Name: Détection des glycosaminoglycanes par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et coloration à l’argent (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Apprenez une technique d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide pour détecter et mesurer les glycosaminoglycanes sulfatés comme l'héparane sulfate. Cette méthode sensible et accessible facilite l'étude des fonctions biologiques des GAGs.

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Ce travail a été financé par F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL et EPS)

Tous les échantillons biologiques analysés dans le cadre de ce protocole ont été obtenus sur des souris, selon des protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Colorado.
1. Isolement du sulfate d’héparane
<ol><li>Délipidation d’échantillons de tissus REMARQUE: La délipidation est une étape facultative pour les tissus riches en graisse.<ol>
<li>Faire un mélange 1:1 de méthanol et de dichlorométhane. Préparer environ 500 μL par échantillon; de plus gros morceaux de tissu peuvent nécessiter jusqu’à 1 mL.</li>
		<li>Placez chaque échantillon de tissu dans un petit récipient en verre avec un couvercle pour la délipidation. REMARQUE : La masse de l’échantillon peut varier selon les tissus d’intérêt et les besoins expérimentaux. 50 mg ou moins sont généralement suffisants pour un rendement GAG adéquat, mais une certaine optimisation peut être requise par l’utilisateur final.</li>
		<li>Ajouter 500 μL de la solution méthanol:dichlorométhane dans chaque récipient en verre et mélanger. Assurez-vous que tous les échantillons de tissus solides sont complètement immergés dans le solvant. REMARQUE: Utilisez des pipettes sérologiques ou des tubes coniques en plastique pour mélanger et manipuler la solution de méthanol / dichlorométhane; d’autres plastiques peuvent se dissoudre.</li>
		<li>Placer les échantillons sur un agitateur (dans une grille sécurisée) dans une hotte à fumée chimique et agiter doucement pendant 1 h.</li>
		<li>Agiter les échantillons pour les mélanger et centrifuger à 17 000 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
		<li>Pipettez soigneusement la fraction de solvant organique (surnageant). C’est la fraction lipidique - elle ne contient pas de GAG et peut être jetée. REMARQUE: Essayez de ne pas déranger le tissu car de petits morceaux pourraient être perdus. Il est préférable de laisser une partie de la couche organique dans le récipient de l’échantillon, plutôt que de risquer la perte de l’échantillon.</li>
		<li>Laissez le couvercle du récipient en verre ouvert et laissez-le s’évaporer pendant la nuit dans la hotte. Changez le tube pour l’étape suivante car ces tubes ne survivront pas à un traitement ultérieur.</li>
		<li>Une fois que le mélange de solvants s’est complètement évaporé, procéder à la désintégration mécanique (si l’échantillon résiduel est >50 mg) ou à la digestion de l’actinase E (< 50 mg).</li>
	</ol></li>
	<li>Désintégration mécanique des tissus solides (facultatif; pour les échantillons de tissus plus grands) REMARQUE: La plupart des petits morceaux de tissu solide (environ 50 mg ou moins) devraient se dissoudre complètement pendant l’étape de digestion. Cependant, les échantillons plus grands nécessiteront une désintégration mécanique.<ol>
<li>Congeler les échantillons d’intérêt en les plaçant dans un tube en polypropylène de taille appropriée et en plaçant le tube fermé dans de l’azote liquide. Laissez l’échantillon geler jusqu’à ce qu’il soit complètement solide.</li>
		<li>À l’aide d’un mortier et d’un pilon propres, broyer les échantillons congelés en une consistance semblable à de la poudre.</li>
		<li>Passez directement à la digestion de l’Actinase E (étape 1.4).</li>
	</ol></li>
	<li>Dessalage et concentration des échantillons REMARQUE: Il s’agit d’une étape facultative et requise uniquement pour les échantillons de tissu liquide dilué (par exemple, le liquide de lavage broncho-alvéolaire (BALF) ou le plasma).<ol>
<li>Regrouper les échantillons liquides en groupes expérimentaux appropriés (p. ex., par réplique biologique ou groupe expérimental)</li>
		<li>Placer le volume total de l’échantillon dans une colonne filtrante centrifuge de 500 μL avec un seuil de poids moléculaire (MWCO) de 3 000 Da.</li>
