Évaluation du risque agrochimique pour les reines d’abeilles mellifères accouplées

Ce protocole a été développé pour améliorer la compréhension de la façon dont les produits agrochimiques affectent la reproduction desabeilles mellifères (Apis mellifera)en établissant des méthodes pour exposer les reines des abeilles mellifères et leurs soignants travailleurs aux produits agrochimiques dans un laboratoire contrôlé et en surveillant attentivement leurs réponses pertinentes.

L’exposition aux produits agrochimiques peut avoir des répercussions majeures sur tous les membres d’une colonie d’abeilles mellifères, y compris le membre le plus important, les reines. Mais jusqu’à récemment, peu d’outils étaient disponibles pour étudier ces effets. Cette technique permet aux chercheurs d’exposer les reines à des produits agrochimiques dans des conditions contrôlées qui simulent les conditions qu’elles pourraient rencontrer sur le terrain.

Il est assez facile de perturber les comportements de ponte de la reine des abeilles, il est donc important de faire attention lors de la manipulation des ouvrières et des reines avant et pendant l’expérience. Amy Floyd et Eliza Litsey, techniciennes de laboratoire à l’Unité de recherche sur la santé des espèces envahissantes et des pollinisateurs, Honeybee Research Lab, feront la démonstration de ces procédures. Pour commencer, assemblez des cages de surveillance de la reine, ou MGC, en insérant les panneaux de porte, puis insérez l’excluseur de la reine dans la porte de la chambre d’alimentation au-dessus de la chambre d’alimentation, pour empêcher la reine d’entrer et de contacter le régime alimentaire traité.

Insérez un seul PEL. N’ajoutez pas de tubes d’alimentation avant que les travailleurs aient été ajoutés à la cage et recouvrez temporairement les quatre trous d’alimentation avec du ruban adhésif de qualité laboratoire. Après avoir collecté et incubé les cadres en peigne de cire contenant la couvée ouvrière coiffée des colonies d’abeilles mellifères, brossez les abeilles fermées dans un récipient ouvert recouvert d’une peinture barrière contre les insectes, pour empêcher les abeilles de ramper.

Ajouter au moins 50 abeilles en poids à la chambre de ponte de chaque QMC. Pour s’assurer qu’un pool génétique diversifié est introduit, obtenez un nombre similaire d’abeilles ouvrières d’au moins trois colonies et laissez-les se mélanger avant d’ajouter des abeilles aux QGC. Ajouter les mangeoires contenant une solution de saccharose, de l’eau et un supplément de pollen.

Utilisez des reines achetées auprès d’un éleveur commercial dans les 48 heures suivant leur réception. Pendant que la reine est encore à l’intérieur de la cage d’expédition, placez-la dans un sac en plastique transparent. Placez ensuite une extrémité d’un tube en plastique relié à une cartouche de gaz de dioxyde de carbone à l’intérieur du sac et ouvrez doucement la vanne de la cartouche pour permettre au gaz de dioxyde de carbone de s’écouler.

Lorsque le sac a été gonflé avec du gaz, fermez simultanément la vanne du bidon et maintenez le sac fermé pour piéger le gaz à l’intérieur. Gardez le sac fermé pendant 30 secondes ou jusqu’à ce que la reine ait cessé de bouger. Retirez la reine en ouvrant la cage d’expédition une fois que la reine est observée comme inconsciente.

Ouvrez partiellement la porte de la chambre de ponte, placez doucement la reine inconsciente à l’intérieur et fermez le couvercle. Ajoutez le deuxième PEL à chaque QMC. Placez un morceau de ruban adhésif de laboratoire sur le dessus des deux PEL pour les empêcher de se séparer du cadre QMC et empêcher les travailleurs de sortir de la cage.

Placez les cages dans un incubateur sombre avec des conditions environnementales stables de 34 à 35 degrés Celsius et une humidité relative de 50 à 70%. Pour administrer le régime alimentaire contenant des produits agrochimiques, préparez les solutions mères de produits agrochimiques dans un solvant approprié, tel que l’acétone, à une concentration qui peut être ajoutée au régime alimentaire pour atteindre la concentration finale souhaitée de l’agrochimie d’intérêt. Administrer les traitements agrochimiques dans une solution de saccharose, un supplément de pollen commercial, ou les deux.

Préparez le régime expérimental pour une utilisation le même jour, en ajoutant une quantité appropriée de solution mère à la température réfrigérée ou ambiante, solution de saccharose à 50%. Bien mélanger en vortexant à une vitesse moyenne. Pour les suppléments de pollen, ajoutez une quantité calculée de solution mère agrochimique à la solution de saccharose et vortexez soigneusement avant de l’ajouter au supplément en poudre.

