètre avec un piston en PTFE pour tirer les embryons incorporés dans l’agarose dans le capillaire et laissez l’agarose se solidifier pendant 30 à 60 secondes à température ambiante. Placez ensuite le capillaire dans un bécher de tampon E3 supplémenté en tricaïne.

Pour configurer un microscope à feuille de lumière pour l’imagerie embryonnaire, placez le capillaire dans le porte-échantillon capillaire et cliquez sur la gaine métallique au centre du disque métallique du support. Placez deux bouchons en caoutchouc dans la gaine avec les fentes orientées vers les extrémités de la gaine et faites glisser le capillaire au milieu des bouchons en caoutchouc. Une fois que le marqueur est à la base de la gaine métallique, utilisez le capuchon métallique pour fixer le capillaire en place et placez le support sur le dessus du microscope avec les marques blanches alignées.

Fermez le couvercle du porte-échantillon et cliquez sur le bouton Localiser le capillaire dans l’interface du logiciel de microscope. À l’aide du panneau de commande Ergo Drive, déplacez le capillaire juste au-dessus de l’objectif. Après avoir ouvert le couvercle, poussez doucement le piston jusqu’à ce que la section d’agarose contenant l’embryon soit suspendue sous le fond capillaire devant l’objectif.

Désactivez localiser le capillaire et cliquez sur Localiser l’échantillon pour basculer la vue de la webcam de la chambre d’échantillonnage vers l’objectif du microscope et utilisez cette vue pour ajuster la position de l’échantillon plus précisément. Désactivez ensuite l’échantillon de localisation et passez à l’onglet d’acquisition. Cochez les cases z-stack et série chronologique.

Dans la fenêtre des paramètres du mode d’acquisition, sélectionnez le paramètre de feuille lumineuse double face et cochez les cases pour la fusion double face en ligne et la numérisation pivotante. Cliquez en continu pour obtenir une vue en direct de l’embryon. Dans la fenêtre du canal, sélectionnez 488 canaux et réglez la puissance laser sur un et le temps d’exposition sur 7,5 millisecondes.

Utilisez le panneau de commande Ergo Drive pour régler la position de l’embryon jusqu’à ce que le champ oculaire soit directement face à la caméra et ajustez les feuilles lumineuses gauche et droite dans les paramètres des canaux jusqu’à ce que le champ oculaire soit suffisamment mis au point. Réglez la première et la dernière position z à environ 500 micromètres au-delà du dernier signal fluorescent détectable et cliquez sur optimal pour régler la taille du pas à 0,477 micromètre. Pour définir les paramètres d’incubation, cochez la case de l’unité Peltier pour maintenir la température à 28 degrés Celsius.

Dans la fenêtre de la série chronologique, sélectionnez la fréquence expérimentale et l’intervalle de temps appropriés pour acquérir les images. Cliquez sur Démarrer l’expérience. Sélectionnez le dossier dans lequel enregistrer le jeu d’images et définissez le préfixe de l’image, puis cliquez sur Enregistrer pour démarrer la création d’images.

Pour l’analyse d’image, importez les fichiers image dans un logiciel d’analyse d’image 4D approprié et cliquez sur le cube de visionneuse 4D, la barre d’échelle et l’icône vidéo pour ouvrir la barre des tâches du storyboard. Sélectionnez Ajouter une séquence d’images clés et spécifiez la durée de la vidéo en secondes. Décochez la case Créer une rotation et cochez utiliser la progression du temps pour inclure des points temporels spécifiques dans la vidéo.

Enregistrez le storyboard pour appliquer les mêmes paramètres à plusieurs jeux d’images. Cliquez sur Exporter le film pour enregistrer une vidéo de l’imagerie timelapse et spécifiez les paramètres d’exportation du film, y compris le nom et l’emplacement du fichier, le format vidéo, la résolution vidéo, la fréquence d’images et la résolution des données. Ajoutez des horodatages si vous le souhaitez et sélectionnez Enregistrer.

Pour créer des vidéos de rotation à des points temporels spécifiques, ajoutez une séquence d’images clés comme cela vient d’être démontré, mais cochez la case Créer une rotation et décochez la case Utiliser la progression du temps. Pour afficher une image haute résolution à n’importe quelle orientation et à n’importe quel point temporel individuel, sélectionnez l’icône de la caméra dans la visionneuse 4D. Pour créer un pipeline à des fins d’analyse, sélectionnez flask pour accéder au panneau d’analyse et ouvrez le menu Opérations d’analyse pour sélectionner la séquence d’opérations d’intérêt.

Cliquez sur le triangle bleu pour lancer le pipeline. À la fin de l’exécution, cliquez sur les colonnes de fonctionnalités dans la fenêtre contextuelle pour afficher la liste des fonctionnalités pouvant fournir des informations sur l’objet d’intérêt, puis cliquez sur Exporter pour exporter les données vers une feuille de calcul. Dans cette analyse représentative, un embryon transgénique rx3:GFP a été imagé du point de vue dorsal toutes les cinq minutes à partir du stade de somite jusqu’à 24 heures après la fécondation pour un total de 14 heures.

Comme on l’a observé, l’exécution d’un pipeline des images capturées à partir de cette analyse a facilité la génération d’un masque de l’œil en développement. Notez que lorsque le champ oculaire est séparé en deux vésicules optiques, une troisième région rx3:GFP positive dans le cerveau antérieur qui a contribué à l’hypothalamus a pu être observée. Cette information a également été observée dans les données de volume et peut être facilement séparée des données de la vésicule optique car elle était beaucoup plus petite en volume que celle observée pour l’une ou l’autre vésicule optique.

Cette procédure peut être suivie d’analyses supplémentaires, par exemple, le suivi de cellules individuelles dans l’ensemble de données d’images.