		<li>Tourner pendant 30 min à 14 000 x g à température ambiante. Répétez l’opération au besoin si le volume d’échantillon souhaité dépasse la capacité de la colonne de filtre centrifuge.</li>
		<li>Lavez chaque colonne 3x avec 400 μL d’eau déionisée et filtrée. Jetez le flux à travers.</li>
		<li>Inverser le filtre et tourner pendant 1 min à 2 000 x g dans des tubes de collecte frais et correctement étiquetés. Congelez à -80 °C ou passez à l’étape suivante.</li>
	</ol></li>
	<li>Digestion de l’actinase E REMARQUE: Cette étape est nécessaire pour digérer et finalement éliminer les contaminants protéiques de votre échantillon.<ol>
<li>Mélanger les échantillons 1:1 avec l’Actinase E recombinante à une concentration souhaitée de 10 mg/mL. Ajouter le volume approprié de concentré tampon de digestion 10x. Concentration finale souhaitée : 0,005 M d’acétate de calcium et 0,01 M d’acétate de sodium, pH 7,5. Par exemple : 190 μL d’échantillon liquide, 190 μL de 20 mg/mL d’actinase E, 20 μL d’acétate de calcium de 0,05 M, 0,1 M d’acétate de sodium.</li>
		<li>Agiter doucement les échantillons pour les mélanger, puis les digérer pendant 48 à 72 h à 55 °C (jusqu’à 7 jours pour les tissus entiers).</li>
		<li>Chauffer à 80 °C pendant 15-20 min pour inactiver l’Actinase E.</li>
		<li>Congeler l’échantillon à -80 °C ou continuer à l’étape 1.5.</li>
	</ol></li>
	<li>Dessalage et concentration des échantillons REMARQUE : Si l’échantillon biologique prévoit une faible masse du GAG d’intérêt ou si la conservation de réactifs consommables (c.-à-d. colonnes filtrantes centrifuges) est souhaitable, les échantillons peuvent être regroupés pour produire un seul concentré par groupe expérimental (p. ex., par réplique biologique ou groupe expérimental).<ol>
<li>Placer le volume total de l’échantillon dans une colonne filtrante centrifuge de 500 μL avec un MWCO de 3 000 Da.</li>
		<li>Tourner pendant 30 min à 14 000 x g à température ambiante. Répétez l’opération si nécessaire si le volume d’échantillon souhaité dépasse la capacité de la colonne de filtre centrifuge.</li>
		<li>Lavez chaque colonne 3x avec 400 μL d’eau désionisée et filtrée. Jetez le flux à travers.</li>
		<li>Inverser le filtre et filer pendant 1 min à 2 000 x g dans des tubes de collecte frais et correctement étiquetés (généralement inclus avec les colonnes filtrantes centrifuges). Congelez à -80 °C ou passez à l’étape suivante.</li>
	</ol></li>
	<li>Dessiccation<ol>
<li>Placez les échantillons dissous de l’étape 1.5.5 dans un concentrateur à vide rotatif pendant la nuit ou lyophilisez les échantillons comme indiqué ci-dessous.</li>
		<li>Congeler soigneusement les échantillons pendant la nuit à -80 °C ou en trempant dans de l’azote liquide.</li>
		<li>Percer les couvercles d’échantillon avec une aiguille de 18 G et placer dans la chambre de lyophilisation. Ajoutez des serviettes en papier pour l’emballage au besoin.</li>
		<li>Fixer la chambre du lyophilisateur au lyophilisateur et lyophiliser pendant la nuit (au moins -40 °C, 0,135 Torr)</li>
	</ol></li>
	<li>Colonne d’échange de cations<ol>
<li>Remise en caisse des échantillons desséchés jusqu’à 400 μL d’urée 8 M, solution CHAPS à 2 % (ou, si l’on remettez en commun les échantillons, remettez en caisse jusqu’à un maximum de (400/n) μL, où n = le nombre d’échantillons dans le pool souhaité. Utilisez le moins possible de la solution détergente.</li>
		<li>Équilibrer la colonne d’échange cationiques (IEX) avec 400 μL d’urée 8 M, solution CHAPS à 2%. Tourner pendant 5 min à 2 000 x g à température ambiante.</li>
		<li>Chargez 400 μL d’échantillons/échantillons groupés dans la colonne IEX. Tourner pendant 5 min à 2 000 x g.</li>
		<li>Laver 3x avec 400 μL d’urée 8 M, solution CHAPS à 2%. Tourner pendant 5 min à 2 000 x g à chaque fois.</li>
		<li>Elute 3x avec 400 μL de 0,2 M NaCl. Tourner pendant 5 min à 2 000 x g chacun. Il s’agit de la fraction de faible affinité - elle peut être conservée à des fins de contrôle de la qualité si vous le souhaitez.</li>
		<li>Elute 3x avec 400 μL de 2,7 M (16%) NaCl. Tourner pendant 5 min à 2 000 x g chacun. Cette fraction contiendra les glycosaminoglycanes isolés d’intérêt - gardez-le tous!</li>
