Name: Détermination des classes totales de lipides et de lipides dans les échantillons marins (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 59 s
Description: Découvrez les protocoles d'extraction et d'analyse des lipides marins par TLC-FID pour la recherche écologique et biogéochimique. Cette méthode permet une quantification rapide des classes lipidiques dans l'eau de mer et les échantillons biologiques.

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Cette recherche a été financée par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CNSR) numéro 105379 à C.C. Parrish. Le réseau CREAIT (Core Research Equipment & Instrument Training) de l’Université Memorial a contribué au financement de cette publication.

REMARQUE: Pour nettoyer la verrerie, les instruments et les filtres pour les analyses lipidiques, lavez-les 3 fois avec du méthanol suivi de 3 lavages au chloroforme, ou chauffez-les à 450 ° C pendant au moins 8 heures.
1. Procédure de filtration de l’eau de mer dissoute et des lipides particulaires
REMARQUE: La fraction particulière d’intérêt est définie sur le plan opérationnel par la procédure de filtration. Dans ce cas, la taille des pores est de 1,2 μm.
<ol><li>Installez le collecteur de filtration sans filtre et rincez l’installation avec de l’eau de mer filtrée.</li>
	<li>À l’aide de pinces propres, placez un filtre en fibre de verre (GF / C) de 47 mm, qui a été lavé, dans le système de filtration propre.</li>
	<li>Prenez l’échantillon et faites tourbillonner doucement pour ressuspender tout matériau qui pourrait s’être déposé au fond du récipient de collecte. Mesurez avec précision un volume connu, dans ce cas 1 L, et filtrez-le à travers le filtre. REMARQUE: Le volume dépendra de la quantité de particules dans l’échantillon: généralement entre 250 mL et 5 L selon la saison et l’emplacement.</li>
	<li>Lorsque l’échantillon a été mesuré, mouillez doucement le filtre avec de l’eau de mer filtrée. Ajoutez l’échantillon entier lentement au système de filtration et rincez le cylindre gradué avec de l’eau de mer filtrée pour vous assurer que toutes les particules sont ajoutées au filtre. Rincez l’installation avec de l’eau de mer filtrée sur les côtés pour vous assurer que toutes les particules sont rincées sur le filtre.<ol>
<li>Laissez toute l’eau de mer passer à travers le filtre, mais ne laissez pas le filtre sécher complètement car cela pourrait perturber les cellules du filtre; casser l’aspiration lorsque la dernière de l’eau disparaît.</li>
	</ol>
</li>
	<li>À l’aide de pinces propres et d’une pipette propre, pliez le filtre en deux, puis en tiers, puis en deux dans le sens de la longueur pour rouler le filtre dans un tube. Placez-le dans un flacon en verre propre et étiqueté de 10 mL.</li>
	<li>Couvrir le filtre avec 2 mL de chloroforme. Remplissez l’espace de la tête avec de l’azote et scellez avec du ruban PTFE. Placer dans une grille dans un congélateur à -20 °C. Les échantillons seront stables à cette température jusqu’à un an. REMARQUE: Pour relier les concentrations lipidiques aux concentrations massiques totales, une mesure du poids sec est également nécessaire. Cela implique de mettre un filtre pré-pesé de 24 mm dans une configuration de filtration de poids sec, de remuer l’échantillon et de prélever un petit sous-échantillon qui est filtré sur le petit filtre. Lorsque le filtre est presque sec, environ 10 mL de formiate d’ammonium à 3,5 % sont ajoutés au filtre. Le filtre est plié en deux, retourné dans une boîte de Petri étiquetée et placé dans un congélateur.</li>
</ol>2. Extraction liquide-liquide d’eau de mer ou d’échantillons liquides
<ol><li>
Préparation de l’échantillon
	<ol>
<li>Mesurer un volume connu de filtrat dans un cylindre gradué en verre propre aux lipides. Placez cet échantillon dans un entonnoir séparateur propre de 1 L. Ajoutez ensuite 20 mL de chloroforme à l’échantillon et agitez pendant 2 min, en évavent fréquemment.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Élimination du premier extrait et ajout d’acide après la première séparation
	<ol>
<li>Enveloppez l’entonnoir dans du papier d’aluminium et attendez 5 à 10 minutes pour que la séparation se produise. Retirez le fond de la feuille pour voir les deux couches. Recueillez la couche organique inférieure à travers le robinet d’arrêt dans une fiole à fond rond propre, en prenant soin de ne pas inclure la couche supérieure. Coiuchez la fiole à fond rond sous azote et placez-la au congélateur.</li>
		<li>Ajouter 0,25 mL de H 2 SO4concentré pourchaque litre d’échantillon à l’échantillon dans l’entonnoir séparateur et agiter doucement l’entonnoir.</li>
		<li>Ajouter 10 mL de chloroforme et agiter vigoureusement pendant 2 min tout en évançant fréquemment. Permettez à la séparation d’avoir lieu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Deuxième et troisième séparations
	<ol>
<li>Attendez la séparation et ajoutez la couche inférieure dans la fiole à fond rond.</li>
		<li>Ajouter un troisième 10 mL de chloroforme et agiter pendant 2 minutes, en évavent à nouveau fréquemment. Après la séparation, ajoutez la couche inférieure à la fiole à fond rond.</li>
		<li>Transférer l’extrait dans la fiole à fond rond dans un évaporateur rotatif, évaporer et transférer dans un flacon de 2 mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Protocole d’extraction des solides (extraction modifiée de Folch et al.3)
<ol><li>
Coup monté REMARQUE: La configuration d’extraction nécessite un récipient isolé rempli de glace. Les solvants comprennent le méthanol, l’eau extraite du chloroforme et le chloroforme:méthanol 2:1. Tous les solvants doivent être placés sur de la glace de sorte qu’ils soient froids au moment où les extractions sont commencées. Les échantillons vont également sur la glace, de sorte que tout reste froid.<ol>
<li>Rincez tous les tubes et les bouchons doublés de PTFE 3 fois avec du méthanol, puis 3 fois avec du chloroforme. Un tube de centrifugeuse et un flacon de 15 mL avec un bouchon sont nécessaires pour chaque extraction.</li>
		<li>Placer l’échantillon dans un tube de centrifugeuse contenant 2 mL de chloroforme. La taille de l’échantillon dépend de la quantité de lipides présents, environ 5 à 10 mg de lipides préférés.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Broyage et extraction
	<ol>
<li>Ajouter environ 1 mL de méthanol glacé et broyer rapidement l’échantillon en pâte à l’écheveillement à l’éventreur propre ou à la tige en PTFE/métal.</li>
