Name: Induction dirigée d’organoïdes rétiniens à partir de cellules souches pluripotentes humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Découvrez un protocole optimisé pour générer des organoïdes rétiniens à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Cette méthode améliore le rendement des précurseurs de photorécepteurs pour la modélisation de maladies rétiniennes et le criblage de médicaments.

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Nous remercions les membres du laboratoire 502 pour leur soutien technique et leurs commentaires utiles concernant le manuscrit. Ce travail a été en partie soutenu par la Fondation municipale des sciences naturelles de Beijing (Z200014) et le National Key R&D Program of China (2017YFA0105300).

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique institutionnel de l’hôpital Tongren de Beijing et de la Capital Medical University. Les CSEh H9 ont été obtenues auprès du WiCell Research Institute et génétiquement modifiées sur une lignée cellulaire marquée par tdTomato.
1. Génération d’OI humaines
<ol><li>Culture des CSEh dans des conditions sans mangeoire.<ol><li>Enduire un puits d’une plaque à 6 puits de 1 mL de 0,1 mg/mL du réactif A (tableau des matières) à 37 °C pendant au moins une demi-heure en suivant les instructions du fabricant. Décongeler une partie aliquote de 1x106 CSEh. REMARQUE : Préparer 3 mL de réactif B préchauffé (Table des matières) et transférer les cellules cryoconservées (1 mL) dans 3 mL de milieu frais. Ne pipetez pas les CSEh sur des cellules individuelles.</li>
		<li>Centrifuger à 200 x g pendant 5 min et retirer le surnageant.</li>
		<li>Ensemencer les cellules dans la plaque recouverte de réactif A avec 2 mL de réactif B et changer 2 mL de réactif B par jour. Cellules de passage lorsqu’elles atteignent environ 80% de confluence (généralement autour de 4 jours).</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 0<ol><li>Dissocier les CSEh en une suspension unicellulaire en utilisant le milieu I (tableau 1). Préparer le milieu I en mélangeant les éléments suivants : 20 % (v/v) de remplacement du sérum knockOut (KSR), 0,1 mM de solution d’acides aminés non essentiels MEM (NEAA), 1 mM de pyruvate, 3 μM d’IWR-1-endo (IWR1e), 30 ng/mL de COCO, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine (PS), 0,1 mM de β-mercaptoéthanol et le milieu essentiel minimal (GMEM) Eagle’s de Glasgow. REMARQUE : Avant le début de la dissociation, préparer le milieu I et transférer 12 mL de milieu I avec 20 μM Y-27632 dans une boîte de Petri de 10 cm, 500 μL de réactif C (Table des matières) contenant 0,05 mg/mL de réactif D (Table des matériaux) et 20 μM Y-27632 dans un tube de 1,5 mL. Effectuez les étapes ci-dessus dans l’obscurité, car le composant IWR1e dans le milieu I est sensible à la lumière.</li>
		<li>Lavez les CSEh avec 1x tampon de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco préchauffé.</li>
		<li>Ajouter le réactif préparé de 500 μL (dans le tube de 1,5 mL) et incuber les CSEh pendant 3,5 min à 37 °C et 5 % de CO2.</li>
		<li>Détacher les cellules en remuant le côté et le fond de la plaque pendant quelques secondes et ajouter 500 μL de milieu I préparé de la boîte de Petri dans la plaque de CSEh. REMARQUE: Préparez un tube de 1,5 mL avec 900 μL de 1x DPBS et utilisez un hémocytomètre pour le comptage cellulaire.</li>
		<li>Récoltez les cellules dans un nouveau tube de 1,5 mL et pipettez la suspension cellulaire de haut en bas, puis retirez 100 μL du tube, puis ajoutez dans le tube 900 μL de DPBS pour le comptage cellulaire.</li>
		<li>Disperser la suspension cellulaire gauche de 900 μL, puis diluer les cellules avec le milieu I préparé dans la boîte de Petri à 9 x 104 cellules/mL. REMARQUE : Le volume total du milieu est de 12 mL; 1,08 x 106 cellules sont nécessaires au total.</li>
		<li>Ajouter 100 μL de suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque non adhérente à fond en V de 96 puits (Tableau des matériaux). REMARQUE: Utilisez une pipette multicanal pour raccourcir le temps et vous assurer que chaque puits contient un numéro de cellule équivalent. Secouez la boîte de Petri à chaque fois avant de retirer les portions de 100 μL. Il est important que les cellules soient uniformément réparties.</li>
