Name: Modèle de plaie ex vivo humaine et approche de coloration à montage entier pour évaluer avec précision la réparation de la peau (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Découvrez un protocole de plaie cutanée ex vivo optimisé pour évaluer avec précision la réparation tissulaire. Cette méthode permet d'étudier la ré-épithélialisation dans des échantillons de peau humaine saine et diabétique.

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Nous tenons à remercier M. Paolo Matteuci et M. George Smith pour avoir fourni des tissus aux patients. Nous sommes également reconnaissants à Mlle Amber Rose Stafford pour son aide à la collecte de tissus et à l’Appel Daisy pour avoir fourni des installations de laboratoire.

<ol><li>Lindholm, C., Searle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+management+for+the+21st+century%3A+combining+effectiveness+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22International+Wound+Journal%22%5BJournal%5D)">Wound management for the 21st century: combining effectiveness and efficiency.</a> International Wound Journal. 13, 5-15 (2016).</li>
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<li>López-Valverde, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perioperative+and+long-term+all-cause+mortality+in+patients+with+diabetes+who+underwent+a+lower+extremity+amputation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Perioperative and long-term all-cause mortality in patients with diabetes who underwent a lower extremity amputation.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 141, 175-180 (2018).</li>
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<li>Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modeling+conundrum%3A+murine+models+for+cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">A modeling conundrum: murine models for cutaneous wound healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).</li>
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<li>Wilkinson, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+iron+promotes+wound+repair+via+M2+macrophage+polarization+and+the+chemokine+%28CC+motif%29+ligands+17+and+22%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Tissue iron promotes wound repair via M2 macrophage polarization and the chemokine (CC motif) ligands 17 and 22.</a> The American Journal of Pathology. 189 (11), 2196-2208 (2019).</li>
<li>Rhea, L., Dunnwald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+excisional+wound+healing+model+and+histological+morphometric+wound+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. 162, e61616(2020).</li>
<li>Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+statistical+analysis+of+murine+incisional+and+excisional+acute+wound+models%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models.</a> Wound Repair and Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).</li>
<li>Rizzo, A. E., Beckett, L. A., Baier, B. S., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linear+excisional+wound%3A+an+improved+model+for+human+ex+vivo+wound+epithelialization+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Research+and+Technology%22%5BJournal%5D)">The linear excisional wound: an improved model for human ex vivo wound epithelialization studies.</a> Skin Research and Technology. 18 (1), 125-132 (2012).</li>
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<li>Mendoza-Garcia, J., Sebastian, A., Alonso-Rasgado, T., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+an+ex+vivo+wound+healing+model+in+the+adult+human+skin%3A+Functional+evaluation+using+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Optimization of an ex vivo wound healing model in the adult human skin: Functional evaluation using photodynamic therapy.</a> Wound Repair and Regeneration. 23 (5), 685-702 (2015).</li>
<li>Brownhill, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-clinical+assessment+of+single-use+negative+pressure+wound+therapy+during+in+vivo+porcine+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Pre-clinical assessment of single-use negative pressure wound therapy during in vivo porcine wound healing.</a> Advances in Wound Care. , (2020).</li>
<li>Diekmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+skin+equivalent+reflecting+some+aspects+of+in+vivo+aged+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional skin equivalent reflecting some aspects of in vivo aged skin.</a> Experimental Dermatology. 25 (1), 56-61 (2016).</li>
<li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Nguyen, H., Cairns, D. M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skin+equivalents+demonstrate+need+for+neuro-immuno-cutaneous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biosystems%22%5BJournal%5D)">Human skin equivalents demonstrate need for neuro-immuno-cutaneous system.</a> Advanced Biosystems. 3 (1), 1800283(2019).</li>
<li>Dijkgraaf, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+patrol+by+resident+memory+CD8%2B+T+cells+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue patrol by resident memory CD8+ T cells in human skin.</a> Nature Immunology. 20 (6), 756-764 (2019).</li>
<li>He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+isolation+from+human+skin+for+phenotypic+analysis+and+ex+vivo+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte isolation from human skin for phenotypic analysis and ex vivo cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e52564(2016).</li>