		<li>Lavez la tige dans le tube avec environ 1 mL de chloroforme glacé 2:1 : méthanol, puis avec 1/2 mL d’eau glacée extraite du chloroforme. Si nécessaire, utilisez un ensemble propre de pinces pour forcer les particules à retourner dans le flacon avant de les laver. Coiuchez le tube et soniquez le mélange pendant 4 minutes dans un bain à ultrasons (35 - 42 kHz).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Double pipetage: Centrifuger l’échantillon pendant 2 min à 1800 × g. Collectez toute la couche organique (couche inférieure) à l’aide de la technique de double pipetage dans laquelle une pipette de 5 3/4 « avec l’ampoule lâchement est doucement poussée à travers les deux couches, tout en pressant l’ampoule, provoquant la sortie de bulles.<ol>
<li>Lorsque le bas de la deuxième couche est atteint, utilisez le pouce pour retirer l’ampoule sans dessiner la couche organique dans la pipette. Placez une pipette de 9 po à l’intérieur de celle de 5 3/4 po et retirez la couche inférieure à travers la pipette de 5 3/4 po.</li>
		<li>Placez l’extrait dans un flacon propre. Continuez à enlever la couche inférieure jusqu’à ce qu’elle soit entièrement enlevée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pipettes de lavage: Rincez la pipette de 9 po dans le flacon contenant la couche organique en utilisant 1,5 mL de chloroforme glacé pour laver l’extérieur de la pipette et 1,5 mL pour laver l’intérieur. Tournez doucement cette pipette pendant le lavage et assurez-vous que tout le chloroforme coule dans la pipette dans un flacon.<ol>
<li>Rincez la pipette 5 3/4 » dans le tube contenant la couche aqueuse de la même manière.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sonicate et centrifuger les échantillons et la double pipette lorsqu’ils sont séparés, en utilisant de nouvelles pipettes à chaque fois. Répétez au moins trois fois et remettez en commun toutes les couches organiques. Après avoir retiré la couche organique pour la troisième fois, lavez les deux pipettes dans le flacon contenant la couche organique.</li>
	<li>À l’aide d’un léger flux d’azote, concentrez-vous jusqu’au volume, puis scellez avec du ruban PTFE et conservez-le au congélateur.</li>
</ol>4. Développement de systèmes et d’étapes pour la séparation TLC des classes de lipides marins
<ol><li>
Préparation des tiges pour TLC
	<ol>
<li>Scannez à blanc les tiges dans le scanner FID automatique trois fois</li>
		<li>
Repérage d’un échantillon: Appliquez des échantillons et des étalons avec une seringue sur les tiges à l’origine ou juste en dessous. Distribuer 0,5 μL et toucher la goutte sur la tige. Laisser sécher avant de placer la goutte suivante au même endroit. Repérez tous les échantillons dans une ligne sur des tiges.</li>
		<li>
Mise au point dans l’acétone: Focalisation des échantillons deux fois (trois fois si les échantillons sont très concentrés) dans 70 mL d’acétone. Observez le front du solvant pendant qu’il grimpe sur la tige jusqu’à ce que le bas de la tache fusionne avec le haut. Retirez les tiges, séchez-les pendant environ 5 s, puis répétez la procédure pour produire une bande étroite de matière lipidique près du fond de la tige.</li>
		<li>Sécher et conditionner les tiges dans une chambre à humidité constante pendant 5 min. Une chambre à humidité constante est un dessiccateur avec une solution saturée de chlorure de calcium sous la plaque.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Séquence menant au premier chromatogramme (hydrocarbure à cétone)
	<ol>
<li>
Premier système de développement: Le premier système de développement est hexane:diéthyléther:acide formique, 98.95:1:0.05. Utilisez une seringue pour ajouter l’acide formique, mais rincez d’abord la seringue 3× avec de l’acide formique. Rincez l’acide formique hors de la seringue immédiatement après avec du chloroforme. Utilisez 30 mL du mélange pour mouiller le papier et rincer le réservoir. Jeter la solution de rinçage et ajouter les 70 mL restants dans le réservoir.<ol>
<li>Prenez les supports et abaissez-les doucement dans le réservoir. Observez jusqu’à ce que le front du solvant atteigne les points d’échantillonnage, puis démarrez la minuterie. Après 25 min, retirez les tiges de la chambre de développement, séchez dans la chambre à humidité constante pendant 5 min et redéveloppez-les dans la même solution pendant encore 20 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Séchez les tiges pendant 5 minutes dans le scanner FID automatique, puis numérisez jusqu’au point le plus bas derrière le pic cétique à l’aide d’un balayage PPS de 25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Séquence menant au deuxième chromatogramme (triacylglycérol à diacylglycérol):
	<ol>
<li>Conditionnez les tiges pendant 5 min dans la chambre à humidité constante.</li>
		<li>
Deuxième système de développement: Le deuxième système de développement est hexane:diéthyléther:acide formique, 79:20:1. Ajouter ~30 mL au réservoir de développement pour mouiller le papier et rincer le réservoir. Ensuite, jetez et développez les tiges pendant 40 min dans les 70 mL restants. Pour une meilleure séparation entre les pics TAG (saturés) et TAG (polyinsaturés), utilisez un mélange de 79,9:20:0,1, mais pour la séparation des pics ST et DAG, utilisez un mélange de 79:20:1.</li>
		<li>Sécher et scanner au point le plus bas derrière le pic de diacylglycérol dans un deuxième scan partiel à l’aide d’un scan PPS 11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Séquence menant au troisième chromatogramme (lipide polaire et phospholipide mobile acétone)
	<ol>
<li>Conditionnez les tiges pendant 5 minutes dans la chambre à humidité constante.</li>
		<li>Développer les tiges deux fois pendant 15 minutes dans 70 mL d’acétone. Entre les développements, les tiges sèchent à l’air libre pendant environ 30 secondes.</li>
		<li>Conditionnez les tiges pendant 5 minutes dans la chambre à humidité constante.</li>
		<li>
Troisième système de développement: Le troisième système de développement est un mélange de chloroforme, de méthanol et d’eau extraite du chloroforme, 50:40:10. Développer les bâtonnets deux fois pendant 10 minutes dans 70 mL du mélange. Entre les développements, séchez les tiges à l’air libre pendant environ 30 secondes.</li>
		<li>Sécher et scanner toute la longueur des tiges.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Dérivatisation FAME avec H2SO4 en MeOH
<ol><li>
Fabrication du réactif Hilditch
	<ol>
<li>
Préparation du méthanol: Placer 100 mL de MeOH dans une fiole jaugée propre puis saupoudrer doucement de NaSO4 anhydre jusqu’à ce que le fond de la fiole soit recouvert. Une fois recouvert, inverser deux fois de sorte que toute eau dans le méthanol soit absorbée par le NaSO4. Après l’inversion et le tremblement, laissez-le reposer pendant au moins 5 min.</li>
		<li>
Ajout de l’acide: Décantez lentement le méthanol dans un bocal en verre (le NaSO4 est maintenant un morceau dur dans le fond de la fiole) et leH2SO4 est ajouté. Ajouter lentement 1,5 mL d’acide sulfurique au méthanol à l’aide d’une pipette. Ajouter quelques gouttes à la fois et une fois que tout l’acide a été ajouté, coiuer et remuer doucement pour mélanger. La solution est maintenant prête à être utilisée pour les produits dérivés, mais elle doit être préparée sur une base hebdomadaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fabrication des dérivés