		<li>Faire tourner légèrement la plaque de 96 puits dans un agitateur à basse vitesse pendant 5 minutes, puis incuber à 37 °C et 5 % de CO2. REMARQUE: Gardez la plaque dans l’obscurité. Définissez le jour comme jour 0.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 2<ol><li>Ajouter 1% de réactif A (Tableau des matériaux). Préparer le réactif A (concentration de protéines de 10 mg/mL) en ajoutant 133,4 μL de réactif A dans 2 mL de milieu I. NOTE: Maintenir le réactif A à 4 ° C pendant une nuit avant utilisation pour obtenir une fusion complète et uniforme. Veuillez noter les informations sur le produit et rechercher le numéro de catalogue et le numéro de lot sur le site officiel de la société pour avoir la concentration en protéines du réactif A car chaque bouteille de réactif A est à une concentration de protéine différente. Si la concentration en protéines est faible, un volume accru de réactif A serait utile.</li>
		<li>Ajouter 20 μL de réactif A préparé à chaque puits et pipeter deux fois au centre pour disperser les cellules mortes. REMARQUE : Entretenez le réactif A et la plaque de 96 puits dans des conditions fraîches et suivez toutes les étapes sur la glace. Placez l’assiette dans l’obscurité.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 2-12<ol><li>Nettoyez le fond de la plaque de 96 puits et incuber à 37 °C et 5 % de CO2 jusqu’au jour 6. Au jour 6, changer la moitié du milieu en retirant 58 μL du milieu de chaque puits et en ajoutant 60 μL de milieu I. REMARQUE: Utilisez une pipette multicanal pour effectuer le changement de demi-moyen. Effectuez cette étape avec douceur pour vous assurer qu’aucune pastille de cellule n’est retirée du puits. Aspirer le milieu dans une boîte de Petri propre de 10 cm. S’il y a des pastilles de cellules à l’intérieur, ajoutez-les à la plaque de 96 puits.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 12- 18<ol><li>Changez le milieu à moyen II (tableau 1) au jour 12. Préparer le milieu II en utilisant le réactif A à 1 % (v/v) en mélangeant les éléments suivants : sérum fœtal bovin à 10 % (FBS), 0,1 mM de NEAA, 1 mM de pyruvate, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,1 mM de β-mercaptoéthanol, 100 nM de dichlorhydrate de SAG et GMEM. Conservez-le dans des conditions fraîches et sombres.</li>
		<li>Récolter les granulés cellulaires dans un tube conique de 15 ml de la plaque de 96 puits et laisser les granulés se déposer naturellement pendant 5 minutes à température ambiante. REMARQUE: Retirez le milieu et les granulés doucement sous la surface pour éviter les bulles.</li>
		<li>Retirez le surnageant tout en prenant soin des organoïdes. Transférer les agrégats cellulaires dans une capsule de suspension de 10 cm contenant 18 mL de milieu II préparé avec le réactif A. NOTE: Ne pas ajouter le milieu II préparé dans la capsule de 10 cm à l’avance, car le réactif A doit être à 4 °C.</li>
		<li>Incuber à 37 °C et 5% de CO2 jusqu’au jour 18.</li>
	</ol></li>
	<li>À partir du jour 18<ol><li>Remplacez le moyen par le moyen III (tableau 1). Préparer le milieu III dans des conditions sombres en mélangeant les éléments suivants : 10 % de FBS, 1xsupplément 1, 0,5 μM d’acide rétinoïque (PR), 100 μM de taurine, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine et 1:1 de mélange de milieu aigle modifié (DMEM)/mélange nutritif F-12 de Dulbecco.</li>
		<li>Le jour 18, lorsqu’une vésicule optique semi-transparente est générée, coupez les organoïdes à l’aide d’un couteau microchirurgical. NOTE: Fendre l’organoïde, généralement en quatre morceaux, dans une boîte de Pétri avec le milieu II. Chaque pièce devrait devenir une coupe optique intacte dans les semaines suivantes.</li>
		<li>Agrégez tous les granulés au centre du plat. Récoltez les cellules dans un tube conique de faucon de 15 ml et laissez la décantation naturelle. Retirez ensuite délicatement le surnageant. REMARQUE: En raison de leur taille, les organoïdes peuvent être agrégés au centre en faisant pivoter la boîte de Petri dans une direction sur 90 ° sur un plan horizontal plusieurs fois.</li>
		<li>Suspendre et disperser les granulés dans deux boîtes de Petri de 10 cm, avec 18 ml de milieu III par boîte, et transférer doucement les boîtes dans l’incubateur pour éviter l’agrégation cellulaire. Poursuivre la culture dans le milieu III à 37 °C et 5% de CO2 et changer le milieu chaque semaine. Le CRX exprimé après le jour 45 et jusqu’au jour 120, nous avons pu détecter le segment externe du photorécepteur.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Analyse des RO humaines