Ajoutez le régime alimentaire aux tubes d’alimentation et enregistrez les poids du chargeur avant de les placer dans le QMC. Pour quantifier la ponte, commencez par retirer les MCGC de l’incubateur. Examinez le dos des PEL transparents, si des œufs sont présents, retirez le panneau de porte devant la plaque d’intérêt.

Retirez le ruban adhésif de l’autre côté des PEL et faites glisser le panneau de porte entre le PEL et les abeilles à l’intérieur du QMC. Une fois le panneau de porte en place, retirez le PEL et comptez et enregistrez le nombre d’œufs à l’intérieur des cellules du PEL. Retirez les œufs en tapotant le bord du côté de la cellule ouverte du PEL vers le bas, sur une surface dure.

Une fois que les œufs tombent, remplacez le PEL vide dans le QMC. Retirez et remplacez délicatement le panneau de porte derrière le PEL à l’extérieur du QMC. Répétez l’opération si nécessaire avec le deuxième PEL et remplacez la bande sur le QMC lorsque vous avez terminé.

Pour surveiller la consommation alimentaire, remplacez la nourriture par un régime fraîchement préparé tous les deux jours. Préparez de nouveaux tubes d’alimentation et pesez-les avant de commencer les activités de surveillance de la production d’œufs. Échangez les vieux tubes avec de nouveaux et pesez les vieux tubes avant de les jeter.

Comparez le poids final du tube d’alimentation et du régime non consommé au poids du même tube, pour estimer la consommation de régime. Vérifiez une fois par jour pour vous assurer que les mangeoires ne sont jamais vides. Si un tube d’alimentation est vide ou presque vide, retirez-le, remplissez-le, enregistrez le poids du tube avant et après et ajoutez la différence au total de consommation alimentaire de deux jours pour le QMC.

À un moment choisi au cours d’une expérience QMC, retirez les PEL contenant des œufs fraîchement pondus du QMC comme décrit précédemment, mais ne délogez pas les œufs du PEL. Couvrez d’abord le PEL avec un joint de plaque PCR, puis un couvercle universel de microplaque, puis placez-le à l’intérieur d’un dessiccateur avec une solution saturée de sulfate de potassium. Évaluez les taux d’éclosion environ 78 heures après le retrait des PEL du CQ.

Une larve en forme de C au fond de la cellule est révélatrice d’un événement d’éclosion réussi. Si les QGC avaient été remplis de travailleurs en excès, échantillonnez les abeilles ouvrières à un moment choisi au cours de l’expérience pour évaluer les changements induits par le traitement dans leur physiologie. Avant l’échantillonnage, placez un panneau de porte entre un PEL et l’intérieur du QMC, puis retirez le PEL.

Soulevez soigneusement le panneau de porte à environ 0,5 centimètre de la base de la cage et retirez une abeille ouvrière de l’intérieur du QMC à l’aide d’une pince à épiler au poids plume. Pour l’analyse de l’expression génique, congelez les abeilles dans de l’azote liquide et stockez-les à 80 degrés Celsius. Conservez l’abeille prélevée pour une analyse de suivi et répétez ce processus jusqu’à ce que le nombre souhaité d’échantillons ait été prélevé.

Les changements liés au traitement alimentaire par l’imidaclopride dans le nombre quotidien d’œufs ont été évalués en mettant en œuvre une équation d’estimation généralisée linéaire logarithmique de Poisson, avec une matrice de corrélation auto-régressive. La production quotidienne d’œufs était significativement plus faible dans les MCMC recevant un supplément de pollen et du saccharose contenant 50 parties par milliard d’imidaclopride. Un effet dose-dépendant a été observé sur le nombre total d’œufs produits dans chaque QMC pour les traitements à l’imidaclopride administrés à la fois dans le saccharose et le supplément de pollen.

Avec la plus grande réduction observée dans les GRQ nourris 50 parties par milliard d’imidaclopride, suivie de 10 parties par milliard de supplément de pollen plus saccharose. Aucune différence dans le total des œufs produits n’a été observée entre les témoins et les MCMC nourris avec 10 parties par milliard d’imidaclopride et de supplément de pollen seul. La consommation de supplément de pollen, d’eau et de saccharose a été enregistrée toutes les 48 heures pendant 10 ou 12 jours.

Les taux quotidiens de consommation de saccharose ont considérablement augmenté au fur et à mesure que l’expérience progressait, mais les taux de consommation de suppléments de pollen ont diminué. Des taux plus élevés de consommation de pollen ont été observés lorsque 10 parties par milliard d’imidaclopride ont été administrées dans le supplément de pollen seul. Et le taux a diminué lorsque 10 ou 50 parties par milliard ont été administrées dans un supplément de pollen et une solution de saccharose ensemble.

L’utilisation d’abeilles d’un jour est essentielle pour assurer l’acceptation de la reine et réduire la suractivation des travailleurs. Il est également essentiel de manipuler soigneusement la reine et de garder les cages dans un environnement stable.