	<ol>
<li>Transférer environ 200 μg de lipides d’un flacon d’extrait dont le volume a été porté à une quantité connue, dans un flacon propre de 15 mL et évaporer sous azote jusqu’à la sécheresse. La quantité retirée sera déterminée par la concentration de l’échantillon de TLC/FID. Utilisez une pipette propre pour retirer l’échantillon.</li>
		<li>Lorsque l’échantillon a séché, ajouter 1,5 mL de dichlorométhane et 3 mL du réactif Hilditch nouvellement fabriqué.</li>
		<li>Vortex l’échantillon et sonique dans un bain à ultrasons pendant 4 minutes pour éliminer les lipides qui ont adhéré au flacon en verre. Remplissez le flacon d’azote, bouchon et scellez-le avec du ruban PTFE et chauffez à 100 °C pendant 1 heure.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Arrêter la réaction
	<ol>
<li>Laissez les échantillons refroidir complètement à la température ambiante pendant 10 minutes après le retrait du four, puis ouvrez soigneusement les flacons.</li>
		<li>Ajouter lentement environ 0,5 mL de solution saturée de bicarbonate de sodium (9 g/100 mL d’eau extraite du chloroforme), puis 1,5 mL d’hexane. Agiter ou vortexer le flacon, puis laisser reposer pour qu’il se sépare en 2 couches.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Collecte des FAME
	<ol>
<li>
Retraitde la couche supérieure : Une fois que la dérivatisation a été arrêtée et qu’il y a une séparation claire, retirez la phase organique supérieure et placez-la dans un flacon lipidique propre de 2 mL.</li>
		<li>Évaporer le solvant dans le flacon de 2 mL à sec et le remplir d’hexane à environ 0,5 mL.</li>
		<li>Remplissez l’espace de tête du flacon avec de l’azote, coiffez et scellez le flacon avec du ruban PTFE, soniquez pendant encore 4 minutes pour suspendre à nouveau les acides gras, puis il est prêt à aller au GC. REMARQUE: Si des concentrations d’acides gras sont nécessaires, la couche aqueuse doit être lavée trois fois avec de l’hexane et toutes les couches organiques regroupées dans le flacon de 2 mL. Cela implique l’ajout de 2 mL d’hexane, le vortex de l’échantillon, la centrifugation et l’élimination de la couche organique, le tout répété 3 fois.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Couturier, L. I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+art+and+best+practices+for+fatty+acid+analysis+in+aquatic+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22ICES+Journal+of+Marine+Science%22%5BJournal%5D)">State of art and best practices for fatty acid analysis in aquatic sciences.</a> ICES Journal of Marine Science. , (2020).</li>
<li>Parrish, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+in+Marine+Ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Lipids in Marine Ecosystems.</a> ISRN Oceanography. , 604045(2013).</li>
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<li>Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+polyunsaturated+and+saturated+lipids+from+marine+phytoplankton+on+silica+gel+coated+Chromarods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Separation of polyunsaturated and saturated lipids from marine phytoplankton on silica gel coated Chromarods.</a> Journal of Chromatography A. 607, 97-104 (1992).</li>
<li>Stevens, C. J., Deibel, D., Parrish, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+bacterial+fatty+acids+and+changes+in+a+wax+ester-based+omnivory+index+during+a+long-term+incubation+experiment+with+Calanus+glacialis+Jaschnov%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Marine+Biology+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Incorporation of bacterial fatty acids and changes in a wax ester-based omnivory index during a long-term incubation experiment with Calanus glacialis Jaschnov.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 303, 135-156 (2004).</li>
<li>Goutx, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+summer+to+autumn+variability+of+dissolved+lipid+classes+in+the+Ligurian+Sea+%28NW+Mediterranean%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeosciences%22%5BJournal%5D)">Short term summer to autumn variability of dissolved lipid classes in the Ligurian Sea (NW Mediterranean).</a> Biogeosciences. 6, 1229-1246 (2009).</li>
<li>Conlan, J. A., Rocker, M. M., Francis, D. S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((comparison+of+two+common+sample+preparation+techniques+for+lipid+and+fatty+acid+analysis+in+three+different+coral+morphotypes+reveals+quantitative+and+qualitative+differences%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">comparison of two common sample preparation techniques for lipid and fatty acid analysis in three different coral morphotypes reveals quantitative and qualitative differences.</a> PeerJ. 5, 3645(2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La rapidité avec laquelle le système TLC-FID fournit des informations synoptiques sur la classe des lipides à partir de petits échantillons fait du TLC-FID un outil capable de filtrer les échantillons marins avant d’entreprendre des procédures analytiques plus complexes. De telles analyses nécessitent généralement la libération de composés constitutifs à partir d’extraits lipidiques et la dérivatisation pour augmenter la volatilité dans le cas de la chromatographie en phase gazeuse. TLC-FID combiné avec GC-FID s’est avér...

Les méthodes décrites ici concernent des substances qui sont définies opérationnellement comme des lipides marins. Cette définition est basée sur leur aptitude à l’extraction liquide-liquide dans des solvants organiques non polaires, et elle fournit une méthode pratique pour leur séparation des autres substances dans une matrice aquatique. Leur nature hydrophobe facilite leur isolement de l’eau de mer ou des spécimens biologiques, ainsi que leur enrichissement et l’élimination des sels et des protéines.
La mesure de la teneur en lipides et de sa composition dans les organismes marins présente un grand intérêt pour l’écologie du réseau trophique, la nutrition aquacole et la science alimentaire depuis des décennies. Les lipides sont des composants universels dans les organismes vivants, agissant comme des molécules essentielles dans les membranes cellulaires, comme des sources majeures d’énergie biodisponible, fournissant une isolation thermique et une flottabilité, et servant de molécules de signalisation. Bien que les procédures de détermination des lipides dans d’autres domaines aient été bien décrites, leur utilisation avec des échantillons marins nécessite généralement des modifications pour s’adapter aux conditions de terrain ainsi qu’au type d’échantillon1.