<li>Pupovac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+immunocompetent+3D+skin+models%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Toward immunocompetent 3D skin models.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (12), 1701405(2018).</li>
<li>Ataç, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+and+hair+on-a-chip%3A+in+vitro+skin+models+versus+ex+vivo+tissue+maintenance+with+dynamic+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion.</a> Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).</li>
<li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microscale%2C+full-thickness%2C+human+skin+on+a+chip+assay+simulating+neutrophil+responses+to+skin+infection+and+antibiotic+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microscale, full-thickness, human skin on a chip assay simulating neutrophil responses to skin infection and antibiotic treatments.</a> Lab on a Chip. 19 (18), 3094-3103 (2019).</li>
<li>Jardet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+human+Th17-driven+ex+vivo+skin+inflammation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a human Th17-driven ex vivo skin inflammation model.</a> Experimental Dermatology. 29 (10), 993-1003 (2020).</li>
<li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+attenuates+diabetes-induced+tau+hyperphosphorylation+in+vitro+and+in+vivo+by+enhancing+autophagic+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Metformin attenuates diabetes-induced tau hyperphosphorylation in vitro and in vivo by enhancing autophagic clearance.</a> Experimental Neurology. 311, 44-56 (2019).</li>
<li>Demirovic, D., Rattan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+induces+stress+response+and+hormetically+modulates+wound+healing+ability+of+human+skin+fibroblasts+undergoing+ageing+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Curcumin induces stress response and hormetically modulates wound healing ability of human skin fibroblasts undergoing ageing in vitro.</a> Biogerontology. 12 (5), 437-444 (2011).</li>
<li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+senescence%3A+A+functional+link+between+diabetes+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Wound senescence: A functional link between diabetes and ageing.</a> Experimental Dermatology. 30 (1), 68-73 (2020).</li>
<li>Fisher, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+fragmentation+promotes+oxidative+stress+and+elevates+matrix+metalloproteinase-1+in+fibroblasts+in+aged+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Collagen fragmentation promotes oxidative stress and elevates matrix metalloproteinase-1 in fibroblasts in aged human skin.</a> The American Journal of Pathology. 174 (1), 101-114 (2009).</li>
<li>Quan, T., Little, E., Quan, H., Voorhees, J. J., Fisher, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+matrix+metalloproteinases+and+collagen+fragmentation+in+photodamaged+human+skin%3A+impact+of+altered+extracellular+matrix+microenvironment+on+dermal+fibroblast+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Elevated matrix metalloproteinases and collagen fragmentation in photodamaged human skin: impact of altered extracellular matrix microenvironment on dermal fibroblast function.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (5), 1362(2013).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Dans ce protocole expérimental, nous décrivons une méthode optimisée pour évaluer la fermeture des plaies dans la peau ex vivo humaine en utilisant la coloration tissulaire à montage entier. Il s’agit d’une ressource importante pour permettre une évaluation critique des traitements potentiels des plaies et pour mieux comprendre la réponse de réparation des plaies humaines. Nous avons publié une évaluation de la cicatrisation dans les plaies cutanées ex vivo précédemment12,13, mais dans ces rapports, l’approche de coloration globale n’a pas été utilisée pour mesurer la fermeture de la plaie. La coloration à montage entier est beaucoup plus facile et nécessite moins d’expérience technique que l’histologie standard, qui implique l’incorporation de paraffine ou d’OCT et la section d’échantillons. La procédure de montage complet réduit également la variabilité expérimentale, permettant de quantifier l’ensemble de la plaie et pas seulement une seule section transversale à une position définie dans le tissu (voir la figure 4B pour une illustration comparative). Nous soutenons pleinement l’importance de quantifier la guérison de l’ensemble de la structure non symétrique de la plaie, comme l’ont clairement souligné Rhea et Dunnwald pour les plaies aiguës murines14. Ces auteurs ont montré l’importance de la coupe en série in vivo des plaies excisionnelles pour des mesures reproductibles et précises de la morphologie des plaies. La section en série pourrait également être appliquée aux plaies ex vivo humaines; cependant, pour une quantification précise de la fermeture de la plaie et de la réétitélialisation, la coloration à montage entier à haut débit devrait être la méthode préférée. Nous notons que ce protocole de coloration à montage complet devrait également être compatible avec le traitement ultérieur (cire ou OCT) pour l’analyse histologique traditionnelle.