		<li>Pour dessaler chaque fraction éluée, ajouter du méthanol jusqu’à 80 % vol. et incuber à 4 °C pendant la nuit. Faire tourner chaque échantillon pendant 5 min à 2 000 x g. Récupérez le résidu solide car il s’agit de glycosaminoglycane desséché et desserré. REMARQUE: Vous pouvez également sauter cette étape et passer à l’étape 1.8 pour déstenter l’éluat sans méthanol.</li>
	</ol></li>
	<li>Dessalage et concentration des échantillons<ol>
<li>Si nécessaire, regrouper les fractions (à partir du point 1.7.6) en groupes expérimentaux appropriés (p. ex., par réplique biologique ou groupe expérimental).</li>
		<li>Placer le volume total de l’échantillon dans une colonne filtrante centrifuge de 500 μL avec un MWCO de 3 000 Da.</li>
		<li>Tourner pendant 30 min à 14 000 x g à température ambiante. Répétez l’opération si nécessaire si le volume d’échantillon souhaité dépasse la capacité de la colonne de filtre centrifuge.</li>
		<li>Lavez chaque colonne 3x avec 400 μL d’eau désionisée et filtrée. Jetez le flux à travers. Passez directement à l’étape 1.9.</li>
	</ol></li>
	<li>Digestion de la chondroïtine REMARQUE: Le but de cette étape est de supprimer les GG qui n’intéressent pas l’utilisateur final. Dans ce cas, la chondroïtine est utilisée pour éliminer la chondroïtine. Dans les tissus utilisés pour générer des résultats représentatifs (liquide de lavage broncho-alvéolaire et poumon entier), la digestion du sulfate de chondroïtine laisse le sulfate d’héparane comme principal GAG résiduel. Les utilisateurs finaux peuvent avoir besoin d’ajouter des étapes de digestion supplémentaires en fonction de leurs objectifs expérimentaux.<ol>
<li>Chargez 350 μL de tampon de digestion (acétate d’ammonium de 50 mM avec 2 mM de chlorure de calcium ajusté à un pH de 7,0) dans la colonne filtrante centrifuge sans toucher la membrane.</li>
		<li>Ajouter 5 μL de chondroïinase ABC recombinante.</li>
		<li>Placer le tube d’échantillonnage dans un four à 37 °C et incuber pendant 1 h.</li>
		<li>Retournez la colonne et placez-la dans des tubes de collecte étiquetés de manière appropriée. Tourner pendant 1 min à 2000 x g.</li>
		<li>Chauffer les échantillons à 80 °C pendant 15-20 min pour inactiver la chondroïtinase ABC.</li>
	</ol></li>
	<li>Dessalage et concentration des échantillons<ol>
<li>Si nécessaire, regrouper les échantillons de chondroïtine de l’étape 1.9.5 en groupes expérimentaux appropriés (p. ex., par réplique biologique ou groupe expérimental).</li>
		<li>Placer le volume total de l’échantillon dans une colonne filtrante centrifuge de 500 μL avec un MWCO de 3 000 Da.</li>
		<li>Tourner pendant 30 min à 14 000 x g à température ambiante. Répétez l’opération au besoin si le volume d’échantillon souhaité dépasse la capacité de la colonne de filtre centrifuge.</li>
		<li>Lavez chaque colonne 3x avec 400 μL d’eau désionisée et filtrée. Jetez le flux à travers.</li>
		<li>Inverser le filtre et tourner pendant 1 min à 2 000 x g dans des tubes de collecte frais et correctement étiquetés. Congelez à -80 °C ou passez à l’étape suivante.</li>
	</ol></li>
	<li>Dessiccation REMARQUE: Dans cette étape, la dessiccation est nécessaire afin que les échantillons puissent être remises en caisse dans la plus petite quantité possible d’eau et de tampon courant.<ol>
<li>Placez les échantillons digérés de chondroïtine de l’étape 1.10.5 directement dans un concentrateur à vide rotatif pendant la nuit ou lyophilisez comme suit:</li>
		<li>Congeler soigneusement les échantillons pendant la nuit à -80 °C ou en trempant dans de l’azote liquide.</li>
		<li>Percer les couvercles d’échantillon avec une aiguille de 18 G et placer dans la chambre de lyophilisation. Ajoutez des serviettes en papier pour l’emballage au besoin.</li>
		<li>Fixer la chambre du lyophilisateur au lyophilisateur et lyophilisation pendant la nuit (au moins 40 °C, 0,135 Torr)</li>
	</ol></li>
</ol>2. Électrophorèse sur gel de polyacrylamide de glycosaminoglycanes isolés et purifiés
<ol><li>Préparer à l’avance les solutions nécessaires à l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) (Tableau 1). REMARQUE: Sélectionnez le pourcentage d’acrylamide de la solution de gel résolvant en fonction de la taille des glycosaminoglycanes attendus dans l’échantillon. 15% est recommandé pour résoudre des fragments plus gros (plus de 30 sous-unités de disaccharides de longueur); 22 % pour les fragments plus petits (<20 sous-unités de disaccharides de longueur).</li>