Pour les échantillons d’eau de mer, la première étape nécessite généralement une séparation en fractions « dissoutes » et « particulaires » définies opérationnellement, normalement par filtration (étape 1 du protocole). La fraction particulaire est ce qui est retenu par le filtre, et la taille des pores est importante dans la définition de la coupure2. Souvent, lorsque nous échantillonnons des particules, nous aimerions établir un lien entre les concentrations lipidiques et les concentrations massiques totales, auquel cas un échantillon distinct et plus petit (p. ex., 10 mL) doit être prélevé à cette fin (étape 1 du Protocole, note). Pour obtenir une détermination précise de la masse, il est important d’ajouter du formiate d’ammonium (35 g/L) à la fin de la filtration.
Le filtrat d’eau de mer de l’échantillon le plus grand doit représenter entre 250 mL et 1 L selon le type d’échantillon et est soumis à une extraction liquide-liquide dans un entonnoir séparateur (étape 2 du protocole). La nature hydrophobe des lipides signifie qu’ils peuvent être séparés des autres composés par extraction dans un solvant non polaire tel que le chloroforme. Un système à deux couches est créé où les lipides se divisent en couche organique tandis que les composants solubles dans l’eau restent dans la couche aqueuse.
Les échantillons de particules sur un filtre, ou les échantillons biologiques sont extraits avec une extraction modifiée de Folch et al.3, impliquant également du chloroforme (étape 3 du protocole). Encore une fois, un système organique / aqueux est créé dans lequel les lipides se divisent en phase organique, tandis que les molécules solubles dans l’eau restent dans la phase aqueuse et que les protéines sont précipitées. En fait, pour les solides, la plupart des laboratoires utilisent une variante de la procédure d’extraction Folch et al.3 impliquant du chloroforme et du méthanol. Pour les filtres, la première étape consiste à homogénéiser en 2 mL de chloroforme et 1 mL de méthanol.
Pendant l’extraction, il faut veiller à protéger les lipides des modifications chimiques ou enzymatiques, en conservant les échantillons et les solvants sur la glace pour réduire l’hydrolyse des liaisons ester ou l’oxydation à double liaison carbone-carbone. Les tissus et les lipides cellulaires sont assez bien protégés par des antioxydants naturels et par compartimentation4; cependant, à la suite de l’homogénéisation des échantillons, le contenu cellulaire est combiné, ce qui rend les lipides plus disposés à l’altération, chimiquement ou enzymatiquement. Certains lipides, comme la plupart des stérols, sont très stables, tandis que d’autres, comme ceux contenant des acides gras polyinsaturés, sont plus sensibles à l’oxydation chimique. D’autres, comme les stérols à doubles liaisons conjuguées, sont sujets à l’oxydation catalysée par la lumière5. Après les extractions, les lipides sont beaucoup plus sensibles à l’oxydation chimique et les échantillons doivent être stockés sous un gaz inerte tel que l’azote. Un doux flux d’azote serait également utilisé pour concentrer les extraits.
Après concentration, les lipides seraient alors normalement quantifiés en vrac car ils constituent un composant important des écosystèmes marins fournissant une forte concentration d’énergie, plus de deux fois le kJ / g de glucides et de protéines. Invariablement, ils seraient ensuite quantifiés en tant que composants individuels: l’analyse complète des lipides implique généralement une séparation en catégories plus simples, en fonction de leur nature chimique. Ainsi, une analyse complète implique de mesurer les lipides totaux, les classes de lipides et les composés individuels.
Le lipide total peut être déterminé en prenant la somme des classes de lipides mesurées individuellement séparées par chromatographie6. Un extrait lipidique marin peut contenir plus d’une douzaine de classes provenant de sources biogéniques et anthropiques. La grande variété de structures lipidiques signifie que beaucoup d’informations peuvent être obtenues en déterminant des groupes individuels de structures. Des classes de lipides individuellement, ou dans certains groupes, ont été utilisées pour signaler la présence de certains types d’organismes, ainsi que leur état physiologique et leur activité2. Ils ont également été utilisés comme indicateur de l’origine des matières organiques, y compris la matière organique dissoute (DOM) ainsi que les contaminants hydrophobes.
Les triacylglycérols, les phospholipides et les stérols font partie des classes de lipides biogéniques les plus importantes. Les deux premiers sont biochimiquement liés car ils possèdent une colonne vertébrale de glycérol à laquelle deux ou trois acides gras sont estérifiés (Figure 1). Les triacylglycérols, ainsi que les esters de cire sont des substances de stockage très importantes, tandis que d’autres classes de lipides contenant des acides gras tels que les diacylglycérols, les acides gras libres et les monoacylglycérols sont généralement des constituants mineurs. Les acides gras libres sont présents à des concentrations plus faibles dans les organismes vivants, car les acides insaturés peuvent être toxiques7. Les stérols (à la fois sous leur forme libre et estérifiée) et les alcools gras sont également inclus parmi les lipides les moins polaires, tandis que les glycolipides et les phospholipides sont des lipides polaires. Les lipides polaires ont un groupe hydrophile, ce qui permet la formation de bicouches lipidiques présentes dans les membranes cellulaires. Les stérols libres sont également des composants structurels membranaires, et lorsqu’ils sont pris en rapport avec les triacylglycérols, ils fournissent une condition ou un indice nutritionnel (TAG: ST) qui a été largement utilisé8. Lorsqu’ils sont pris en rapport aux phospholipides (ST : PL), ils peuvent être utilisés pour indiquer la sensibilité des plantes au sel: des valeurs plus élevées maintiennent l’intégrité structurelle et diminuent la perméabilité membranaire9. L’inverse de ce rapport (PL : ST) a été étudié dans les tissus bivalves lors de l’adaptation à la température10.
Les classes de lipides marins peuvent être séparées par chromatographie sur couche mince (TLC) sur des tiges revêtues de gel de silice (étape 4 du protocole), puis détectées et quantifiées par détection par ionisation de flamme (FID) dans un scanner FID automatique. Le TLC/FID est devenu couramment utilisé pour les échantillons marins car il fournit rapidement des données synoptiques sur les classes lipidiques à partir de petits échantillons et, en prenant la somme de toutes les classes, une valeur pour les lipides totaux. Le TLC/FID a fait l’objet d’une évaluation de l’assurance de la qualité (AQ) et s’est avéré conforme aux normes requises pour un étalonnage externe cohérent, des blancs faibles et une analyse de réplication précise11. Les coefficients de variation (CV) ou les écarts-types relatifs sont d’environ 10 %, et les données lipidiques totales du scanner FID sont normalement d’environ 90 % de celles obtenues par gravimétrie et d’autres méthodes2. La gravimétrie donne des lipides totaux plus élevés probablement parce que le scanner FID ne mesure que des composés non volatils, et aussi à la suite de l’inclusion possible de matériau non lipidique dans les mesures gravimétriques.
