Name: Évaluation du risque agrochimique pour les reines d’abeilles mellifères accouplées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Découvrez une méthode d'évaluation du risque agrochimique pour les reines d'abeilles mellifères en utilisant le système de cage de surveillance des reines. Ce protocole permet de mesurer l'impact de l'imidacloprid sur la ponte et la santé des colonies.

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Merci à la Dre Amy Cash-Ahmed, à Nathanael J. Beach et à Alison L. Sankey pour leur aide dans la réalisation de ce travail. La mention de noms commerciaux ou de produits commerciaux dans cette publication a uniquement pour but de fournir des informations spécifiques et n’implique pas de recommandation ou d’approbation par le département de l’Agriculture des États-Unis. L’USDA est un fournisseur et un employeur d’égalité des chances. Cette recherche a été soutenue par une subvention de la Defense Advanced Research Projects Agency # HR0011-16-2-0019 à Gene E. Robinson et Huimin Zhao, le projet USDA 2030-21000-001-00-D, et l’expérience de recherche sur la plasticité phénotypique pour les étudiants des collèges communautaires de l’Université de l’Illinois à Urbana Champaign.

1. Assemblage QMC
<ol><li>Assemblez les QGC à partir de pièces(Figure 1A)avec une seule plaque de ponte (PEL) insérée comme illustré à la Figure 1B. N’ajoutez pas de tubes d’alimentation avant que les travailleurs n’aient été ajoutés à la cage. Recouvrez temporairement les 4 trous d’alimentation avec du ruban adhésif de qualité laboratoire.</li>
	<li>Insérez l’excluseur de la reine et la porte de la chambre d’alimentation au-dessus de la chambre d’alimentation pour empêcher la reine d’entrer dans la chambre d’alimentation et de contacter le régime alimentaire traité. Voir Fine et al.32 pour plus de détails sur l’assemblage.</li>
	<li>Recueillir les cadres en rayon de cire contenant la couvée ouvrière coiffée des colonies d’abeilles mellifères 24 h avant l’éclosion adulte et les placer dans un incubateur (34,5 °C) à l’intérieur d’une boîte à couvain. 24 heures plus tard, brossez les abeilles écloses des cadres et dans un récipient ouvert qui a été tapissé d’une peinture barrière contre les insectes (p. ex., Fluon) pour empêcher les abeilles de ramper.</li>
	<li>Ajouter au moins 50 abeilles en poids (5 g ≈ 50 abeilles44,45) à la chambre de ponte de chaque QMC. Pour s’assurer qu’un pool génétique diversifié de travailleurs est représenté dans l’expérience, obtenez un nombre approximativement égal d’abeilles ouvrières d’au moins trois colonies et mélangez-les avant de les ajouter aux MCMC. REMARQUE: Les abeilles ouvrières nouvellement écloses de moins de 1 jour ne peuvent pas voler ou piquer en raison de leurs muscles de vol sous-développés et de leur cuticule non durcie. S’ils sont ajoutés à cet âge, il n’est pas nécessaire de les anesthésier avant la manipulation. Ils peuvent être pesés en ramassant doucement les abeilles du récipient à l’aide d’une petite tasse à mesurer de 1/4 tasse de volume et en les plaçant dans un deuxième récipient (tapissé de peinture barrière contre les insectes, par exemple Fluon) qui a été goudronné sur une balance. La superficie des cadres couverts par la couvée coiffée devrait être à peu près égale pour s’assurer que les colonies sources sont également représentées dans les populations de travailleurs du CQM. L’homogénéisation des abeilles ouvrières peut être réalisée en brossant les abeilles nouvellement écloses à partir de cadres prélevés dans toutes les colonies dans le même récipient et en leur permettant de se mélanger pendant 5 minutes avant de les ajouter aux QGC.</li>
	<li>Ajouter les mangeoires contenant une solution de saccharose, de l’eau et un supplément de pollen (voir rubrique 2).</li>
	<li>Exposez les reines accouplées individuelles au gaz CO2 pour stimuler la ponte46 et faciliter le transfert dans QMC.<ol>
<li>Utilisez des reines achetées auprès d’un éleveur commercial dans les 48 heures suivant leur réception. Pendant que la reine est encore à l’intérieur de la cage d’expédition, placez-la dans un sac en plastique transparent. Placez une extrémité d’un tube en plastique relié à un cannister de gaz CO2 à l’intérieur du sac et ouvrez doucement la vanne de cannister pour permettre au gaz CO2 de s’écouler.</li>