	<li>Placez la cassette vide dans le réservoir PAGE. Couler le gel résolvant comme suit : Dans un tube de 15 mL, mélanger 10 mL de solution de gel résolvant, 60 μL de persulfate d’ammonium à 10 % (doit être fraîchement préparé) et 10 μL de TEMED (ajouter TEMED en dernier). Inverser doucement le tube 2-3x. Utilisez une pipette pour ajouter rapidement la solution supérieure à 10 mL à la cassette. Superposer avec 2 mL d’eau déionisée et filtrée et laisser le gel de résolution polymériser pendant 30 min. REMARQUE: Le protocole PAGE suivant a été optimisé pour un système PAGE vertical utilisant des cassettes de coulée de 13,3 x 8,7 cm (largeur x longueur) de 1,0 mm d’épaisseur avec un volume total d’environ 12 mL. D’autres systèmes de cassettes peuvent être utilisés, mais peuvent nécessiter une optimisation par l’utilisateur final.</li>
	<li>Une fois que le gel de résolution a complètement polymérisé, jeter l’eau superposée et couler le gel empilable comme suit: dans un tube de 15 mL, mélanger 3 mL de la solution de gel empilable, 90 μL de persulfate d’ammonium à 10% (doit être fraîchement préparé), 3 μL de TEMED (ajouter TEMED en dernier).</li>
	<li>Inverser doucement le tube 2-3x. Utilisez une pipette pour ajouter rapidement la solution de gel empilable sur le gel de résolution solidifié; remplir la cassette à ras bord. Insérez entièrement le peigne inclus avec la configuration. Laisser le gel empilable polymériser pendant 30 min.</li>
	<li>Une fois le gel polymérisé, assurez-vous que la bande de bande est retirée du fond de la cassette et replacez la cassette dans l’ensemble du réservoir PAGE.</li>
	<li>Remplissez les chambres supérieure et inférieure avec un tampon de chambre supérieure et inférieure, respectivement.</li>
	<li>Dissoudre les échantillons séchés de l’étape 1.11.4 dans le volume minimum nécessaire d’eau désionisée et filtrée (au maximum, 50% du volume des puits dans le gel PAGE). Mélanger 1:1 avec le tampon de chargement de l’échantillon. Charger les échantillons et les « échelles » d’oligosaccharides HS (voir tableau 1)dans le gel.</li>
	<li>Pré-exécuter le gel pendant 5 min à 100 V. Ensuite, faites fonctionner le gel à 200 V pendant 20-25 min (pour un gel résolvant de polyacrylamide à 15%), 40-50 min (pour un gel de résolution de polyacrylamide à 18%), 90-100 min (pour un gel de résolution de polyacrylamide à 22%). REMARQUE: Une certaine optimisation de la durée d’exécution de 200 V peut être nécessaire. Le rouge de phénol migre devant les oligosaccharides d’héparine qui sont 2 sous-unités polymères de longueur (c.-à-d. degré de polymérisation 2, ou dp2); le bleu de bromophénol migre avant dp10-dp14. Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque la tension est appliquée de telle sorte que la bande rouge phénol migre presque, mais pas tout à fait, vers le fond du gel. Ajustez le temps d’exécution en conséquence.</li>
</ol>3. Protocole de coloration à l’argent
<ol><li>Préparer à l’avance toutes les solutions nécessaires à la coloration à l’argent (Tableau 2). REMARQUE: Ne touchez pas directement le gel PAGE tant qu’il n’a pas été taché, développé et placé dans une solution d’arrêt. Au lieu de cela, manipulez le gel à l’aide d’outils en plastique ou en verre propres. La manipulation directe du gel entraînera des distorsions d’empreinte digitale et d’autres artefacts visibles sur le gel après la coloration.</li>
	<li>Une fois la course terminée, démontez la cassette et extrayez le gel dans un récipient propre de taille moyenne à grande rempli d’eau déionisée et filtrée. REMARQUE: Pour éviter de manipuler directement le gel, utilisez la pointe de la pipette ou un autre objet en plastique pour décoller doucement le gel de la cassette lorsqu’il est immergé dans l’eau. Le gel peut être fragile - manipulez-le avec précaution.<ol>
<li>Jetez l’eau. Tacher le gel dans une solution de coloration bleu Alcian pendant 5 min.</li>
		<li>Jetez la tache bleue d’Alcian. Rincez / lavez rapidement 2-3x avec de l’eau filtrée désionisée jusqu’à ce que la majeure partie de la solution de coloration bleu Alcian ait été enlevée.</li>