Les informations fournies par l’analyse de la classe lipidique sont particulièrement utiles lorsqu’elles sont combinées avec des déterminations d’acides gras en tant qu’individus, ou de stérols, ou les deux en combinaison. La première étape vers ces analyses implique la libération de tous les acides gras constitutifs ainsi que des stérols dans les extraits lipidiques (étape 5 du protocole). La grande variété de structures et de fonctions lipidiques signifie qu’ils ont été largement utilisés dans les études écologiques et biogéochimiques évaluant la santé des écosystèmes et la mesure dans laquelle ils ont été influencés par les apports anthropiques et terrestres. Ils ont été utilisés pour mesurer la biosynthèse de substances ayant une valeur alimentaire pour la faune marine ainsi que pour indiquer la qualité des échantillons d’eau. La mesure des lipides dans les carottes de sédiments aide à montrer la sensibilité des sédiments aux changements dans l’utilisation des terres par l’homme près de la marge terre-mer.
Le principal outil d’identification et de quantification des composés lipidiques individuels est traditionnellement la chromatographie en phase gazeuse (CG) avec FID. Avant l’analyse cependant, ces composés sont rendus plus volatils par la dérivatisation. Les acides gras sont libérés en présence d’un catalyseur acide(H2SO4)à partir de classes de lipides acyliques(Figure 1). En chimie organique, le groupe acyle (R-C=O) est généralement dérivé d’un acide carboxylique (R-COOH). Ils sont ensuite réestérifiés en esters méthyliques d’acides gras (FAME) ce qui donne de meilleures séparations sur les colonnes GC (étape 5 du protocole).

<table><tbody><tr><td>Flacons de 15 ml</td><td>VWR</td><td>66009-560</td><td></td></tr><tr><td>1-hexadécanol</td><td>Sigma</td><td>258741-1G</td><td></td></tr><tr><td>1-Monopalmitoyl-rac-glycérol</td><td>Sigma</td><td>M1640-1g</td><td></td></tr><tr><td>Flacons de 2 ml</td><td>VWR</td><td>46610-722</td><td></td></tr><tr><td>Filtres en fibre de verre de 25 mm</td><td>Fisher</td><td>09 874 32A</td><td></td></tr><tr><td>Ampoules à pipette de 2 ml</td><td>VWR</td><td>82024-554</td><td></td></tr><tr><td>Filtres en fibre de verre de 47 mm</td><td>Fisher</td><td>09 874 32</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes 5 3/4 »</td><td>Fisher</td><td>1367820A</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes 9 »</td><td>Fisher</td><td>1367820C</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>VWR</td><td>CAAX0116-1</td><td></td></tr><tr><td>Agilent GC-FID 6890</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium ANHS 500gm</td><td>VWR</td><td>CACX0160-1</td><td></td></tr><tr><td>Bouchons pour flacons de 2 ml</td><td>VWR</td><td>46610-712</td><td></td></tr><tr><td>chloroforme</td><td>VWR</td><td>CACX1054-1</td><td></td></tr><tr><td>Palmitate de cholestéyle</td><td>Sigma</td><td>C6072-1G</td><td></td></tr><tr><td>Chromarod S5</td><td>Shell USA</td><td>3252</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorométhane</td><td>VWR</td><td>CADX0831-1</td><td></td></tr><tr><td>DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl</td><td>Sigma</td><td>P5911-1g</td><td></td></tr><tr><td>Éther éthylique, grade ACS anhydre 4L</td><td>VWR</td><td>CAEX0190-4</td><td></td></tr><tr><td>Glyceryl tripalmitate</td><td>Sigma</td><td>T5888-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Seringue 702SNR 25&micro ; l</td><td>Sigma</td><td>58381</td><td></td></tr><tr><td>Helium</td><td>Air Liquide</td><td>A0492781</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>VWR</td><td>CAHX0296-1</td><td></td></tr><tr><td>Régulateur d’hydrogène</td><td>VWR</td><td>55850-484</td><td></td></tr><tr><td>Iatroscan MK6</td><td>Shell USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher</td><td>066662</td><td></td></tr><tr><td>Medical Air</td><td>Liquide</td><td>A0464563</td><td></td></tr><tr><td>Gants en nitrile moyens</td><td>Fisher</td><td>191301597C</td><td></td></tr><tr><td>Gants en nitrile L</td><td>VWR</td><td>CA82013-782</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen</td><td>Air Liquide</td><td>A0464775</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen Regulator</td><td>VWR</td><td>55850-474</td><td></td></tr><tr><td>Nonadecane</td><td>Sigma</td><td>74158-1G</td><td></td></tr><tr><td>Acide palmitique</td><td>Sigma</td><td>P0500-10G</td><td></td></tr><tr><td>Distributeur répétitif</td><td>Sigma</td><td>20943</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium 1kg</td><td>VWR</td><td>CA97062-460</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de sodium Anhy ACS 500gr</td><td>VWR</td><td>CA71008-804</td><td></td></tr><tr><td>Acide sulfurique</td><td>VWR</td><td>CASX1244-5</td><td></td></tr><tr><td>Ruban téflon</td><td>Fisher</td><td>14610120</td><td></td></tr><tr><td>tissue master 125 115V avec homogénéisateur 7mm</td><td>OMNI International</td><td>TM125-115</td><td></td></tr><tr><td>Cuve de développement TLC</td><td>Shell USA</td><td>3201</td><td></td></tr><tr><td>UHP hydrogène</td><td>Air Liquide</td><td>A0492788</td><td></td></tr><tr><td>VWR repippetter à solvant</td><td>VWR VWR</td><td>82017-766</td><td></td></tr><tr><td>Minuterie VWR Clignotante LED 2 canaux</td><td>VWR</td><td>89140-196</td><td></td></tr><tr><td>Zebron ZB-Wax GC colonne</td><td>Phenomenex</td><td>7HM-G013-11</td><td></td></tr></tbody></table>

détermination des classes totales de lipides et de lipides dans les échantillons marins

Determination of Total Lipid and Lipid Classes in Marine Samples

Les lipides sont en grande partie composés de carbone et d’hydrogène et, par conséquent, fournissent une énergie spécifique plus grande que les autres macromolécules organiques dans la mer. Étant riches en carbone et en hydrogène, ils sont également hydrophobes et peuvent agir comme un solvant et un vecteur d’absorption pour les contaminants organiques et peuvent donc être des moteurs de la bioaccumulation des polluants dans les écosystèmes marins. Leur nature hydrophobe facilite leur isolement de l’eau de mer ou des spécimens biologiques : l’analyse des lipides marins commence par l’échantillonnage puis l’extraction dans des solvants organiques non polaires, fournissant une méthode pratique pour leur séparation des autres substances dans une matrice aquatique.