		<li>Lorsque le sac a été gonflé avec du gaz, fermez simultanément la vanne du cannister et maintenez le sac fermé pour piéger le gaz à l’intérieur. Gardez le sac fermé pendant 30 s ou jusqu’à ce que la reine ait cessé de bouger. Retirez la reine et ouvrez la cage d’expédition une fois qu’elle est observée comme inconsciente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ouvrez partiellement la porte de la chambre de ponte, placez doucement la reine inconsciente à l’intérieur et fermez le couvercle, en prenant soin de ne pas écraser la reine ou les ouvrières à l’intérieur. Ajouter la deuxième plaque de ponte à chaque QMC comme illustré à la figure 1C. Placez un morceau de ruban adhésif de laboratoire sur le dessus des deux PEL pour les empêcher de se séparer du cadre QMC et empêcher les travailleurs de sortir de la cage.</li>
	<li>Placez les cages dans un incubateur sombre avec des conditions environnementales stables de 34 ± 0,5 ° C et 60% ± 10% d’humidité relative, comme les conditions à l’intérieur d’une colonie normale.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62316/62316fig01.jpg"> Graphique 1. R : QMC démonté. B: QMC partiellement assemblé avec 1 ELP inséré. C: QMC entièrement assemblé avec 2 PEL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62316/62316fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
2. Préparer et administrer des régimes alimentaires contenant des produits agrochimiques
<ol><li>Pour préparer 1000 g de solution de saccharose à 50% (g/g), placez une barre d’agitation dans le fond d’un flacon de réactif en verre propre de 1 L. Ajouter 500 g de saccharose et 500 mL d’eau désionisée. Dévissez le couvercle de la bouteille et utilisez une plaque d’agitation chauffée réglée à feu doux pour mélanger la solution jusqu’à ce que tout le saccharose soit dissous. Laisser refroidir la solution à température ambiante avant d’ajouter les solutions mères agrochimiques.</li>
	<li>Préparer les solutions mères de produits agrochimiques dans un solvant approprié, tel que l’acétone, à une concentration qui peut être ajoutée à l’alimentation pour atteindre la concentration finale souhaitée de l’agrochimie d’intérêt. NOTE: Lors de l’utilisation de l’acétone comme solvant pour véhicule, les lignes directrices de l’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) stipulent que la concentration finale d’acétone dans l’alimentation doit être de ≤ 5% pour les essais de toxicité orale chronique sur les abeilles mellifères adultes47. Cependant, certains solvants tels que la n-méthyl-2-pyrrolidone5, 31 et le diméthylsulfoxyde25 peuvent exercer des effets toxiques en dessous de cette concentration, il est donc recommandé de maintenir les concentrations de solvants aussi faibles que possible dans le régime de traitement. Selon le volume et le type de solvant utilisé, il peut être nécessaire d’inclure à la fois un groupe témoin des solvants et un groupe témoin négatif pour s’assurer que les effets potentiels dus à la toxicité des solvants sont détectés. Lors de l’utilisation de produits formulés, la quantité de produit utilisée doit être ajustée en fonction de la concentration présente dans la formulation. Selon la stabilité de l’agrochimique d’intérêt dans le solvant, les solutions mères peuvent être conservées jusqu’à 2 semaines à -20 °C.</li>
	<li>Sélectionner les doses sublétales en fonction des résultats de l’essai n° 245 de l’OCDE : Abeille mellifère (Apis mellifera L.),Essai de toxicité orale chronique (alimentation de 10 jours)47, et identifier la littérature pertinente en interrogeant la base de connaissances Ecotox48.</li>
	<li>Administrer les traitements agrochimiques dans une solution de saccharose, un supplément de pollen commercial (s’il est disponible sous forme de poudre), ou les deux. Préparez le régime expérimental pour une utilisation le jour même en ajoutant une quantité appropriée de solution mère à une solution de saccharose réfrigérée / à température ambiante à 50% (p / p). Bien mélanger en vortexant ou avec une barre d’agitation réglée à vitesse moyenne. Pour les suppléments de pollen, ajoutez la solution de saccharose lacée agrochimique au supplément en poudre au lieu du sirop selon les protocoles du fabricant, en veillant à ajuster le volume de la solution mère utilisée en fonction du poids final du régime pollinique. Voir le tableau 1 pour des exemples de calculs.</li>
	<li>Préparer les tubes d’alimentation à partir de tubes de microcentrifugation de 2 mL.<ol>
<li>Pour les mangeoires liquides, chauffez la pointe d’une aiguille de calibre 20 sur une plaque chauffante / cuisinière et perforez le fond du tube deux fois. Fermez le couvercle du tube et pipettez environ 1,5 mL de solution de saccharose ou d’eau à travers l’un des trous de perforation. Posez le tube avec le côté perforé vers le haut jusqu’à ce qu’il soit ajouté au QMC.</li>
