Induction dirigée d’organoïdes rétiniens à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Il s’agit d’un modèle pour la maladie de la rétine et émule la rétine in vivo. Dans une certaine mesure, il pourrait remplacer les expériences sur les animaux. Le protocole est optimisé pour la qualité et la quantité des précurseurs du photorécepteur dans les organoïdes rétiniens, et le photorécepteur est la clé de plusieurs conditions de cécité irréversibles.

Commencez par cultiver les cellules souches embryonnaires humaines, ou CSEh, dans des conditions sans alimentation. Pour ce faire, enduisez un puits d’une plaque de six puits avec un millilitre de 100 microgrammes par millilitre de réactif A et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant au moins une demi-heure. Décongeler une partie aliquote d’un million de CSEh et la centrifuger à 200 xg pendant cinq minutes.

Après avoir retiré le surnageant, ensemencer les cellules dans la plaque préalablement enrobée, avec deux millilitres de réactif B.Passage des cellules après avoir atteint environ 80% de confluence à environ quatre jours. Après avoir atteint la confluence, lavez les cellules avec du DPBS préchauffé et transférez-les dans 500 microlitres de réactif fraîchement préparé. Ensuite, incuber les cellules pendant 3,5 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.

Détachez les cellules en agitant le côté et le bas de la plaque pendant quelques secondes et ajoutez 500 microlitres de milieu préparé. Récoltez les cellules détachées dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et pipeter la suspension cellulaire de haut en bas. Pour le comptage cellulaire, ajoutez 100 microlitres de suspension cellulaire à 900 microlitres de DPBS.

Diluer les 900 microlitres de la suspension cellulaire restante avec un milieu dans la boîte de Petri pour obtenir neuf fois 10 à la quatrième cellule de puissance par millilitre. Ajouter 100 microlitres de suspension cellulaire diluée à chaque puits d’une plaque non adhérente à fond en V de 96 puits. Faites tourner légèrement la plaque sur un agitateur à basse vitesse pendant cinq minutes et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone jusqu’au deuxième jour.

Le deuxième jour, ajoutez 20 microlitres de réactif A à 1% dans chaque puits de la plaque de 96 puits, et pipette deux fois au centre pour disperser les cellules mortes. Nettoyez le fond de la plaque avant de l’incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone jusqu’au sixième jour. Le sixième jour, remplacez 58 microlitres du milieu par 60 microlitres de milieu frais et poursuivez l’incubation.

Le jour 12, récoltez les granulés cellulaires de la plaque de 96 puits dans un tube conique de 15 millilitres et laissez les granulés se déposer naturellement pendant cinq minutes à température ambiante. Lorsque les granulés se déposent, retirez le surnageant sans déranger les organoïdes et transférez les agrégats cellulaires dans une capsule en suspension de 10 centimètres contenant 18 millilitres de milieu deux avec le réactif A.Incuber la capsule à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone jusqu’au jour 18. Le jour 18, confirmez la génération d’une vésicule optique semi-transparente dans le plat et coupez les organoïdes générés à l’aide d’un couteau microchirurgical.

Agrégez toutes les pastilles coupées au centre du plat. Ensuite, récoltez les cellules dans un tube conique Falcon de 15 millilitres. Lorsque les cellules se déposent, retirez doucement le surnageant et remettez les granulés en suspension dans deux boîtes de Petri de 10 centimètres avec 18 millilitres de moyenne, trois par boîte.

Transférer délicatement les plats dans l’incubateur pour éviter l’agrégation cellulaire. Continuez à cultiver les cellules, en changeant le milieu chaque semaine. Analysez l’expression CRX après le jour 45 jusqu’au jour 120.

Dans cette analyse représentative, différentes étapes de la génération rétinienne humaine sont affichées. Le sixième jour, les organoïdes sont apparus comme un agrégat de connexions denses à l’intérieur d’un bord brillant d’un diamètre d’environ 600 micromètres. Le jour 12, la génération initiale des structures optiques en forme de vésicules a eu lieu.

Les organoïdes sans architecture appropriée en forme de vésicule ont été jetés avant d’être cultivés dans une boîte de Petri le jour 18. Au jour 30 de la culture, l’architecture en forme de vésicule était plus évidente et les RO inférieurs pouvaient être facilement distingués et supprimés. À partir du jour 45, les organoïdes ont exprimé divers marqueurs de précurseurs de photorécepteurs, tels que CRX, RCVRN et OTX2.

En clivant les organoïdes rétiniens supérieurs, l’efficacité de la différenciation est considérablement améliorée et plus de 100 organoïdes supérieurs de 96 plaques ont pu être récoltés.