Si de l’eau de mer a été échantillonnée, la première étape consiste généralement à la séparation en factions « dissoutes » et « particulaires » définies opérationnellement par filtration. Les échantillons sont prélevés et les lipides isolés de la matrice de l’échantillon généralement avec du chloroforme pour la matière vraiment dissoute et les colloïdes, et avec des mélanges de chloroforme et de méthanol pour les solides et les échantillons biologiques. Ces extraits peuvent contenir plusieurs classes provenant de sources biogéniques et anthropiques. À ce stade, les lipides totaux et les classes de lipides peuvent être déterminés. Les lipides totaux peuvent être mesurés en additionnant les classes de lipides déterminées individuellement qui ont généralement été séparées chromatographiquement. La chromatographie sur couche mince (TLC) avec détection par ionisation de flamme (FID) est régulièrement utilisée pour l’analyse quantitative des lipides provenant d’échantillons marins. TLC-FID fournit des informations synoptiques sur les classes lipidiques et, en additionnant les classes, une mesure totale des lipides.
Les informations sur la classe des lipides sont particulièrement utiles lorsqu’elles sont combinées avec des mesures de composants individuels, par exemple des acides gras et / ou des stérols, après leur libération à partir d’extraits lipidiques. La grande variété de structures et de fonctions lipidiques signifie qu’elles sont largement utilisées dans la recherche écologique et biogéochimique évaluant la santé des écosystèmes et le degré d’influence des impacts anthropiques. Ils ont été utilisés pour mesurer les substances ayant une valeur alimentaire pour la faune marine (p. ex., les aliments aquatiques et/ou les proies) et comme indicateur de la qualité de l’eau (p. ex., hydrocarbures).

En tant que secteur de la production alimentaire à la croissance la plus rapide, l’aquaculture évolue en termes d’innovations technologiques et d’adaptations pour répondre aux exigences changeantes. L’un d’eux consiste à réduire la dépendance à la farine et à l’huile de poisson d’origine sauvage, qui fournissent des ingrédients alimentaires à de nombreuses espèces aquacoles. Les huiles végétales terrestres sont à l’étude en tant que substituts durables et économiques de l’huile de poisson dans les aliments aquatiques, et...

Ce protocole est destiné à la détermination des lipides dans l’eau de mer et les spécimens biologiques. Les lipides dans les filtrats sont extraits avec du chloroforme ou des mélanges de chloroforme et de méthanol dans le cas des solides. Les classes de lipides sont mesurées par chromatographie sur couche mince de bâtonnets avec détection par ionisation de flamme et leur somme donne la teneur totale en lipides.

Détermination des classes totales de lipides et de lipides dans les échantillons marins

Lipids are largely composed of carbon and hydrogen and, therefore, provide a greater specific energy than other organic macromolecules in the sea. Being ...

Les méthodes décrites ici concernent des composés qui peuvent être définis opérationnellement comme des lipides marins. La base de cette définition est leur aptitude à l’extraction liquide-liquide dans des solvants organiques non polaires, ce qui fournit un moyen pratique de les séparer des autres composés dans une matrice aqueuse. Leur nature hydrophobe facilite leur isolement de l’eau de mer ou des spécimens biologiques, ainsi que leur enrichissement et l’élimination des sels et des protéines.Pour les échantillons d’eau de mer, la première étape implique normalement la séparation en fractions dissoutes et particulaires définies opérationnellement, généralement par filtration. La fraction particulaire est celle retenue par les filtres, et la taille des pores est importante pour définir la coupure. À l’aide de pinces sans lipides, placez un filtre en fibre de verre de 47 millimètres qui a été éclampé sur un système de filtration propre aux lipides.Prenez l’échantillon et faites-le tourbillonner doucement pour remettre en suspension les particules qui se sont déposées. Mesurez un volume connu. Le volume dépendra de la quantité de particules dans l’échantillon.Lorsque le volume est mesuré, ajoutez de l’aspiration au système de filtration et mouillez doucement le filtre avec de l’eau de mer filtrée. Ajouter l’échantillon entier lentement à l’entonnoir de filtration et rincer le cylindre gradué avec de l’eau de mer pour s’assurer que toutes les particules sont ajoutées au filtre. Rincez l’entonnoir de l’appareil pour vous assurer que toutes les particules sont rincées sur le filtre.Tirez tout le liquide à travers le filtre, mais ne laissez pas le filtre sécher, car il peut briser les cellules qui se trouvent sur le filtre. Prenez la pince à lèvres propre, pliez le filtre en deux, puis pliez-le en tiers une fois de plus, puis en deux dans le sens de la longueur. Le filtre est ensuite placé dans un flacon propre aux lipides.Couvrir le filtre avec deux ml de chloroforme, coipre sous azote et sceller avec du ruban de téflon. À ce stade, l’échantillon sera stable en stockage à moins 20 degrés Celsius pendant un an. Préparation de l’échantillon.Mesurer un volume connu du filtrat dans un cylindre gradué en verre propre aux lipides. Placez l’échantillon dans un entonnoir séparateur propre aux lipides et ajoutez environ 20 ml de chloroforme. Agiter ce mélange pendant au moins deux minutes en évasant fréquemment.Après la première séparation, élimination du premier extrait et ajout d’acide. Après avoir secoué la solution pendant deux minutes, enveloppez l’entonnoir dans du papier d’aluminium et attendez que la séparation se produise, environ cinq minutes. Après avoir attendu la séparation, pelez le fond de la feuille d’aluminium pour voir les deux couches.Recueillez la couche inférieure dans une fiole à fond rond propre aux lipides, en prenant soin de ne pas inclure la couche supérieure. Coimbez la fiole à fond rond sous l’azote et placez-la au congélateur. Récupérez l’entonnoir séparateur et ajoutez de l’acide sulfurique au liquide.Ajouter 0,25 ml pour chaque litre d’eau de mer présent. Une fois l’acide sulfurique ajouté, agitez doucement l’eau de mer, puis ajoutez encore 10 ml de chloroforme et agitez vigoureusement tout en évasant pendant deux minutes supplémentaires. Ensuite, permettez la séparation.Deuxième et troisième séparations. Ajouter à nouveau la couche inférieure à la fiole inférieure ronde sans inclure d’eau. Ajouter une troisième quantité de 10 ml de chloroforme et agiter pendant encore deux minutes avec la ventilation.Après séparation, placer la dernière portion de chloroforme dans la même fiole et les extraits combinés peuvent être évaporés par évaporateur