		<li>Pour les mangeoires de suppléments de pollen, utilisez une lame de rasoir pour trancher le fond du tube. Fermez le couvercle et poussez une boule de 1 à 2 g de supplément de pollen dans le tube jusqu’à ce qu’il touche le couvercle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enregistrez les poids d’alimentation avant de les placer dans les QGC. Ne conservez pas le régime alimentaire inutilisé à 4 °C pendant plus de 48 heures.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Concentration souhaitée</td>
			<td>Concentration souhaitée dans le véhicule de solvant</td>
			<td>Volume/masse final souhaité de solution de saccharose</td>
			<td>Voume de solution de stock</td>
			<td>Imidaclopride en solution mère</td>
			<td>Recette de solution de stock suggérée</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solution de saccharose</td>
			<td>10 ppb (p/p)</td>
			<td>0,05 % (v/v)</td>
			<td>81,45 mL/100 g*</td>
			<td>40,7 μL</td>
			<td>0,001 mg/40,7 μL</td>
			<td>0,02 mg/814 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Supplément de pollen</td>
			<td>10 ppb (p/p)</td>
			<td></td>
			<td>10 g**</td>
			<td>4,07 μL</td>
			<td>0,0001 mg/4,07 μL</td>
			<td>0,02 mg/814 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solution de saccharose</td>
			<td>50 ppb (p/f)</td>
			<td>0,05 % (v/v)</td>
			<td>78,5 mL/100 g*</td>
			<td>40,7 μL</td>
			<td>0,005 mg/40,7 μL</td>
			<td>0,1 mg/814 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Supplément de pollen</td>
			<td>50 ppb (p/f)</td>
			<td></td>
			<td>10 g**</td>
			<td>4,07 μL</td>
			<td>0,0005 mg/4,07 μL</td>
			<td>0,1 mg/814 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Exemples de recettes pour une solution de saccharose traitée, un supplément de pollen et une solution mère. *Volume basé sur la densité d’une solution de saccharose à 50 % (p/p) (1,228 g/mL). **La densité du supplément de pollen variera en fonction du produit utilisé, mais si ce volume de solvant est utilisé, la concentration finale de solvant dans le supplément de pollen sera dans la plage souhaitée de ≤ 5% en volume.
3. Surveillance - Taux de production d’œufs
<ol><li>Quantifiez la ponte 1 à 2 fois par jour le matin et/ou le soir. Commencez par retirer les MGC de l’incubateur pour vérifier la présence d’œufs. REMARQUE: Dans une expérience réussie, la production d’œufs commencera dans la plupart des GRGC de contrôle dans les 3 jours suivant l’assemblage initial de la cage. Ne sortez de l’incubateur qu’autant de GRQ de l’incubateur à la fois qui peuvent être vérifiés et alimentés dans les 10 minutes. Des périodes plus longues à l’extérieur de l’incubateur peuvent perturber la production d’œufs.</li>
	<li>Examinez le dos des PEL clairs pour les œufs. Si des œufs sont présents, retirez le panneau de porte devant la plaque d’intérêt. Retirez le ruban adhésif de l’autre côté des PEL et faites glisser soigneusement le panneau de porte entre le PEL et les abeilles à l’intérieur du QMC, en prenant soin de ne pas écraser les abeilles qui pourraient nettoyer les cellules des PEL.</li>
	<li>Une fois le panneau de porte en place, retirez le PEL, comptez et enregistrez le nombre d’œufs à l’intérieur des cellules du PEL. Retirez les œufs en tapotant le bord du PEL, côté cellule ouverte vers le bas, sur une surface dure (comme la lèvre d’un récipient à déchets). Une fois que les œufs tombent, remplacez le PEL vide dans le QMC. Retirez et remplacez délicatement le panneau de porte derrière le PEL à l’extérieur du QMC. Répétez l’opération si nécessaire avec le deuxième PEL et remplacez la bande sur le QMC lorsque vous avez terminé. NOTE: La production d’œufs diminue généralement et la mortalité augmente dans les MCMC après 2 semaines32,33, il est donc recommandé de conclure les expériences après 14 jours.</li>
</ol>4. Surveillance - Consommation alimentaire
<ol><li>Remplacez tous les aliments restants dans les mangeoires QMC par un régime fraîchement préparé tous les deux jours. Préparez de nouveaux tubes d’alimentation (y compris de l’eau) et pesez-les avant de retirer les QGC de l’incubateur pour surveillance. Remplacez tous les vieux tubes par de nouveaux et pesez les vieux tubes avant de vous débarrasser du régime non consommé. Comparez le poids final du tube d’alimentation et du régime non consommé au poids du même tube d’alimentation avant de le placer dans le QMC pour estimer la consommation alimentaire.</li>