La coloration à montage entier n’est pas sans inconvénients. Bien qu’il offre une reproductibilité plus élevée dans les expériences de cicatrisation des plaies, il nécessite l’utilisation de plus de tissus pour l’analyse que les techniques histologiques standard. Il peut s’agir d’un problème où l’accès aux tissus est limité, en particulier lorsque plusieurs anticorps doivent être évalués. Une autre approche consisterait à utiliser une méthode de plaie incisionnelle où la largeur de la plaie est relativement uniforme et la variabilité réduite (comme le montrent les plaies de souris et d’hommes15,16). Cependant, les plaies excisionnelles restent plus applicables à la plupart des types de plaies pathologiques17.
Dans cette étude, des plaies d’épaisseur partielle de 2 mm ont été créées au centre des explantes cutanées de 6 mm. Cette méthode peut être optimisée pour d’autres tailles de plaies excisionnelles et d’explants à différentes profondeurs de peau18. De plus, la force nécessaire pour générer des plaies variera d’un donneur à l’autre, où la peau âgée nécessitera moins de force pour la biopsie. Nous éviterions également d’utiliser une peau présentant des vergetures proéminentes ou d’autres altérations structurelles. Nous avons validé une gamme d’anticorps pour prendre en compte différents aspects de la réponse de guérison ex vivo. Ce protocole peut également être utilisé avec d’autres anticorps pertinents pour la peau, où les concentrations d’anticorps et les temps d’incubation devront être optimisés. Néanmoins, nous pensons que notre protocole est le plus adapté à la quantification absolue de la fermeture totale de la plaie, suivie d’une évaluation spatiale de protéines spécifiques d’intérêt. Alors que la monture entière offre une résolution réduite de l’immunolocalisation par rapport à l’analyse histologique standard des coupes de tissus, elle fournit des informations 3D supplémentaires qui manquent à l’histologie 2D standard.
Une mise en garde de l’évaluation de la guérison dans la peau ex vivo par rapport aux modèles in vivo est qu’elle manque de réponse systémique. Un aspect important de la réparation des plaies est l’inflammation et la granulation tissulaire ultérieure, qui est causée par un afflux de cellules inflammatoires et de cellules endothéliales du système vasculaire19. Malgré cette limitation, la peau ex vivo offre toujours une meilleure récapitulation de la cicatrisation clinique que les tests de plaies à base de cellules. Les expériences in vitro impliquent généralement des monocouches de type cellulaire unique ou des co-cultures cultivées sur du plastique de culture tissulaire, tandis que la peau ex vivo fournit un environnement natif pour explorer le comportement cellulaire. Plus récemment, un certain nombre de systèmes équivalents cutanés ont émergé, où la peau est cultivée en laboratoire à partir d’une matrice artificielle et de cellules cutanées isolées20,21. Bien que ces modèles imitent mieux la peau humaine que la plupart des approches in vitro, ils ne simulent toujours pas complètement l’environnement tissulaire natif et sont généralement trop fragiles pour se blesser de manière reproductible. De plus, nous (et d’autres) avons démontré que le tissu cutané humain ex vivo conserve les cellules immunitaires résidentes, ce qui contribuera sans aucun doute à la réparation22,23. Les travaux futurs devraient maintenant se concentrer sur l’extension de la viabilité et de l’immunocompétence du modèle ex vivo pour l’évaluation de la guérison à un stade avancé24. Une option consiste à faire progresser les technologies prometteuses d’organes sur puce capables de prolonger la viabilité des tissus et de maintenir l’architecture de la peau native jusqu’à deux semaines en culture25. Les modèles ex vivo ont également commencé à considérer l’importance de la réponse inflammatoire de la peau en incorporant avec succès des cellules immunitaires, telles que les neutrophiles, dans le tissu hôte26 ou en injectant des anticorps dans le tissu hôte pour provoquer une réaction immunitaire27. Nous nous attendons à ce que ces résultats ouvrent la voie au développement de méthodes plus raffinées et traduisibles à l’avenir.