<ol><li>Analyse FACS<ol><li>Assembler trois organoïdes CRX-tdTomato et trois organoïdes dérivés de H9 ES à partir des plats en utilisant les embouts coupés de 1 mL. Laver les organoïdes avec 1 mL de DPBS préchauffé (température ambiante).</li>
		<li>Préparer le tampon de digestion en mélangeant une solution de trypsine-EDTA à 0,25 % avec 0,05 mg/mL de réactif D.</li>
		<li>Dissocier les organoïdes en cellules individuelles en utilisant le tampon de digestion préparé pendant 8 min à 37 °C. Ajoutez ensuite le même volume de DPBS avec 10% FBS et 0,05 mg / mL de réactif D pour inactiver la réaction.</li>
		<li>Suspendre et disperser légèrement les cellules, puis filtrer à l’aide d’une crépine cellulaire de 100 μm et utiliser un système de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) à la ligne laser d’excitation de 561 nm et au filtre 780/60 pour analyser les signaux positifs CRX-tdTomato. NOTE: CRX s’exprime initialement au jour 45 et augmente avec la maturation des organoïdes. Dix mille cellules sont utilisées pour chaque test, pour chaque point temporel, au moins trois répétitions sont effectuées.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantification de l’intensité de fluorescence des OI<ol><li>Préparer les organoïdes viables au hasard pour l’imagerie. REMARQUE: Définissez les paramètres et utilisez les mêmes filtres et paramètres pour tous les moniteurs d’intensité de fluorescence.</li>
		<li>Capturez des images et analysez l’intensité moyenne de fluorescence à l’aide d’un logiciel approprié (p. ex., ImageJ).</li>
		<li>Importez les images, puis convertissez-les en 8 bits à l’aide d’Image | Type.</li>
		<li>Ajustez le seuil à l’aide des paramètres par défaut par Image | Ajuster | Seuil.</li>
		<li>Déterminez la zone mesurée, puis évaluez la valeur de gris à l’aide de l’option Analyser | Mesurer. NOTE: Les valeurs moyennes dans le panneau de résultats sont l’intensité de fluorescence moyenne de la zone mesurée.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Xie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+analysis+reveals+regulatory+dynamics+of+developing+human+retina+and+hiPSC-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids.</a> Science Advances. 6 (6), 5247(2020).</li>
<li>Lu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Analysis+of+Human+Retina+Identifies+Evolutionarily+Conserved+and+Species-Specific+Mechanisms+Controlling+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development.</a> Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).</li>
<li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Types+of+the+Human+Retina+and+Its+Organoids+at+Single-Cell+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li>
<li>Jin, Z. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stemming+retinal+regeneration+with+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li>
<li>Pan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COCO+enhances+the+efficiency+of+photoreceptor+precursor+differentiation+in+early+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366(2020).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+cone+photoreceptors+through+simultaneous+inhibition+of+BMP%2C+TGFbeta+and+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling.</a> Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).</li>
<li>Deng, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Correction+Reverses+Ciliopathy+and+Photoreceptor+Loss+in+iPSC-Derived+Retinal+Organoids+from+Retinitis+Pigmentosa+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).</li>
<li>Gao, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-Specific+Retinal+Organoids+Recapitulate+Disease+Features+of+Late-Onset+Retinitis+Pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128(2020).</li>
<li>Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+road+to+restore+vision+with+photoreceptor+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The road to restore vision with photoreceptor regeneration.</a> Experimental Eye Research. 202, 108283(2020).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li>
<li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communications. 6, 6286(2015).</li>
</ol>

