Surveillance des interactions protéine-ligand dans les cellules humaines par RMN quantitative intracellulaire en temps réel à l’aide d’un bioréacteur à haute densité cellulaire

La spectroscopie RMN cellulaire offre une approche unique pour étudier la structure et la fonction des protéines directement dans les cellules vivantes et pour surveiller les processus biologiquement pertinents tels que les interactions protéine-ligand. Ce bioréacteur RMN peut maintenir un grand nombre de cellules humaines viables et métaboliquement actives pendant plusieurs jours dans le spectromètre, ce qui permet des applications de RMN en temps réel dans les cellules. Cette méthode peut être appliquée à toute protéine intracellulaire soluble, qui dégringole librement, subissant des changements conformationnels ou chimiques.

Le marquage isotopique étend encore l’applicabilité de la méthode. Pour commencer, assemblez l’unité de débit à l’aide d’un deuxième tube RMN d’unité d’écoulement, qui sera remplacé plus tard par celui contenant des cellules. Reportez-vous aux instructions d’utilisation de l’unité de débit pour un montage correct.

Réglez le bain-marie connecté au contrôle de la température de l’unité de débit à 37 degrés Celsius et placez la bouteille du réservoir dans le bain-marie. Connectez le tube FEP de la bouteille de réservoir à la pompe. Tournez la vanne du bioréacteur pour contourner et préremplir la pompe avec du fluide.

Ensuite, tournez la vanne du bioréacteur pour qu’elle s’écoule et préremplissez le bioréacteur avec le milieu à 0,1 millilitre par minute. Prenez une fiole T75 de cellules T HEK 293 transfectées de l’incubateur de dioxyde de carbone et retirez le milieu usé. Ajouter deux millilitres de trypsine EDTA aux cellules et incuber pendant cinq minutes à température ambiante pour détacher les cellules.

Inactiver la trypsine avec 20 millilitres de DMEM complet et remettre complètement en suspension les cellules en pipetant de haut en bas. Ensuite, transférez-les dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres. Centrifugez les cellules à 800X G pendant cinq minutes à température ambiante et jetez le surnageant.

Transférer la pastille de cellule dans un tube de microcentrifugation à capuchon de 1,5 millilitre. Pour incorporer les cellules dans des fils d’agarose, faites fondre une aliquote d’agarose solidifiée à 85 degrés Celsius dans un bloc chauffant, puis conservez-la en solution à 37 degrés Celsius dans le bloc chauffant. Avec une pipette Pasteur, remplissez le fond du tube RMN de l’unité de débit avec 60 à 70 microlitres de gel d’agarose à 1,5% et placez-le sur de la glace pour créer un bouchon inférieur de cinq millimètres de haut.

Chauffer la pastille de la cellule pendant 15 à 20 secondes dans le bloc chauffant et re-suspendre soigneusement les cellules dans 450 microlitres de solution d’agarose, évitant ainsi la formation de bulles. Aspirer la suspension de cellule/agarose dans un tube PEEK chromatographique de 30 centimètres de long de 0,75 millimètre de diamètre intérieur relié à une seringue d’un millilitre. Laissez le tube refroidir à température ambiante pendant deux minutes.

Pré-remplissez le tube RMN de l’unité de débit avec 100 microlitres de PBS à température ambiante. Faites couler des fils de cellules incorporés dans l’agarose dans le tube RMN de l’unité d’écoulement en poussant doucement la seringue. Retirez le tube RMN vide de l’unité de débit et augmentez le débit à deux millilitres par minute pendant quelques minutes pour éliminer les bulles de gaz résiduelles dans le tuyau d’entrée.

Réglez le débit à 0,2 millilitre par minute et insérez le tube RMN contenant les cellules en le poussant vers le haut lentement mais sûrement. Alimentez le milieu du bioréacteur à un débit de 0,1 millilitre par minute. Réglez la température dans le spectromètre RMN sur 310 Kelvin et insérez l’unité de débit dans le spectromètre.

Une fois le bioréacteur inséré dans le spectromètre RMN, attendez quelques minutes pour permettre l’échange du milieu. Ajustez la correspondance et le réglage du canal protonique, calez l’aimant et calculez la longueur d’impulsion dure de 90 degrés du proton. Ajustez les niveaux de puissance des protons dans chaque séquence d’impulsions en fonction de l’impulsion dure du proton.