L’un des principaux avantages de l’utilisation de la peau ex vivo pour mesurer la fermeture des plaies est la capacité de comparer les taux de guérison dans les tissus sains (p. ex., non diabétiques) et pathologiques (p. ex., diabétiques ou âgés). Ici, nous avons montré que la rééphatalisation et la formation de barrière sont en effet altérées dans les plaies diabétiques par rapport aux plaies ex vivo saines. En effet, cela fournit une voie pour l’évaluation préclinique de la réparation pathologique, où le vieillissement et le diabète sont des facteurs de risque majeurs pour développer des plaies chroniques1. Bien qu’il existe des modèles pathologiques in vitro, tels que des cellules isolées de tissus âgés et diabétiques, ou des cellules cultivées dans un taux élevé de glucose pour imiter l’hyperglycémie28,29,ces cellules peuvent rapidement perdre leur phénotype une fois retirées du microenvironnement in vivo. Une composante importante de l’environnement de guérison pathologique extrinsèque est la matrice dermique, qui est altérée à la fois dans le vieillissement et le diabète30. En effet, cette matrice perturbée affecte le comportement des fibroblastes résidents et naïfs31,32. Ainsi, l’importance d’étudier les cellules dans leur environnement tissulaire hôte ne peut être sous-estimée.
En résumé, notre protocole fournit une plate-forme importante pour quantifier la réétalisation des plaies humaines, explorer les facteurs régulateurs et tester la validité et l’efficacité des thérapies potentielles12,13. Bien que les essais précliniques nécessitent toujours des approches in vivo, une stratégie combinée utilisant des tissus humains ex vivo et des blessures murines in vivo devrait affiner la voie préclinique, réduisant l’utilisation animale tout en augmentant la translatabilité entre espèces.

Les plaies chroniques et non cicatrisantes, qui sont très répandues chez les personnes âgées et les diabétiques, sont un domaine très peu apprécié des besoins cliniques non satisfaits. Ces blessures représentent un fardeau physique et psychologique majeur pour les patients et coûtent aux prestataires de soins de santé des milliards chaque année à traiter1. Malgré une meilleure compréhension de la biologie des plaies et des progrès technologiques, jusqu’à 40 % des plaies chroniques ne guérissent toujours pas après les meilleurs soins standard2. Ainsi, 14 à 26% des patients atteints d’ulcères du pied diabétique nécessitent par la suite une amputation3, tandis que le taux de mortalité post-amputation à 5 ans s’élève à environ 70%4. En conséquence, il est urgent de développer de nouvelles thérapies efficaces pour améliorer la qualité de vie des patients tout en réduisant le fardeau substantiel des soins de santé imposé par une mauvaise cicatrisation des plaies. Les modèles précliniques mal prédictifs restent un obstacle important au développement de nouvelles thérapies efficaces.
La réparation des plaies est un processus dynamique et multiforme impliquant un large éventail de types de cellules, d’innombrables niveaux de communication et un environnement tissulaire remodelé temporellement. La cicatrisation de la peau est soutenue par quatre grandes étapes réparatrices: l’hémostase, l’inflammation, la prolifération et le remodelage de la matrice. Ces étapes agissent finalement pour prévenir la perte de sang et l’infection, fermer la surface de la plaie (un processus appelé ré-épithélialisation) et ramener la peau à un état non blessé5. Les plaies chroniques sont associées à une étiologie diversifiée et à une perturbation généralisée des processus de guérison6,ce qui complique encore l’identification des cibles thérapeutiques. Néanmoins, un large éventail de modèles ont été développés pour élucider les facteurs moléculaires et cellulaires de la pathologie des plaies et tester de nouvelles approches thérapeutiques7.