	<li>Entre les jours où il est prévu de remplacer les mangeoires, vérifiez la consommation alimentaire une fois par jour (en même temps que lesQMC sont surveillés pour la production d’œufs) pour vous assurer que les mangeoires ne sont jamais vides. Si un tube d’alimentation est vide ou presque vide, retirez-le, remplissez-le, enregistrez le poids du tube avant et après et ajoutez la différence au total de consommation de régime sur 2 jours pour le QMC.</li>
</ol>5. Surveillance - Viabilité des embryons
<ol><li>À un moment choisi au cours d’une expérience QMC, retirez les PEL contenant des œufs fraîchement pondus du QMC conformément à l’étape 3,mais ne délogez pas les œufs du PEL.</li>
	<li>Couvrir le PEL avec un couvercle universel en microplaque et le placer à l’intérieur d’un dessiccateur avec une solution saturéedeK2 SO4 (150 g K2SO4 dans 1 L d’eau, conservé dans un plat peu profond). REMARQUE: Un peu de sel doit être visible au fond du plat après que le mélange soit arrivé à température dans l’incubateur.</li>
	<li>Gardez le dessiccateur dans un incubateur réglé à 34,5 °C, ce qui entraîne une humidité relative de 95% à l’intérieur du dessiccateur, similaire aux conditions utilisées par Collins49. REMARQUE: Presque tous les œufs éclosent dans les 72 ± 6 heures suivant leur ponte49, de sorte que les taux d’éclosion peuvent être évalués dès 78 heures après le retrait des PEL du CQ. Une larve en forme de « C » au fond de la cellule est révélatrice d’un éclosion réussi. Une certaine variation dans ce calendrier est possible si, par exemple, les œufs sont des drones et non des travailleurs50.</li>
</ol>6. Échantillonnage des travailleurs
<ol><li>Si les QGC ont été remplis de travailleurs en excès, échantillonnez les abeilles ouvrières à un moment choisi au cours de l’expérience pour évaluer les changements induits par le traitement dans leur physiologie. Effectuer les collectes en conjonction avec les activités quotidiennes d’alimentation et de comptage des œufs afin de minimiser le temps pendant lequel les MCGC sont à l’extérieur de l’incubateur.</li>
	<li>Avant l’échantillonnage, placez un panneau de porte entre un PEL et l’intérieur du QMC, puis retirez le PEL. Soulevez délicatement le panneau de porte à environ 0,5 cm de la base de la cage et retirez une abeille ouvrière de l’intérieur du QMC à l’aide d’une pince à épiler au poids plume. Pour empêcher les abeilles de s’échapper, couvrez des portions de l’ouverture de 0,5 cm avec un doigt ganté ou un morceau de coton si nécessaire.</li>
	<li>Conservez l’abeille prélevée pour une analyse de suivi et répétez ce processus jusqu’à ce que le nombre souhaité d’échantillons ait été prélevé. Pour l’analyse de l’expression génique, il est fortement recommandé de congeler les abeilles dans de l’azote liquide et de les stocker immédiatement à -80 °C51.</li>
</ol>7. Mortalité des travailleurs
<ol><li>Évaluer la mortalité des travailleurs au cours de l’expérience en comptant le nombre d’abeilles mortes au fond de la chambre d’alimentation et de la chambre de ponte. Effectuez cette évaluation en conjonction avec la quantification quotidienne de la ponte.</li>
	<li>À l’aide d’une pince, retirez soigneusement les abeilles mortes à travers les trous d’alimentation, en recouvrant le trou d’un doigt ganté ou d’un morceau de coton pendant que les pinces ne sont pas insérées.</li>
	<li>Retirez les abeilles mortes de la chambre de ponte en soulevant soigneusement le panneau de porte à environ 0,5 cm de la base de la cage et en insérant des pinces. Pour empêcher les abeilles de s’échapper, couvrez des portions de l’ouverture de 0,5 cm avec un doigt ganté ou un morceau de coton si nécessaire.</li>
	<li>Évaluer la mortalité des travailleurs à la fin de l’expérience en retirant et en comptant toutes les abeilles mortes des GRQ à l’aide des méthodes décrites précédemment avant d’euthanasier les abeilles restantes. REMARQUE: En l’absence d’abeilles ouvrières, les reines ne produiront pas d’œufs et mourront de faim dans les 24 heures. Par conséquent, si tous les travailleurs d’un QMC sont morts, le QMC doit être retiré de l’expérience. De même, si une reine meurt pendant l’expérience, le QMC doit être supprimé et les données doivent être censurées de manière appropriée.</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

La fécondité des insectes solitaires femelles ainsi que des reines dans les colonies d’insectes eusociaux peut être influencée par des facteurs de stress abiotiques tels que les produits agrochimiques25,28,29,30,33. Chez les abeilles mellifères, les effets des produits agrochimiques sur les reines peuvent être indirects, car ils peuvent se produire via des cha...