La différenciation organoïde rétinienne est une méthode souhaitable pour la génération de cellules rétiniennes fonctionnelles amples. L’OI est un composite de différentes cellules rétiniennes, telles que les cellules ganglionnaires, les cellules bipolaires et les photorécepteurs, générés par les cellules souches pluripotentes vers la rétine neurale 4,5,8,9. Bien que les OI confluentes puissent ...

Les cellules souches pluripotentes (CSP) se caractérisent par leur auto-renouvellement et leur capacité à se différencier en toutes sortes de cellules somatiques. Ainsi, les organoïdes dérivés des CSP sont devenus une ressource importante dans la recherche en médecine régénérative. La dégénérescence rétinienne est caractérisée par la perte de photorécepteurs (bâtonnets et cônes) et de pigment rétinien épithélium. Le remplacement des cellules rétiniennes pourrait être un traitement encourageant pour cette maladie. Cependant, il n’est pas possible d’obtenir des rétines humaines pour la recherche et le traitement des maladies. Par conséquent, les organoïdes rétiniens (RO) dérivés des CSP, qui récapitulent efficacement et avec succès les cellules rétiniennes natives multicouches, sont bénéfiques pour la recherche fondamentale et translationnelle 1,2,3. Nos recherches portent sur la différenciation de l’OI afin de fournir des cellules suffisantes et de qualité pour étudier la dégénérescence rétinienne4.
Les méthodes de différenciation des OI émergent continuellement, avec la différenciation tridimensionnelle (3D) des suspensions mise au point par le laboratoire Sasai en 20125. Nous avons introduit le marqueur CRX-tdTomato dans les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) pour suivre spécifiquement les cellules précurseurs des photorécepteurs et modifié la méthode avec l’ajout de COCO, un antagoniste multifonctionnel des voies Wnt, TGF-β et BMP6. Il a été démontré que COCO améliore efficacement l’efficacité de différenciation des précurseurs et cônes de photorécepteurs 6,7.
Dans l’ensemble, en modifiant la méthode classique de différenciation, nous avons développé un protocole accessible pour récolter des précurseurs et des cônes de photorécepteurs abondants à partir d’OI humaines pour analyser la maladie rétinienne associée aux photorécepteurs par des investigations en laboratoire et pour une application clinique / transplantation ultérieure.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>COCO</td><td>R& D Systems</td><td>3047-CC-050</td><td>Domaine DAN Famille d’antagonistes BMP DEM</td></tr><tr><td>/F-12</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>C141905005BT</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS), qualifié pour les cellules souches embryonnaires humaines</td><td>Industrie biologique</td><td>04-002-1A</td><td></td></tr><tr><td>GMEM</td><td>Gibco</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement-Multi-Species</td><td>Gibco</td><td>A3181502</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100X)</td><td>sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Primesurface 96 V-plate</td><td>Sbio</td><td>MS9096SZ</td><td>Agrégation cellulaire dans 1.2.7</td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Réactif A</td><td>BD</td><td>356231</td><td>Matrigel dans 1.1.1</td></tr><tr><td>Réactif B</td><td>StemCell</td><td>5990</td><td>mTeSR- E8 , PSCs milieu basal dans 1.1.2</td></tr><tr><td>Réactif C</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>TrypLE Express dans 1.2</td></tr><tr><td>Réactif D</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td>DNase I , dans 1.2</td></tr><tr><td>Acide rétinoïque</td><td>Sigma</td><td>R2625-100MG</td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>Enzo Life Science</td><td>ALX-270-426-M001</td><td></td></tr><tr><td>Supplément 1</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>N-2 Supplément (100X), Liquide, supplemet in medum III</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>dissociation des organoïdes en 2.1.3</td></tr><tr><td>Wnt Antagoniste I, IWR-1-endo - Calbiochem</td><td>Sigma</td><td>681669</td><td>Wnt inhibiteur</td></tr><tr><td>Y-27632 2HCl</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