rotatif et transférés dans un flacon de deux ml. Coup monté. Pour la configuration de l’extraction, vous aurez besoin d’un récipient isotherme rempli de glace. Les solvants comprennent le chloroforme, l’eau extraite du chloroforme et le chloroforme-méthanol 2:1.De cette solution, vous avez besoin d’environ un ml par échantillon, alors composez-le en conséquence. Tous ces solvants doivent être placés sur de la glace afin qu’ils soient froids au moment où les extractions sont commencées. Les échantillons vont également sur la glace afin que tout reste froid.Broyage et extraction. Les échantillons ont été conservés congelés dans deux ml de chloroforme, alors ajoutez un ml de méthanol glacé ou une demi-pipe. Veillez lorsque vous ajoutez du méthanol à ne pas toucher le flacon avec la pipette.Nettoyer et homogénéiser trois fois avec du méthanol et trois fois avec du chloroforme. Lors du broyage, veillez à ne pas couper le flacon d’extraction dans votre main au cas où vous cassez le flacon et à éviter de réchauffer l’échantillon. Broyer rapidement.Une fois que l’échantillon a été complètement broyé, tenons-le dans de la glace et lavez toutes les particules restantes du broyeur dans le flacon à l’aide d’un ml de chloroforme-méthanol 2:1. Si nécessaire, utilisez un ensemble de pinces propres aux lipides pour forcer les particules à retourner dans le flacon avant le lavage. Veillez à ne pas toucher la pipette au broyeur ou le broyeur au flacon.Ajoutez ensuite 0,5 ml ou un quart de pipette d’eau extraite du chloroforme sans toucher le broyeur ou le broyeur au flacon. Lorsque le broyeur a été lavé, touchez la goutte suspendue du broyeur au flacon. Coiuchez-le et conservez-le dans la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à soniquer.Double pipetage. Après centrifugation, il y aura deux couches dans le flacon: les couches organiques et aqueuses. Pour obtenir la couche organique, la technique de double pipetage est utilisée.Pour ce faire, une courte pipette de cinq centimètres avec l’ampoule mise lâchement est saisie entre l’index et le majeur. Poussez doucement la pipette à travers les deux couches tout en pressant l’ampoule, ce qui fait sortir des bulles jusqu’à la fin. Lorsque le bas de la deuxième couche est atteint, utilisez votre pouce pour retirer l’ampoule sans dessiner la couche organique dans la pipette.Avec une pipette de neuf centimètres, pressez complètement l’ampoule. Placez l’extrémité longue du pipet dans le pipet de cinq centimètres et retirez la couche inférieure à travers le pipet de cinq centimètres. Cet extrait est ensuite placé dans un flacon propre aux lipides.Continuez à enlever la couche inférieure jusqu’à ce qu’elle soit entièrement enlevée. Toutes les couches de pool dans le flacon lipid-clean. Lavage des pipettes.Retirez l’ampoule de la pipette de neuf centimètres. Placez-le dans le flacon avec l’extrait dedans. Prenez une pipette de chloroforme propre, et sans toucher la pipette à celle qui est lavée, gicler le chloroforme autour de l’intérieur de la pipette.Tournez doucement cette pipette pendant le lavage. Prenez une deuxième pipette de chloroforme et faites la même chose à l’extérieur de la pipette. Assurez-vous que tout le chloroforme coule le long de la pipette et dans le flacon d’extraction.Lorsque vous avez terminé avec la pipette longue, prenez la pipe courte et répétez, mais lavez-la dans le flacon avec l’échantillon. Repérage d’un échantillon. Nettoyez une seringue avec du chloroforme.Prendre un échantillon de volume connu et rincer la seringue dans l’échantillon. Tirez l’échantillon au-delà de la quantité que vous souhaitez repérer. Ensuite, ramenez le piston à la quantité que vous voulez en assurant l’absence de bulles d’air.Utilisez le bouton pour distribuer 0,5 microlitre et touchez la goutte sur la tige. Laisser sécher avant de placer la goutte suivante au même endroit. Repérez tous les échantillons dans une ligne sur des tiges maintenues au-dessus de l’extrémité d’une plaque chauffante chaude.Mise au point en acétone. La focalisation de l’échantillon se fait en 100% acétone. Ajouter environ 70 ml d’acétone au fond du réservoir de développement.Prenez les deux racks et abaissez-les doucement dans le réservoir de développement. Observez le front du solvant pendant qu’il grimpe sur la tige jusqu’à ce que le bas de la tache fusionne avec le haut de la tache. Retirez les tiges.Séchez-les pendant environ cinq secondes, puis répétez la procédure. Si les échantillons sont très concentrés, cette mise au point peut être effectuée une troisième fois. Premier système de développement.Le premier système de développement se compose d’hexane, d’éther éthylique et d’acide formique à 98,5 à un à 0,5. Commencez par rincer trois fois un cylindre gradué avec de l’hexane et jetez-le. Remplissez le cylindre gradué un peu plus de 85 mls avec de l’hexane.Utilisez ensuite une pipette et la bouteille d’hexane pour remplir le cylindre gradué à 90 mls. Ensuite, amenez le fond du ménisque à la ligne de 91 ml à l’aide d’éther éthylique, ce qui donnera un ml d’éther éthylique. Ajouter 0,5 ml d’acide formique à l’aide de la seringue Hamilton.Mais rincez d’abord la seringue Hamilton trois fois avec l’acide formique pour vous assurer qu’il ne reste pas de chloroforme utilisé pour rincer l’échantillon de la seringue. Ajouter deux seringues complètes ou 25 microlitres à la fois pour un total de 50 microlitres. Il est important que l’acide formique soit immédiatement rincé de la seringue avec du chloroforme pour éviter de corroder le métal dans la seringue.Une fois la seringue Hamilton propre, préparez la solution jusqu’à exactement 100 ml à l’aide d’hexane et d’une pipette. Puis coiuchez et inversez trois ou quatre fois. Versez environ 30 ml dans le réservoir de développement.Utilisez ces 30 ml pour mouiller le papier et rincer le réservoir. Jetez la solution de rinçage. Ajouter les 70 ml restants dans le réservoir de développement.Ajout de racks au système de développement. L’ajout de tiges au système de développement est le même pour chaque développement. Assurez-vous que la minuterie est réglée pour le moment où les tiges doivent être développées.Et puis prenez les racks et abaissez-les doucement dans le réservoir. Observez jusqu’à ce que le front du solvant atteigne les points d’échantillonnage, puis démarrez la minuterie. Deuxième système de développement.Le deuxième système de développement est l’hexane, l’éthylène et l’acide formique, de 79 à 20 à un. Donc, comme auparavant, rincez le cylindre gradué trois fois avec de l’hexane. Ajouter exactement 20 ml d’éther puis un ml d’acide formique, ce qui porte le volume à 21 mls.Porter ensuite le volume à 100 mls avec de l’hexane. Ajouter environ 75 ml d’hexane