Le modèle de réparation de plaie le plus utilisé est la blessure aiguë chez la souris. Les souris sont très faciles à traiter pour les études mécanistes et fournissent des modèles validés du vieillissement et du diabète8. Malgré les similitudes générales montrées entre la guérison de la souris et celle de l’homme, des différences entre les espèces dans la structure de la peau et la dynamique de guérison demeurent. Cela signifie que la plupart des recherches sur les plaies murines ne se traduisent pas facilement à la clinique9. Par conséquent, il y a eu une poussée vers des systèmes humains in vitro et ex vivo avec une applicabilité et une translatabilitéélevées 10,11.
Ici, nous fournissons un protocole approfondi pour effectuer des plaies excisionnelles d’épaisseur partielle dans la peau humaine ex vivo. Nous décrivons également notre approche de coloration à montage complet comme une méthode hautement reproductible d’évaluation ex vivo de la cicatrisation de la peau humaine. Nous montrons la trajectoire de la réparation épidermique (ré-épithélialisation) et la formation ultérieure d’une barrière, en évaluant le taux de fermeture des plaies dans la peau humaine saine par rapport à la peau humaine diabétique. Enfin, nous démontrons comment la coloration à montage entier peut être adaptée pour une utilisation avec une gamme d’anticorps afin d’évaluer divers aspects de la réponse de guérison.

<table><tbody><tr><td>50 mL Falcon Tubes</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>Pour le lavage de la peau</td></tr><tr><td>1.5&nbsp ; ml Tubes à centrifuger TubeOne, naturels (stériles)</td><td>Starlab</td><td>S1615-5510</td><td>Pour coloration à montage entier</td></tr><tr><td>Plaque cytoOne à 48 puits, traitée</td><td>TC</td><td>Starlab CC7682-7548</td><td>Pour coloration à montage entier</td></tr><tr><td>Acide acétique Glacial</td><td>Fisher Chemical</td><td>A/0400/PB15</td><td>Part de fixateur</td></tr><tr><td>Bromure d’alkyltriméthylammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7635</td><td>Part of fixative</td></tr><tr><td>Anti-Alpha Smooth Muscle Actin Antibody [1A4]</td><td>Abcam</td><td>ab7817</td><td>Taches les vaisseaux sanguins</td></tr><tr><td>Anticorps anti-collagène I</td><td>Abcam</td><td>ab34710</td><td>Colore le collagène</td></tr><tr><td>Anticorps anti-cytokératine 14 [LL002]</td><td>Abcam</td><td>ab7800</td><td>Taches épiderme</td></tr><tr><td>Anticorps CD1A (CTB6)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-5265</td><td>Colore les cellules de Langerhans</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62247</td><td>Contre-coloration pour noyaux cellulaires</td></tr><tr><td>Falcon Boîtes de Pétri 60mm Falcon</td><td></td><td>353004</td><td>Culture humaine ex vivo</td></tr><tr><td>Fibronectine Anticorps (EP5)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8422</td><td>Colore la fibronectine</td></tr><tr><td>Formaldéhyde, Extra Pure, Solution 37-41 %, SLR</td><td>Fisher Chemical</td><td>F/1501/PB17</td><td>Part of fixative</td></tr><tr><td>Gauze Swabs</td><td>Medisave</td><td>CS1650</td><td>Pour nettoyer la peau</td></tr><tr><td>Gibco&trade ; Solution antibiotique-antimycosique</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Human ex vivo culture</td></tr><tr><td>Gibco DMEM, glycémie élevée, sans glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11960044</td><td>Human ex vivo cultureGibco</td></tr> <tr><td>Fetal Bovin Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td>Human ex vivo cultureGibco</td></tr> <tr><td>HBSS, sans calcium, sans magnésium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14170088</td><td>Human ex vivo culture</td></tr><tr><td>Gibco L-Glutamine (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td>Human ex vivo culture</td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ML</td><<td>em>Pour la coloration à l’immunoperoxydase</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td> National <td>Institutes of Santé</td><td>N/A</td><td>Pour