En raison de la demande mondiale accrue de produits agricoles, les pratiques agricoles modernes nécessitent souvent l’utilisation de produits agrochimiques pour lutter contre de nombreux ravageurs connus pour réduire ou nuire aux rendements des cultures1. Simultanément, les producteurs de nombreuses cultures de fruits, de légumes et de noix comptent sur les services de pollinisation fournis par les colonies commerciales d’abeilles mellifères pour assurer des rendements abondants2. Ces pratiques peuvent entraîner l’exposition des pollinisateurs, y compris les abeilles mellifères (Apis mellifera), à des niveaux nocifs de résidus de pesticides3. Dans le même temps, la présence généralisée d’infestations parasites d’acariens Varroa destructor dans les colonies d’abeilles mellifères oblige souvent les apiculteurs à traiter leurs ruches avec des acaricides, ce qui peut également avoir des effets négatifs sur la santé et la longévité de la colonie4,5,6. Pour réduire et atténuer les effets nocifs des produits agrochimiques, il est nécessaire d’évaluer pleinement leur sécurité pour les abeilles mellifères avant leur mise en œuvre afin que des recommandations pour leur utilisation puissent être faites pour protéger les insectes utiles.
À l’heure actuelle, l’Agence de protection de l’environnement (EPA) s’appuie sur une stratégie d’évaluation des risques à plusieurs niveaux pour l’exposition des abeilles mellifères aux pesticides, qui comprend des tests de laboratoire sur des abeilles adultes et parfois des larves d’abeillesmellifères 7. Si les essais en laboratoire de niveau inférieur ne parviennent pas à atténuer les préoccupations de toxicité, des essais sur le terrain et sur semi-terrain de niveau supérieur peuvent être recommandés. Bien que ces tests de laboratoire fournissent des informations précieuses sur les effets potentiels des produits agrochimiques sur la longévité des travailleurs, ils ne sont pas nécessairement prédictifs de leurs effets sur les reines, qui diffèrent considérablement des ouvrières biologiquement8 et comportementalement9. En outre, il existe de nombreux effets potentiels des produits agrochimiques sur les insectes au-delà de la mortalité, ce qui peut avoir des conséquences considérables pour les insectes sociaux qui dépendent de comportements coordonnés pour fonctionner comme une unité de colonie10,11.
Bien que la mortalité soit l’effet le plus couramment considéré des pesticides agrochimiques12,ces produits peuvent avoir un large éventail d’effets sur les arthropodes cibles et noncibles,y compris un comportement altéré13,14, 15,16, une répulsion ou une attractivité17,18,19, des changements dans les habitudes alimentaires20,21,22 , et a augmenté ou diminué la fécondité20,21,22,23,24,25. Pour les insectes sociaux, ces effets peuvent perturber systématiquement les interactions et les fonctions des colonies11. Parmi ces fonctions, la reproduction, qui dépend fortement d’une seule reine pondeuse soutenue par le reste de l’unité9de la colonie, peut être particulièrement vulnérable aux perturbations dues à l’exposition aux pesticides.
Des études réalisées sur des reines immatures ont démontré que l’exposition développementale aux acaricides peut affecter le comportement, la physiologie et la survie des reines adultes26,27. De même, des études utilisant des colonies de taille complète ou réduite ont démontré que les produits agrochimiques peuvent affecter les reines d’abeilles mellifères adultes en diminuant le succès d’accouplement28, diminuant la ponte29, et diminuant la viabilité des œufs produits25,30,31. Ces phénomènes étaient auparavant difficiles à observer sans l’utilisation de colonies entières, en grande partie en raison d’un manque de méthodes de laboratoire disponibles. Cependant, une méthode d’étude de la ponte des reines dans des conditions de laboratoire étroitement contrôlées à l’aide de cages de surveillance des reines (QMC)32 a récemment été adaptée pour examiner les effets des produits agrochimiques sur la fécondité des reines33. Ici, ces techniques sont décrites en détail ainsi que des méthodes supplémentaires pour mesurer et suivre la consommation alimentaire des travailleurs dans les QGC.
Ces méthodes sont plus avantageuses que les expériences nécessitant des colonies de taille normale car elles permettent l’administration de doses précises de produits agrochimiques à un nombre considérablement réduit de travailleurs par rapport aux dizaines de milliers généralement présents à l’intérieur d’une colonie34, qui approvisionnent ensuite la reine. Cette technique d’exposition reflète l’exposition de seconde main que les reines subiraient dans des scénarios réels car, au sein d’une colonie, les reines ne se nourrissent pas elles-mêmes et comptent sur les ouvrières pour leur fournir un régime alimentaire9. De même, les reines ne quittent généralement pas la ruche sauf pendant la reproduction de la colonie (essaimage) pour les vols d’accouplement35. Les reines d’abeilles accouplées peuvent être achetées auprès d’éleveurs de reines commerciaux et expédiées du jour au lendemain. En règle générale, les éleveurs de reines vendent des reines directement après avoir confirmé qu’elles ont commencé à pondre des œufs, ce qui est considéré comme une indication d’un accouplement réussi. Si des informations plus précises sur l’âge ou la parenté de la reine sont nécessaires, les chercheurs peuvent consulter l’éleveur de la reine avant de passer une commande.