induction dirigée d’organoïdes rétiniens à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

La transplantation de cellules rétiniennes est une approche thérapeutique prometteuse, qui pourrait restaurer l’architecture rétinienne et stabiliser ou même améliorer les capacités visuelles de la rétine dégénérée. Néanmoins, les progrès dans la thérapie de remplacement cellulaire se heurtent actuellement aux défis de la nécessité d’une source standard de rétines humaines standardisées et de haute qualité. Par conséquent, un protocole facile et stable est nécessaire pour les expériences. Ici, nous développons un protocole optimisé, basé sur une méthode d’auto-organisation avec l’utilisation de molécules exogènes et de réactif A ainsi que l’excision manuelle pour générer les organoïdes tridimensionnels de la rétine humaine (RO). L’OI dérivée des cellules souches pluripotentes humaines (CSP) exprime des marqueurs spécifiques pour les photorécepteurs. Avec l’ajout de COCO, un antagoniste multifonctionnel, l’efficacité de différenciation des précurseurs et des cônes photorécepteurs est considérablement augmentée. L’utilisation efficace de ce système, qui présente les avantages des lignées cellulaires et des cellules primaires, et sans les problèmes d’approvisionnement associés à ces dernières, pourrait produire des cellules rétiniennes confluentes, en particulier des photorécepteurs. Ainsi, la différenciation des CSP en OI fournit une plate-forme optimale et biopertinente pour la modélisation des maladies, le dépistage de médicaments et la transplantation cellulaire.

L’illustration schématique illustre le protocole de différenciation pour améliorer les cellules précurseurs avec COCO (Figure 1). Des PSC aux RO, de nombreux détails peuvent entraîner des variations de résultats. Il est recommandé d’enregistrer chaque étape et même le numéro de catalogue et le numéro de lot de chaque support pour suivre l’ensemble de la procédure.
Ici, nous fournissons des images en champ clair pour les jours 6, 12, 18 et 45 (...

En utilisant une méthode d’auto-organisation, nous développons un protocole avec l’ajout de COCO qui pourrait augmenter considérablement la génération de photorécepteurs.

Induction dirigée d’organoïdes rétiniens à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Retinal cell transplantation is a promising therapeutic approach, which could restore the retinal architecture and stabilize or even improve the visual ...