l’analyse d’images</td></tr><tr><td>Invitrogen IgG (H+L) Chèvre à adsorption croisée anti-souris, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td>L’anticorps secondaire utilisé dépend des fluorochromes requis et de l’anticorps primaire</td></tr><tr><td>Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11012</td><td>L’anticorps secondaire utilisé dépend des fluorochromes et de l’anticorps primaire requis</td></tr><tr><td>Invitrogen LIVE/DEAD Kit de viabilité/cytotoxicité, pour cellules de mammifères</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3224</td><td>Pour l’évaluation de la viabilité des tissusIris</td></tr> <tr><td>Forceps, 10 cm, incurvée, 1x2 dents</td><td>World Precision Instruments</td><td>15917</td><td>Pour créer des blessures</td></tr><tr><td>Ciseaux à Iris, 11 cm, Courbé, SuperCut, Carbure de Tungstène</td><td>World Precision Instruments</td><td>501264</td><td>Pour créer des plaies</td></tr><tr><td>Ciseaux Iris, 11 cm, Droit, SuperCut, Carbure de Tungsten</td><td>World Precision Instruments</td><td>501263</td><td>Pour enlever le tissu adipeux</td></tr><tr><td>Kératine 1 Anticorps polyclonal, Biolegend</td><td></td><td>purifié 905201</td><td>Tache l’épiderme</td></tr><tr><td>Kératine 14 Anticorps polyclonal, Biolégende purifiée</td><td></td><td>905301</td><td>Colore l’épiderme</td></tr><tr><td>LSM 710 Microscope confocal à balayage laser</td><td>Carl Zeiss</td><td>Discontinué</td><td>Pour l’imagerie fluorescenteMerck</td></tr> <tr><td>Millipore Coussinets absorbants</td><td>Merck Millipore</td><td>AP10045S0</td><td>Human ex vivo cultureMerck</td></tr> <tr><td>Millipore Nylon Filtres à membrane hydrophile</td><td>Merck Millipore</td><td>HNWP04700</td><td>Human ex vivo culture</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum Solution</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000-20</td><td>Le sérum animal utilisé dépend de l’anticorps secondaire</td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3619</td><td>For wash buffer</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Pour tampon de blocage </td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Bioréactifs</td><td>BP358-212</td><td>Part of fixative</td></tr><tr><td>Sterilisation Pouches</td><td>Medisave</td><td>SH3710</td><td>Pour stériliser les instruments</td></tr><tr><td>Stiefel Poinçons de biopsie</td><td>2mm Medisave</td><td>BI0500</td><td>Pour plaie d’épaisseur partielle</td></tr><tr><td>Stiefel Poinçons de biopsie de 6 mm</td><td>Medisave</td><td>BI2000</td><td>Pour explant extérieur</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Sterilin Standard 90mm Boîtes de Pétri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>101VR20</td><td>Pour préparer la peau</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Chemical</td><td>T/3751/08</td><td>Pour tampon de lavage</td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC-HRP Kit, Peroxydase (Rabbit IgG)</td><td>Vector Laboratoires</td><td>PK-6101</td><td>Pour la coloration à l’immunoperoxydase ; Le kit HRP utilisé dépend de l’anticorps primaire </td></tr><tr><td>Vector NovaRED Substrate Kit, Peroxidase (HRP)</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4800</td><td>Pour la coloration par immunoperoxydase</td></tr><tr><td>Microscope numérique sans fil</td><td>Jiusion</td><td>N/A</td><td>Pour l’imagerie en fond clair</td></tr></tbody></table>

modèle de plaie ex vivo humaine et approche de coloration à montage entier pour évaluer avec précision la réparation de la peau

Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair

Les plaies chroniques non cicatrisantes, qui touchent principalement les personnes âgées et les diabétiques, constituent un domaine important des besoins cliniques non satisfaits. Malheureusement, les traitements actuels des plaies chroniques sont inadéquats, tandis que les modèles précliniques disponibles prédisent mal l’efficacité clinique des nouvelles thérapies. Nous décrivons ici un modèle préclinique à haut débit pour évaluer de multiples aspects de la réponse de réparation de la peau humaine. Des plaies d’épaisseur partielle ont été créées dans la peau ex vivo humaine et cultivées tout au long d’un temps de guérison. Des biopsies de plaies cutanées ont été prélevées en fixateur pour la procédure de coloration complète. Les échantillons fixes ont été bloqués et incubés dans des anticorps primaires, avec une détection réalisée par anticorps secondaire conjugué par fluorescence. Les plaies ont été contre-colorées et imagées par microscopie confocale avant de calculer le pourcentage de fermeture de la plaie (ré-épithélialisation) dans chaque biopsie. En appliquant ce protocole, nous révélons que les plaies excisionnelles de 2 mm créées dans une peau de donneur saine sont entièrement réépithélialisées au jour 4-5 après la blessure. Au contraire, les taux de fermeture des plaies cutanées diabétiques sont considérablement réduits, accompagnés d’une reformation perturbée de la barrière. La combinaison de la plaie de la peau humaine avec une nouvelle approche de coloration à montage entier permet une méthode rapide et reproductible pour quantifier la réparation ex vivo de la plaie. Collectivement, ce protocole fournit une plate-forme humaine précieuse pour évaluer l’efficacité des thérapies potentielles des plaies, transformant les tests précliniques et la validation.

Dans ce rapport, nous présentons une nouvelle approche ex vivo de la plaie cutanée et de coloration complète pour évaluer les facteurs qui influencent la réponse de réparation de la peau humaine. La figure 1A montre un schéma du pipeline procédural, qui peut être effectué en 3 à 10 jours, en fonction des temps d’incubation de la plaie. Les plaies d’épaisseur partielle sont cultivées sur des piles de membranes à l’air : interface membranaire et peuvent être collectées pour une coloration complète, incorporées dans de la paraffine ou un milieu OCT pour l’histologie générale, ou congelées dans de l’azote liquide pour l’analyse biochimique (Figure 1B). Nous créons généralement des plaies d’épaisseur partielle de 2 mm au centre des explants de 6 mm. Cependant, la taille de la plaie et de l’explantation environnante peut être modifiée en fonction des besoins. La procédure de montage complet a été adaptée avec succès aux méthodes de coloration par immunoperoxydase et immunofluorescence (Figure 1C).
L’immunofluorescence permet de sonder les tissus avec de multiples anticorps. Pour cela, nous vous conseillons d’utiliser des anticorps primaires élevés chez différentes espèces et des anticorps secondaires conjugués par fluorescence appariés aux espèces pour limiter la réactivité inter-espèces. Les concentrations d’anticorps et les temps d’incubation devront être optimisés. Si une coloration de fond est observée, réduisez les concentrations d’anticorps, augmentez les étapes de lavage et ajoutez un tampon bloquant à l’anticorps secondaire. La viabilité des tissus frais peut être directement évaluée à l’avec des colorants de viabilité commerciale (voir tableau des matériaux). Nous montrons également que les tissus peuvent être fixés après la coloration de viabilité et imagés avec succès lorsqu’ils sont pratiquementappropriés (Figure 1D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig01.jpg"> Figure 1: L’approche de la blessure ex vivo humaine et de la coloration à montage entier. (A) Pipeline illustrant le flux de travail procédural, de la collecte de la peau et de la blessure ex vivo à la coloration des tissus et à l’analyse des données. (B) Diagramme démontrant le système de culture de plaies cutanées ex vivo chez l’homme avec des analyses effectuées régulièrement sur le tissu. (C) La coloration à montage entier peut être utilisée à l’aide de techniques d’immunoperoxydase et d’immunofluorescence. K14 = kératine 14. (D) Les tissus vivants peuvent être colorés avec des colorants de viabilité commerciale et imagés avec succès après la fixation. Barre = 100 μm. Cette coloration a été réalisée sur une peau non diabétique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