		<li>Laisser dé-tacher dans de l’eau déionisée et filtrée pendant la nuit sur la bascule. Assurez-vous qu’il y a un volume suffisant d’eau déionisée et filtrée pour vous assurer que toute tache résiduelle est complètement lavée du gel pendant la nuit.</li>
		<li>Gel de lavage dans du méthanol à 50% (40 min au total, changer de solution 2-3x).</li>
		<li>Gel de lavage à l’eau désionisée et filtrée pendant 30 min. Jetez l’eau et répétez 3 fois de plus pendant un total de 2 h, en remplaçant l’eau à chaque fois.</li>
		<li>Dans un récipient frais et propre, tacher le gel pendant 30 min dans une solution de coloration au nitrate d’argent.</li>
		<li>Rincez / lavez rapidement 2-3x dans de l’eau filtrée désionisée pour éliminer complètement la solution de coloration à l’argent.</li>
		<li>Laver pendant 30 min à l’eau déionisée et filtrée. Jetez l’eau et répétez 2x pendant un total de 90 min, en remplaçant le bain-marie à chaque fois.</li>
		<li>Jetez l’eau et ajoutez une solution de développement.</li>
		<li>Une fois la solution en développement ajoutée, observez attentivement le gel et surveillez l’apparition des bandes. Selon la qualité de la tache et la masse de l’échantillon chargé, le développement peut prendre de quelques secondes à plusieurs minutes.</li>
		<li>Dès que les bandes souhaitées sont visibles, jetez immédiatement la solution en développement et lavez-la brièvement avec la solution d’arrêt.</li>
		<li>Jetez le lavage de la solution d’arrêt et remplacez-le par une solution d’arrêt fraîche. Laisser tremper pendant 1 h sur une bascule ou un shaker.</li>
		<li>Laver à l’eau désionisée et filtrée pendant la nuit (cependant, le gel peut être imagé immédiatement après l’arrêt du lavage de la solution).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+in+ARDS%3A+A+critical+role+for+heparan+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Membrane%22%5BJournal%5D)">The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate.</a> Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).</li>
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<li>Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+glycosaminoglycan-derived+oligosaccharides+by+capillary+electrophoresis+using+reverse+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity.</a> Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).</li>
<li>Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mass+characterization+of+glycosaminoglycans+with+different+degrees+of+sulfation+in+bioengineered+heparin+process+by+size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography.</a> Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).</li>
<li>Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+mass+spectrometry+for+glycosaminoglycan+analysis%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review.</a> Molecular and Cellular Proteomics. , 100025(2021).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les GG jouent un rôle central dans de nombreux processus biologiques divers. L’une des principales fonctions des GAN sulfatés (tels que HS et CS) est d’interagir avec les ligands et de s’y lier, ce qui peut modifier les fonctions de signalisation en aval. Un déterminant important de l’affinité de liaison GAG aux ligands apparentés est la longueur de la chaîne polymère GAG 8,9,14. Pour cette raison, il est important que les cherc...

Les glycosaminoglycanes (GAG) sont une famille diversifiée de polysaccharides linéaires qui sont un élément omniprésent dans les organismes vivants et contribuent à de nombreux processus physiologiques de base1. Les GIG tels que le sulfate d’héparane (HS) et le sulfate de chondroïtine (CS) peuvent être sulfatés à des positions distinctes le long de la chaîne polysaccharidique, conférant des domaines géographiques de charge négative. Ces GAG, lorsqu’ils sont attachés à des protéines de surface cellulaire connues sous le nom de protéoglycanes, se projettent dans l’espace extracellulaire et se lient à des ligands apparentés, permettant la régulation des processus de signalisation cis- (ligand attaché à la même cellule) et trans- (ligand attaché à la cellule voisine)2. En outre, les GGA jouent également un rôle essentiel en tant qu’éléments structurels dans des tissus tels que la membrane basale glomérulaire3,le glycocalyx endothélial vasculaire4 et le glycocalyx épithélial pulmonaire5,et dans les tissus conjonctifs tels que le cartilage6.