Les QMC permettent une observation et une quantification précises des taux de ponte des reines d’abeilles mellifères et d’éclosion des œufs32,33, ce qui donne des données précieuses sur les effets de l’exposition agrochimique sur la fécondité des reines. Les résultats représentatifs présentés ici décrivent une expérience quantifiant la ponte, la consommation alimentaire et la viabilité embryonnaire dans les MCM sous exposition chronique à des concentrations pertinentes sur le terrain du neurotoxicant systémique néonicotinoïde imidaclopride36. Une fois appliqué, l’imidaclopride se transloque dans les tissus végétaux37, et des résidus ont été détectés le pollen et le nectar de nombreuses plantes pollinisées par les abeilles38,39,40. L’exposition à l’imidaclopride peut avoir un large éventail d’effets néfastes sur les abeilles mellifères, notamment une altération des performances de recherche de nourriture16, une altération de la fonction immunitaire41et une diminution des taux d’expansion et de survie descolonies 42,43. Ici, l’imidaclopride a été sélectionné pour être utilisé comme substance d’essai parce que des expériences sur le terrain ont montré qu’il peut affecter la ponte de la reine des abeilles mellifères29

<table><tbody><tr><td>Fluon</td><td>BioQuip, Rancho Dominguez, CA</td><td>2871A</td><td></td></tr><tr><td>Reines d’abeilles mellifères</td><td>Olivarez Honey Bees, Orland, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imidacloprid</td><td>Sigma-Aldritch, St. Louis, MO</td><td>37894</td><td></td></tr><tr><td>MegaBee Powder</td><td>MegaBee, San Dieago, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation 2 mL</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>02-682-004</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles calibre 20</td><td>W. W. Grainger, Lake Forest, IL</td><td>5FVK4</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de potassium</td><td>Sigma-Aldritch, St. Louis, MO</td><td>P0772</td><td></td></tr><tr><td>Queen Monitoring Cages</td><td>University of Illinois Urbana-Champaign</td><td></td><td>Numéro de demande de brevet : 20190350175</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldritch, St. Louis, MO</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>Couvercles universels</td> <td>pour microplaquesThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>5500</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation du risque agrochimique pour les reines d’abeilles mellifères accouplées

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Les stratégies actuelles d’évaluation des risques pour les abeilles mellifères reposent fortement sur des tests de laboratoire effectués sur des abeilles ouvrières adultes ou immatures, mais ces méthodes peuvent ne pas saisir avec précision les effets de l’exposition agrochimique sur les reines d’abeilles mellifères. En tant que seule productrice d’œufs fécondés à l’intérieur d’une colonie d’abeilles mellifères, la reine est sans doute le membre le plus important d’une unité de colonie fonctionnelle. Par conséquent, comprendre comment les produits agrochimiques affectent la santé et la productivité des reines devrait être considéré comme un aspect essentiel de l’évaluation des risques liés aux pesticides. Ici, une méthode adaptée est présentée pour exposer les reines d’abeilles mellifères et les préposées ouvrières à des facteurs de stress agrochimiques administrés par le biais d’un régime alimentaire de travailleurs, suivie d’un suivi de la production d’œufs en laboratoire et d’une évaluation de l’éclosion du premier stade à l’aide d’une cage spécialisée, appelée cage de surveillance des reines. Pour illustrer l’utilisation prévue de la méthode, les résultats d’une expérience dans laquelle les préposées ouvrières ont été nourries avec un régime contenant des doses sublétales d’imidaclopride et les effets sur les reines ont été surveillés sont décrits.

La production d’œufs a été surveillée dans des GRQ assemblés et entretenus comme décrit ci-dessus avec des observations une fois par jour de la production d’œufs et 15 cages par groupe de traitement. Des reines nouvellement accouplées de souche principalement carniolienne ont été achetées et expédiées pendant la nuit auprès d’un éleveur de reines, et les ouvrières d’abeilles mellifères ont été obtenues à partir de 3 colonies maintenues selon les méthodes commerciales standard au Bee Research Facility de l’Université de l...