à l’aide des pompes à bouteille. Et pour la portion, utilisez une pipette.Coiuchez et inversez plusieurs fois. Ajouter environ 30 ml dans le réservoir de développement pour mouiller le papier et rincer le réservoir. Jeter les 30 mls.Ajoutez les 70 restants et il est prêt pour l’ensemble des tiges. Troisième système de développement. Le troisième système de développement est un mélange de chloroforme, de méthanol et d’eau extraite du chloroforme, 50, 40 à 10.Rincez le cylindre gradué trois fois avec du chloroforme. Ajouter environ 45 ml de chloroforme. À l’aide d’une pipette, porter le bas du ménisque à la marque de 50 ml.Ajouter environ 38 ml de méthanol. Amenez le bas du ménisque à la ligne de 90 ml. Remplissez ensuite les 10 derniers ml d’eau extraite du chloroforme.Comme pour les autres systèmes de développement, inversez-le trois ou quatre fois, puis versez 30 ml dans le réservoir pour mouiller le papier. Jeter ces 30 ml et ajouter les 70 derniers ml dans le réservoir. Préparation du méthanol.Pour constituer la solution Hilditch utilisée pour la dérivatisation, remplissez une fiole volumétrique propre aux lipides qui a également été séchée ou rincée trois fois de plus avec du méthanol pour éliminer tout chloroforme. Ajouter le méthanol jusqu’à ce que le bas du ménisque soit à la ligne de confinement. Après avoir mesuré le méthanol, ajouter le sulfate de sodium qui a été séché pendant au moins 24 heures à 60 degrés Celsius.Ajouter suffisamment de sulfate de sodium pour qu’il recouvre le fond de la fiole métrique de volume. Une fois recouvert, inverser deux fois de sorte que toute l’eau qui se trouve dans le méthanol soit absorbée par le sulfate de sodium. Après l’inversion et le tremblement, laissez-le reposer pendant au moins cinq minutes.Ajout de l’acide. Une fois que le méthanol s’est déposé cinq minutes, décantez-le lentement dans la bouteille en verre finale en veillant à ce que tout le sulfate de sodium reste au fond de la fiole jaugée. Le sulfate de sodium reste généralement au fond, de sorte que tout le méthanol doit se déverser.Laissez sécher le volumemétrique avec le sulfate de sodium à l’arrière de la hotte. Ajouter lentement de l’acide sulfurique au méthanol à l’aide d’un PIPETMAN. Ajoutez quelques gouttes à la fois pour que le méthanol ne crache pas.Une fois que tout l’acide a été ajouté, coiuer et remuer doucement pour mélanger. La solution est maintenant prête à être utilisée pour les produits dérivés, mais elle doit être préparée sur une base hebdomadaire. Faire les dérivés.À partir d’un flacon d’extrait dont le volume a été porté à une quantité connue, tourbillonner, puis retirer une partie de l’extrait dans un flacon de 15 ml propre aux lipides et marqué. La quantité que vous retirez sera déterminée par la concentration de l’échantillon de l’Iatroscan. Utilisez une pipette Drummond propre aux lipides pour retirer l’échantillon.Une fois l’échantillon retiré, placer le flacon de 15 ml sous azote pour évaporer complètement le chloroforme. L’échantillon original peut être conservé et retourné au congélateur. Lorsque l’échantillon est séché, ajouter 1,5 ml de dichlorométhane ou une pipette et trois ml de la solution de Hilditch qui a été faite plus tôt ce jour-là ou deux pipettes.Cette solution est ensuite conservée sous azote, vortexée et placée dans le sonicator pendant quatre minutes avant d’être placée dans un four à 100 degrés Celsius pendant une heure. Arrêter la réaction. Après avoir réchauffé à 100 degrés Celsius pendant une heure et refroidi, ajouter lentement 0,5 ml de solution saturée de bicarbonate de sodium.Des bulles seront produites au fur et à mesure que l’acide sera neutralisé. Ajoutez ensuite 1,5 ml d’hexane. Récapitulez et secouez vigoureusement.Laissez-le reposer pour qu’il se sépare en deux couches. Traiter tous les échantillons. Au moment où ils sont tous terminés, le premier sera prêt pour la prochaine étape.Retrait du calque supérieur. Une fois que la dérivatisation a été arrêtée et qu’il y a une séparation claire dans le flacon de 15 ml, retirez la couche supérieure et placez-la dans un flacon de deux ml propre aux lipides. Il est préférable de laisser une partie de la couche supérieure que d’obtenir l’une des couches inférieures dans le flacon de deux ml.Une fois que la majorité de la couche supérieure a été enlevée, le reste de la solution peut être jeté. L’extrait qui se trouve dans les deux ml doit être complètement évaporé sous un doux jet d’azote. Une fois que le flacon est complètement sec, l’hexane peut être rajouté, puis l’échantillon doit être soniqué, conservé sous azote, puis il est prêt à aller au GC. Résultats représentatifs.Cette figure montre les chromatogrammes TLC-FIC bruts de notre standard, un régime à base d’huile de colza et de tissu hépatique provenant d’un saumon nourri avec ce régime. L’aquaculture, le secteur de la production alimentaire qui connaît la croissance la plus rapide, doit réduire sa dépendance à l’égard de la farine et de l’huile de poisson d’origine sauvage. Les huiles végétales sont à l’étude en remplacement de l’huile de poisson dans les aliments aquatiques.Et le foie, le principal site du métabolisme des lipides, est ciblé pour analyse. Nous pouvons voir la prévalence des triacylglycérols dans l’alimentation dans le foie, et aussi l’importance des phospholipides membranaires dans le foie. Cette figure montre les chromatogrammes d’un standard.Les lipides et les particules décantées se sont accumulés au large de la côte ici et les lipides dans le mysid se sont accumulés près de la même profondeur. Ici, les chromatogrammes ont été traités par un logiciel de traçage. Étant riches en carbone avec une valeur énergétique très élevée, les lipides sont une composante importante de la productivité des zones de stockage, qui sont particulièrement importantes pour le cycle du carbone.Une plus grande production primaire de surface atteint les fonds marins dans des eaux moins profondes. Nous avons constaté que le petit mysid avait la concentration de lipides la plus élevée dans nos échantillons. La cire et les esters stériles sont combinés ici.Et il y a un pic de fractionnement en raison de la présence de niveaux élevés d’acides gras polyinsaturés. La rapidité avec laquelle le système Chromarod Iatroscan TLC-FID fournit des données synoptiques sur la classe lipidique à partir de petits échantillons en fait un outil puissant pour le criblage des échantillons marins avant d’effectuer des analyses chromatographiques plus détaillées. De telles analyses nécessitent généralement la libération de composés constitutifs à partir d’extraits lipidiques et la dérivatisation pour augmenter la volatilité.

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