La longueur des chaînes polysaccharidiques GAG varie considérablement en fonction de son contexte biologique et peut être allongée dynamiquement, clivée et modifiée par un système de régulation enzymatique très complexe7. Il est important de savoir que la longueur des chaînes polymères GAG contribue de manière substantielle à leur affinité de liaison pour les ligands et, par la suite, à leur fonction biologique8,9. Pour cette raison, la détermination de la fonction d’un GAG endogène nécessite une appréciation de sa taille. Malheureusement, contrairement aux protéines et aux acides nucléiques, il existe très peu de techniques facilement disponibles pour détecter et mesurer les GAG, ce qui a historiquement donné lieu à des recherches relativement limitées sur les rôles biologiques de cette famille diversifiée de polysaccharides.
Cet article décrit comment isoler et purifier les GG de la plupart des tissus biologiques et, également, décrit comment utiliser l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) pour évaluer la longueur des polymères isolés avec un certain degré de spécificité. Contrairement à d’autres approches glycomiques très complexes (et souvent basées sur la spectrométrie de masse), cette méthode peut être utilisée à l’aide d’équipements et de techniques de laboratoire standard. Cette approche pratique peut donc élargir la capacité des chercheurs à déterminer le rôle biologique des GG natifs et leur interaction avec des ligands contextuellement importants.

<table><tbody><tr><td>Accuspin Micro17 microcentrifugeuse de paillasse</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td>Toute combinaison microcentrifuge/rotor de paillasse capable de 14000 xG est appropriée</td></tr><tr><td>Acrylamide (solide)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP170-100</td><td>Grade d’électrophorèse</td></tr><tr><td>Actinase E</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5147</td><td>Mélange de protéase de S. griseus</td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX (solide)</td><td>thermoFisher Scientific</td> AC400460100 Acétate <td>d’ammonium</td><td></td></tr><tr><td>(solide)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A639-500</td><td>Biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Hydroxyde d’ammonium (liquide)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A669S-500</td><td>certifié ACS</td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium (solide)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP179-25</td><td></td></tr><tr><td>Eau Barnstead GenPure Pro Système de purification</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10-451-217PKG</td><td>Tout système de déionisation/purification de l’eau est un substitut acceptable</td></tr><tr><td>Acide borique (solide)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A73-500</td><td>Qualité de biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Bleu de bromphénol (solide)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>B392-5</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de calcium (solide)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18-609-432</td><td>Chlorure</td></tr> de <tr><td>calcium (solide)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AC349610250</td> Détergent CHAPS <td>de qualité biologie moléculaire</td></tr><tr><td>(3-((3-cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propanesulfonate)ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td>28299</td><td></td></tr><tr><td>Chondroïtinase ABC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3667</td><td></td></tr><tr><td>Cassette vide Criterion pour PAGE (1,0 mm d’épaisseur, 12+2 puits)</td><td>Bio-Rad</td><td>3459901 N’importe</td><td>quel système de cassette de coulée PAGE de 1,0 mm d’épaisseur suffira</td></tr><tr><td>Système de cellules Criterion PAGE (pile et alimentation)</td><td>Bio-Rad</td><td>1656019</td><td>tout système PAGE vertical comparable fonctionnera)</td></tr><tr><td>Dichlorométhane (liquide)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>AC610931000</td><td>certifié ACS</td></tr><tr><td>EDTA sel disodique (solide)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>02-002-786</td><td>Moléculaire qualité biologique</td></tr><tr><td>Acide acétique glacial (liquide)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A35-500</td><td>Certifié ACS</td></tr><tr><td>Glycine (solide)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>G48-500</td><td>Électrophorèse</td></tr><tr><td>grade Héparanase I/III</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3917</td><td>À partir de Flavobacterium heparinum</td></tr><tr><td>Décasaccharide dérivé de l’héparine (dp10)</td><td>galen scientific</td><td>HO10</td><td></td></tr><tr><td>Hexasaccharde dérivé de l’héparine (dp6)</td><td>Galen scientific</td><td>HO06</td><td></td></tr><tr><td>Oligosaccharide dérivé de l’héparine (dp20)</td><td>Galen scientific</td><td>HO20</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique (liquide)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A466-250</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td>Labconco</td><td>7752020</td><td>Tout lyophilisateur pouvant atteindre -40C et 0,135 Torr fonctionnera ; peut également être remplacé par un concentrateur sous vide rotatif</td></tr><tr><td>Méthanol (liquide)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A412-500</td><td>Certifié ACS</td></tr><tr><td>Molecular Imager Gel Doc XR System</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8170</td><td>Tout système d’imagerie en gel comparable est un substitut acceptable</td></tr><tr><td>N,N'-méthylène-bis-acrylamide (solide)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP171-25</td><td>Grade d’électrophorèse</td></tr><tr><td>Rouge de phénol (solide)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>P74-10</td><td>Acide libre</td></tr><tr><td>Q Mini H Colonne d’échange d’ions</td><td>Vivapure</td><td>VS-IX01QH24</td><td>La colonne d’échange d’ions doit avoir un volume de charge minimum de 0,4 ml, un pH de travail de 2-12 et une sélectivité pour les groupes ioniques avec un pKa de 11 Nitrate d’argent</td></tr><tr><td>(solide)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>S181-25</td><td>certifié ACS</td></tr><tr><td>Acétate de sodium (solide)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S210-500</td><td>Qualité biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (solide)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>Qualité de biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium (solide)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>S392-212</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose (solide)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td>Qualité de biologie moléculaire</td></tr><tr><td>TEMED (N,N,N',N'-tétraméthylènediamine)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP150-20</td><td>Électrophorèse</td></tr><tr><td>à base Tris (solide)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP152-500</td> Filtres Ultra centrifuges <td>de qualité biologie moléculaire</td></tr>, <tr><td>0,5 ml, 3000 Da seuil de coupure du poids moléculaire</td><td>Amicon</td><td>UFC500324</td><td>Des unités de filtrage de plus grand volume peuvent être utilisées, en fonction de la taille de l’échantillon.</td></tr><tr><td>Urée (solide)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>29700</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus</td><td>Eppendorf</td><td>22820001 N’importe</td><td>quel concentrateur sous vide rotatif fonctionnera ; peut être remplacé par un lyophilisateur</td></tr><tr><td>Unité de filtre sous vide, à usage unique, 0,22 uM pore PES, volume de 500 ml</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>569-0020</td><td>Volumes alternatifs et matériaux filtrants acceptables</td></tr></tbody></table>

détection des glycosaminoglycanes par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et coloration à l’argent

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Les glycosaminoglycanes sulfatés (GAG) tels que le sulfate d’héparane (HS) et le sulfate de chondroïtine (CS) sont omniprésents dans les organismes vivants et jouent un rôle essentiel dans une variété de structures et de processus biologiques de base. En tant que polymères, les GAG existent sous la forme d’un mélange polydispersé contenant des chaînes de polysaccharides pouvant aller de 4000 Da à plus de 40 000 Da. Au sein de ces chaînes existent des domaines de sulfatation, conférant un modèle de charge négative qui facilite l’interaction avec les résidus chargés positivement de ligands protéiques apparentés. Les domaines sulfatés des GAG doivent être d’une longueur suffisante pour permettre ces interactions électrostatiques. Pour comprendre la fonction des GG dans les tissus biologiques, l’investigateur doit être en mesure d’isoler, de purifier et de mesurer la taille des GG. Ce rapport décrit une technique pratique et polyvalente basée sur l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide qui peut être exploitée pour résoudre des différences de taille relativement faibles entre les GAN isolés à partir d’une variété de types de tissus biologiques.

Le bleu Alcian est utilisé pour colorer les GAG sulfatés 10; ce signal est amplifié par l’utilisation d’une tache d’argent ultérieure 11. La figure 1 présente une démonstration visuelle du processus de développement de la coloration à l’argent. Comme démontré, le signal bleu Alcian représentant les GAN séparés par électrophorèse est amplifié lorsque l’agent en développement pénètre dans le gel de polyacrylamide. En règle générale, le processus ...

Ce rapport décrit des techniques pour isoler et purifier les glycosaminoglycanes sulfatés (GAN) à partir d’échantillons biologiques et une approche d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide pour approximer leur taille. Les GG contribuent à la structure des tissus et influencent les processus de signalisation via l’interaction électrostatique avec les protéines. La longueur du polymère GAG contribue à leur affinité de liaison pour les ligands apparentés.