Ce protocole a été développé pour améliorer la compréhension de la façon dont les produits agrochimiques affectent la reproduction desabeilles mellifères (Apis mellifera)en établissant des méthodes pour exposer les reines des abeilles mellifères et leurs soignants travailleurs aux produits agrochimiques dans un laboratoire contrôlé et en surveillant attentivement leurs réponses pertinentes.

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...

L’exposition aux produits agrochimiques peut avoir des répercussions majeures sur tous les membres d’une colonie d’abeilles mellifères, y compris le membre le plus important, les reines. Mais jusqu’à récemment, peu d’outils étaient disponibles pour étudier ces effets. Cette technique permet aux chercheurs d’exposer les reines à des produits agrochimiques dans des conditions contrôlées qui simulent les conditions qu’elles pourraient rencontrer sur le terrain.Il est assez facile de perturber les comportements de ponte de la reine des abeilles, il est donc important de faire attention lors de la manipulation des ouvrières et des reines avant et pendant l’expérience. Amy Floyd et Eliza Litsey, techniciennes de laboratoire à l’Unité de recherche sur la santé des espèces envahissantes et des pollinisateurs, Honeybee Research Lab, feront la démonstration de ces procédures. Pour commencer, assemblez des cages de surveillance de la reine, ou MGC, en insérant les panneaux de porte, puis insérez l’excluseur de la reine dans la porte de la chambre d’alimentation au-dessus de la chambre d’alimentation, pour empêcher la reine d’entrer et de contacter le régime alimentaire traité.Insérez un seul PEL. N’ajoutez pas de tubes d’alimentation avant que les travailleurs aient été ajoutés à la cage et recouvrez temporairement les quatre trous d’alimentation avec du ruban adhésif de qualité laboratoire. Après avoir collecté et incubé les cadres en peigne de cire contenant la couvée ouvrière coiffée des colonies d’abeilles mellifères, brossez les abeilles fermées dans un récipient ouvert recouvert d’une peinture barrière contre les insectes, pour empêcher les abeilles de ramper.Ajouter au moins 50 abeilles en poids à la chambre de ponte de chaque QMC. Pour s’assurer qu’un pool génétique diversifié est introduit, obtenez un nombre similaire d’abeilles ouvrières d’au moins trois colonies et laissez-les se mélanger avant d’ajouter des abeilles aux QGC. Ajouter les mangeoires contenant une solution de saccharose, de l’eau et un supplément de pollen.Utilisez des reines achetées auprès d’un éleveur commercial dans les 48 heures suivant leur réception. Pendant que la reine est encore à l’intérieur de la cage d’expédition, placez-la dans un sac en plastique transparent. Placez ensuite une extrémité d’un tube en plastique relié à une cartouche de gaz de dioxyde de carbone à l’intérieur du sac et ouvrez doucement la vanne de la cartouche pour permettre au gaz de dioxyde de carbone de s’écouler.Lorsque le sac a été gonflé avec du gaz, fermez simultanément la vanne du bidon et maintenez le sac fermé pour piéger le gaz à l’intérieur. Gardez le sac fermé pendant 30 secondes ou jusqu’à ce que la reine ait cessé de bouger. Retirez la reine en ouvrant la cage d’expédition une fois que la reine est observée comme inconsciente.Ouvrez partiellement la porte de la chambre de ponte, placez doucement la reine inconsciente à l’intérieur et fermez le couvercle. Ajoutez le deuxième PEL à chaque QMC. Placez un morceau de ruban adhésif de laboratoire sur le dessus des deux PEL pour les empêcher de se séparer du cadre QMC et empêcher les travailleurs de sortir de la cage.Placez les cages dans un incubateur sombre avec des conditions environnementales stables de 34 à 35 degrés Celsius et une humidité relative de 50 à 70%. Pour administrer le régime alimentaire contenant des produits agrochimiques, préparez les solutions mères de produits agrochimiques dans un solvant approprié, tel que l’acétone, à une concentration qui peut être ajoutée au régime alimentaire pour atteindre la concentration finale souhaitée de l’agrochimie d’intérêt. Administrer les traitements agrochimiques dans une solution de saccharose, un supplément de pollen commercial, ou les deux.Préparez le régime expérimental pour une utilisation le même jour, en ajoutant une quantité appropriée de solution mère à la température réfrigérée ou ambiante, solution de saccharose à 50%. Bien mélanger en vortexant à une vitesse moyenne. Pour les suppléments de pollen, ajoutez une quantité calculée de solution mère agrochimique à la solution de saccharose et vortexez soigneusement avant de l’ajouter au supplément en poudre.Ajoutez le régime alimentaire aux tubes d’alimentation et enregistrez les poids du chargeur avant de les placer dans le QMC. Pour quantifier la ponte, commencez par retirer les