Il s’agit d’un modèle pour la maladie de la rétine et émule la rétine in vivo. Dans une certaine mesure, il pourrait remplacer les expériences sur les animaux. Le protocole est optimisé pour la qualité et la quantité des précurseurs du photorécepteur dans les organoïdes rétiniens, et le photorécepteur est la clé de plusieurs conditions de cécité irréversibles.Commencez par cultiver les cellules souches embryonnaires humaines, ou CSEh, dans des conditions sans alimentation. Pour ce faire, enduisez un puits d’une plaque de six puits avec un millilitre de 100 microgrammes par millilitre de réactif A et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant au moins une demi-heure. Décongeler une partie aliquote d’un million de CSEh et la centrifuger à 200 xg pendant cinq minutes.Après avoir retiré le surnageant, ensemencer les cellules dans la plaque préalablement enrobée, avec deux millilitres de réactif B.Passage des cellules après avoir atteint environ 80% de confluence à environ quatre jours. Après avoir atteint la confluence, lavez les cellules avec du DPBS préchauffé et transférez-les dans 500 microlitres de réactif fraîchement préparé. Ensuite, incuber les cellules pendant 3,5 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Détachez les cellules en agitant le côté et le bas de la plaque pendant quelques secondes et ajoutez 500 microlitres de milieu préparé. Récoltez les cellules détachées dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et pipeter la suspension cellulaire de haut en bas. Pour le comptage cellulaire, ajoutez 100 microlitres de suspension cellulaire à 900 microlitres de DPBS.Diluer les 900 microlitres de la suspension cellulaire restante avec un milieu dans la boîte de Petri pour obtenir neuf fois 10 à la quatrième cellule de puissance par millilitre. Ajouter 100 microlitres de suspension cellulaire diluée à chaque puits d’une plaque non adhérente à fond en V de 96 puits. Faites tourner légèrement la plaque sur un agitateur à basse vitesse pendant cinq minutes et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone jusqu’au deuxième jour.Le deuxième jour, ajoutez 20 microlitres de réactif A à 1% dans chaque puits de la plaque de 96 puits, et pipette deux fois au centre pour disperser les cellules mortes. Nettoyez le fond de la plaque avant de l’incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone jusqu’au sixième jour. Le sixième jour, remplacez 58 microlitres du milieu par 60 microlitres de milieu frais et poursuivez l’incubation.Le jour 12, récoltez les granulés cellulaires de la plaque de 96 puits dans un tube conique de 15 millilitres et laissez les granulés se déposer naturellement pendant cinq minutes à température ambiante. Lorsque les granulés se déposent, retirez le surnageant sans déranger les organoïdes et transférez les agrégats cellulaires dans une capsule en suspension de 10 centimètres contenant 18 millilitres de milieu deux avec le réactif A.Incuber la capsule à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone jusqu’au jour 18. Le jour 18, confirmez la génération d’une vésicule optique semi-transparente dans le plat et coupez les organoïdes générés à l’aide d’un couteau microchirurgical.Agrégez toutes les pastilles coupées au centre du plat. Ensuite, récoltez les cellules dans un tube conique Falcon de 15 millilitres. Lorsque les cellules se déposent, retirez doucement le surnageant et remettez les granulés en suspension dans deux boîtes de Petri de 10 centimètres avec 18 millilitres de moyenne, trois par boîte.Transférer délicatement les plats dans l’incubateur pour éviter l’agrégation cellulaire. Continuez à cultiver les cellules, en changeant le milieu chaque semaine. Analysez l’expression CRX après le jour 45 jusqu’au jour 120.Dans cette analyse représentative, différentes étapes de la génération rétinienne humaine sont affichées. Le sixième jour, les organoïdes sont apparus comme un agrégat de connexions denses à l’intérieur d’un bord brillant d’un diamètre d’environ 600 micromètres. Le jour 12, la génération initiale des structures optiques en forme de vésicules a eu lieu.Les organoïdes sans architecture appropriée en forme de vésicule ont été jetés avant d’être cultivés dans une boîte de Petri le jour 18. Au jour 30 de la culture, l’architecture en forme de vésicule était plus évidente et les RO inférieurs pouvaient être facilement distingués et supprimés. À partir du jour 45, les organoïdes ont exprimé divers marqueurs de précurseurs de photorécepteurs, tels que CRX, RCVRN et OTX2.En clivant les organoïdes rétiniens supérieurs, l’efficacité de la différenciation est considérablement améliorée et plus de 100 organoïdes supérieurs de 96 plaques ont pu être récoltés.

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