Détection des glycosaminoglycanes par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et coloration à l’argent

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

Ce protocole décrit une technique simple qui peut être utilisée pour détecter la présence et mesurer la longueur des glycosaminoglycanes, qui sont des molécules d’importance de plus en plus reconnue pour de nombreux processus biologiques. Cette technique est facilement adaptable à la plupart des laboratoires de sciences de la vie. Des techniques glycomiques comparables nécessitent souvent de l’équipement et de l’expertise que l’on ne trouve que dans les laboratoires de recherche en glycochimie.Cette technique peut être particulièrement utile aux chercheurs qui s’intéressent à l’étude du glycocalyx, une couche polysaccharidique qui tapisse les surfaces endothéliales et épithéliales du corps humain. Commencez par placer une cassette vide dans le réservoir PAGE. Couler un gel résolvant en mélangeant 10 millilitres de solution de gel résolvant avec 60 microlitres de persulfate d’ammonium fraîchement préparé à 10% dans un tube de 15 millilitres.Ajoutez ensuite 10 microlitres de TEMED. Inverser doucement le tube deux à trois fois. Ajouter rapidement 10 millilitres de la solution de gel de polyacrylamide activée à la cassette à l’aide d’une pipette.Superposez avec deux millilitres d’eau filtrée désionisée et laissez le gel résolvant polymériser pendant 30 minutes. Une fois que le gel de résolution a complètement polymérisé, jetez l’eau superposée. Couler le gel empilable en mélangeant trois millilitres de solution de gel empilable avec 90 microlitres de persulfate d’ammonium à 10% fraîchement préparé dans un tube de 15 millilitres.Ajoutez ensuite trois microlitres de TEMED et inversez doucement le tube deux à trois fois. Utilisez une pipette pour ajouter rapidement la solution de gel empilable sur le gel de résolution solidifié jusqu’à ce que la cassette soit remplie à ras bord. Insérez complètement le peigne inclus avec la cassette de gel de polyacrylamide vide et laissez le gel empilable polymériser pendant 30 minutes.Une fois le gel polymérisé, retirez la bande de bande du fond de la cassette et replacez la cassette dans le réservoir PAGE. Remplissez les chambres supérieure et inférieure avec les solutions tampons respectives. Dissoudre les échantillons de glycosaminoglycanes séchés dans le volume minimum nécessaire d’eau filtrée désionisée et mélanger avec le tampon de charge de l’échantillon dans un rapport de un pour un.Chargez les échantillons et les échelles d’oligosaccharides HS dans le gel. Préexécutez le gel pendant cinq minutes à 100 volts, puis faites-le fonctionner à 200 volts pendant 20 à 100 minutes, selon le pourcentage d’acrylamide de la solution de gel résolvant. Une fois la course terminée, démontez la cassette et extrayez soigneusement le gel dans un grand récipient propre rempli d’eau filtrée désionisée.Ensuite, jetez l’eau et tachez le gel dans une solution de coloration bleu Alcian pendant cinq minutes. Jetez la tache bleue d’Alcian et lavez rapidement deux à trois fois avec de l’eau filtrée désionisée jusqu’à ce que la majeure partie de la solution de coloration bleue d’Alcian ait été éliminée. Tachez le gel dans une solution de coloration au nitrate d’argent dans un récipient frais et propre pendant 30 minutes.Ensuite, lavez deux à trois fois pendant 30 minutes chacune dans de l’eau filtrée désionisée pour éliminer complètement la solution de coloration à l’argent. Jetez l’eau et ajoutez la solution en développement. Observez attentivement le gel pour l’apparition de bandes.Selon la qualité de la tache et la masse de l’échantillon chargé, le développement peut prendre de quelques secondes à plusieurs minutes. Dès que les bandes souhaitées sont visibles, jetez immédiatement la solution en développement et lavez brièvement le gel avec la solution STOP. Les glycosaminoglycanes isolés et purifiés ont été visualisés à l’aide de la technique de coloration au bleu Alcian et à l’argent après résolution dépendante de la densité par électrophorèse sur gel de polyacrylamide.Comme le voit cette figure, les oligosaccharides de sulfate d’héparane de différentes longueurs de polymère étaient facilement détectables à l’aide de cette approche basée sur PAGE. La limite de détection de cette méthode, aussi basse que 0,5 microgramme, montre que la technique est très sensible à la détection de glycosaminoglycanes isolés et purifiés à partir d’échantillons biologiques. Parmi les quatre oligosaccharides d’héparine sulfate différents visualisés à l’aide de cette méthode, l’héparine non fractionnée était la moins facilement détectable.En raison de la polydispersité de l’héparine non fractionnée, la densité de chaque bande individuelle de cet échantillon est inférieure aux bandes produites par une masse égale d’oligosaccharides d’héparine purifiés. L’efficacité de la purification des glycosaminoglycanes à partir d’échantillons biologiques liquides a été évaluée à l’aide d’échantillons de lavage broncho-alvéolaires prélevés sur des souris, qui contenaient à l’origine des concentrations relativement faibles de glycosaminoglycanes. De plus, le succès de cette technique a été démontré en utilisant du sulfate d’héparine isolé de l’homogénat pulmonaire entier, ce qui a donné une grande quantité de sulfate d’héparine isolé, les plus petits fragments équivalant à environ 10 sous-unités de disaccharide en masse.Il est très important d’utiliser des réactifs fraîchement préparés et de filtrer tous les réactifs utilisés dans ce protocole. Il est essentiel d’utiliser des réactifs de la plus haute pureté et qualité pour réussir cette technique.

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