Enregistrez un premier spectre RMN de protons zgesgp pour enregistrer le contenu de l’échantillon dans l’homogénéité du champ. Copiez les expériences zgesgp et p3919gp ou SOFAST-HMQC au numéro souhaité et mettez-les en file d’attente dans le spouleur d’acquisition. Injecter une solution concentrée de la molécule externe dans le flacon à réservoir moyen en perçant le tube de silicone avec une seringue stérile à aiguille longue.

À la fin de l’expérience rmnographique, remplacez le tube contenant les cellules par un tube vide et rincez l’unité d’écoulement avec de l’eau. Pour les cellules exprimant l’anhydrase carbonique non marquée, traiter les spectres p3919gp en appliquant la fonction de fenêtre de remplissage zéro et d’élargissement de ligne exponentielle. Pour les cellules exprimant la superoxyde dismutase marquée à l’azote 15, traitez les spectres SOFAST-HMQC en appliquant la fonction de remplissage zéro et de fenêtre en cloche à signe carré dans les deux dimensions.

Dans MATLAB, importez les régions spectrales à l’aide du script personnalisé Load_ascii_spectra. Exécutez le script Load_acqus pour extraire les horodatages des spectres 1D. Ouvrez l’interface graphique MCR-ALS 2.0 en exécutant le script mcr_main et, dans l’onglet Sélection de données, chargez la matrice spectrale.

Vérifiez les données en les traçant. Évaluez le nombre de composants, soit par décomposition de valeur singulière, soit manuellement, et sélectionnez une méthode pour l’estimation initiale des spectres purs. La détection de variables la plus pure ou l’analyse factorielle évolutive peuvent être utilisées.

Dans la fenêtre Sélection du jeu de données, sélectionnez Continuer. Définissez les contraintes pour les concentrations dans la fenêtre Contraintes:mode ligne. Appliquez une contrainte de non-négativité, en sélectionnant fnnls comme implémentation et deux comme nombre d’espèces.

Ensuite, appliquez une contrainte de fermeture, définissez la contrainte sur une, la condition de contrainte de fermeture comme égale à, et appliquez-la à toutes les espèces. Définissez les contraintes pour les spectres dans la fenêtre Contraintes:mode colonne. Appliquez une contrainte de non-négativité, en sélectionnant fnnls comme implémentation et deux comme nombre d’espèces.

Dans la dernière fenêtre, définissez 50 itérations et un critère de convergence de 0,01. Spécifiez les noms de sortie pour les concentrations, les spectres et l’écart-type. Cliquez sur Continuer pour exécuter le raccord MCR-ALS.

Les cellules du bioréacteur peuvent être maintenues en vie jusqu’à 72 heures, comme le confirme un test au bleu de trypan. Le bioréacteur a été utilisé pour la surveillance en temps réel de la liaison de deux inhibiteurs, l’acétazolamide et le méthazolamide à l’anhydrase carbonique surexprimée dans le cytosol des lymphocytes T HEK 293. La présence de signaux provenant de la protéine surexprimée et l’homogénéité du champ ont été évaluées avec le premier spectre de protons sculptant l’excitation.

Dans le cas de l’anhydrase carbonique, la liaison intracellulaire des deux inhibiteurs a été surveillée en observant des signaux protoniques dans la région comprise entre 11 et 16 parties par million du spectre WATERGATE, provenant des histidines coordonnant le zinc et d’autres résidus aromatiques. La liaison réussie a été confirmée par l’apparition de signaux supplémentaires. La MCR-ALS a été utilisée pour séparer les signaux RMN provenant de l’anhydrase carbonique libre et liée, et pour fournir les profils de concentration relatifs des deux espèces.

Le bioréacteur a été appliqué pour surveiller la formation d’une liaison de disulfure intramoléculaire superoxyde dismutase liée au zinc favorisée par ebselen, une imitation de glutathion peroxydase. L’analyse MCR-ALS sur des régions sélectionnées du spectre 2D a séparé les signaux provenant des deux espèces et a fourni leurs profils de concentration relatifs. Il est important d’insérer et de retirer le tube RMN de l’unité d’écoulement lentement et régulièrement pour éviter les sauts de pression qui peuvent provoquer la formation de bulles.

Le développement de bioréacteurs RMN a ouvert la voie à l’étude des processus dépendant du temps de résolution atomique, tels que le traçage de la régulation redux et des interactions médicament/cible dans les cellules vivantes.