MCGC de l’incubateur. Examinez le dos des PEL transparents, si des œufs sont présents, retirez le panneau de porte devant la plaque d’intérêt.Retirez le ruban adhésif de l’autre côté des PEL et faites glisser le panneau de porte entre le PEL et les abeilles à l’intérieur du QMC. Une fois le panneau de porte en place, retirez le PEL et comptez et enregistrez le nombre d’œufs à l’intérieur des cellules du PEL. Retirez les œufs en tapotant le bord du côté de la cellule ouverte du PEL vers le bas, sur une surface dure.Une fois que les œufs tombent, remplacez le PEL vide dans le QMC. Retirez et remplacez délicatement le panneau de porte derrière le PEL à l’extérieur du QMC. Répétez l’opération si nécessaire avec le deuxième PEL et remplacez la bande sur le QMC lorsque vous avez terminé.Pour surveiller la consommation alimentaire, remplacez la nourriture par un régime fraîchement préparé tous les deux jours. Préparez de nouveaux tubes d’alimentation et pesez-les avant de commencer les activités de surveillance de la production d’œufs. Échangez les vieux tubes avec de nouveaux et pesez les vieux tubes avant de les jeter.Comparez le poids final du tube d’alimentation et du régime non consommé au poids du même tube, pour estimer la consommation de régime. Vérifiez une fois par jour pour vous assurer que les mangeoires ne sont jamais vides. Si un tube d’alimentation est vide ou presque vide, retirez-le, remplissez-le, enregistrez le poids du tube avant et après et ajoutez la différence au total de consommation alimentaire de deux jours pour le QMC.À un moment choisi au cours d’une expérience QMC, retirez les PEL contenant des œufs fraîchement pondus du QMC comme décrit précédemment, mais ne délogez pas les œufs du PEL. Couvrez d’abord le PEL avec un joint de plaque PCR, puis un couvercle universel de microplaque, puis placez-le à l’intérieur d’un dessiccateur avec une solution saturée de sulfate de potassium. Évaluez les taux d’éclosion environ 78 heures après le retrait des PEL du CQ.Une larve en forme de C au fond de la cellule est révélatrice d’un événement d’éclosion réussi. Si les QGC avaient été remplis de travailleurs en excès, échantillonnez les abeilles ouvrières à un moment choisi au cours de l’expérience pour évaluer les changements induits par le traitement dans leur physiologie. Avant l’échantillonnage, placez un panneau de porte entre un PEL et l’intérieur du QMC, puis retirez le PEL.Soulevez soigneusement le panneau de porte à environ 0,5 centimètre de la base de la cage et retirez une abeille ouvrière de l’intérieur du QMC à l’aide d’une pince à épiler au poids plume. Pour l’analyse de l’expression génique, congelez les abeilles dans de l’azote liquide et stockez-les à 80 degrés Celsius. Conservez l’abeille prélevée pour une analyse de suivi et répétez ce processus jusqu’à ce que le nombre souhaité d’échantillons ait été prélevé.Les changements liés au traitement alimentaire par l’imidaclopride dans le nombre quotidien d’œufs ont été évalués en mettant en œuvre une équation d’estimation généralisée linéaire logarithmique de Poisson, avec une matrice de corrélation auto-régressive. La production quotidienne d’œufs était significativement plus faible dans les MCMC recevant un supplément de pollen et du saccharose contenant 50 parties par milliard d’imidaclopride. Un effet dose-dépendant a été observé sur le nombre total d’œufs produits dans chaque QMC pour les traitements à l’imidaclopride administrés à la fois dans le saccharose et le supplément de pollen.Avec la plus grande réduction observée dans les GRQ nourris 50 parties par milliard d’imidaclopride, suivie de 10 parties par milliard de supplément de pollen plus saccharose. Aucune différence dans le total des œufs produits n’a été observée entre les témoins et les MCMC nourris avec 10 parties par milliard d’imidaclopride et de supplément de pollen seul. La consommation de supplément de pollen, d’eau et de saccharose a été enregistrée toutes les 48 heures pendant 10 ou 12 jours.Les taux quotidiens de consommation de saccharose ont considérablement augmenté au fur et à mesure que l’expérience progressait, mais les taux de consommation de suppléments de pollen ont diminué. Des taux plus élevés de consommation de pollen ont été observés lorsque 10 parties par milliard d’imidaclopride ont été administrées dans le supplément de pollen seul. Et le taux a diminué lorsque 10 ou 50 parties par milliard ont été administrées dans un supplément de pollen et une solution de saccharose ensemble.L’utilisation d’abeilles d’un jour est essentielle pour assurer l’acceptation de la reine et réduire la suractivation des travailleurs. Il est également essentiel de manipuler soigneusement la reine et de garder les cages dans un environnement stable.

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