L’utilisation la plus largement applicable pour la coloration complète des plaies est de déterminer le taux de fermeture de la plaie d’une manière plus reproductible que celle qui peut être fournie par sectionnement histologique. Le pourcentage de fermeture a été quantifié en pourcentage de réétalisation de la surface de la plaie, comme le montre la figure 2A. La couverture en pourcentage de la surface de marqueurs spécifiques peut être mesurée à partir de la surface totale de la plaie ou en pourcentage de la plaie réétitélialisée. Nous avons caractérisé la cicatrisation dans une peau saine (non diabétique) par rapport à une peau diabétique sur une période de sept jours, en recueillant les plaies chaque jour après la blessure (images représentatives, Figure 2B). Les plaies cutanées saines se sont refermables au fil du temps comme prévu, avec une fermeture complète observée dans la plupart des échantillons aux jours 4-5. Au contraire, les plaies cutanées diabétiques ne se sont pas complètement refermables au cours de la période d’analyse de sept jours(figure 2C). Un retard significatif dans la fermeture de la plaie a été observé entre les plaies cutanées saines et diabétiques lors de la comparaison des taux de cicatrisation à chaque point temporel après la blessure(P &lt; 0,001 au jour 6, P &lt; 0,05 au jour 6 et P &lt; 0,05 à P &lt; 0,001 au jour 7).
Après évaluation des taux globaux de fermeture des plaies; nous avons mesuré le pourcentage de toute la zone de la plaie (zone externe sur la figure 2A)où les cellules K14 positives pouvaient être visualisées (coloration verte sur la figure 2B). Fait intéressant, nous avons observé que dans les plaies cutanées ex vivo saines, la coloration K14 a culminé au jour 2, puis a rapidement diminué (signification à chaque point temporel par rapport au pic du jour 2, Figure 2D). Cela reflète probablement la reformation de la barrière épidermique précoce, à l’exclusion de la pénétration des anticorps K14 à travers des couches épidermiques différenciées (voir la figure 2E schématique). Au cours du processus de réépithélialisation, les kératinocytes de la couche basale (K14 + ve) migrent vers l’intérieur sur la plaie ouverte, de sorte que l’épiderme plus proche du bord externe de la plaie se forme plus tôt que l’épiderme plus près du bord interne de la plaie (front migrateur). Alors que le bord avant de l’épiderme nouvellement formé continue de migrer pour fermer la plaie ouverte restante, l’épiderme du bord externe commence à se différencier pour reformer les autres couches épidermiques. Au début de la guérison, nous nous attendrions donc à voir la majeure partie de la zone réépithélialisée constituée de cellules basales (K14 + ve), tandis que dans la réparation ultérieure, la coloration K14 est perdue à mesure que l’épiderme se différencie de l’extérieur vers l’intérieur (voir les images de monture entière à la figure 2E). Par conséquent, la diminution de la coloration K14 montrée à la figure 2D (flèches vers le bas) est en corrélation avec une différenciation épidermique accrue. Fait intéressant, la coloration visible de K14 a culminé plus tôt dans les plaies saines (jour 2) par rapport aux plaies diabétiques (jour 4), démontrant ainsi que la rééchélialisation et la différenciation épidermique subséquente sont retardées dans les plaies cutanées diabétiques.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig02.jpg"> Figure 2: La coloration en montage entier révèle des taux decicatrisation perturbés chez les diabétiques par rapport aux peaux saines. (A) Méthode utilisée pour quantifier la fermeture des plaies à partir de mesures externes et internes des plaies. Des images en champ clair montrent une coloration à la kératine 14 (K14) en rouge. Bar = 300 μm. (B) Images représentatives de la guérison au fil du temps (jour après la blessure) dans une peau saine et diabétique. Bar = 500 μm. K14 = vert. DAPI = noyaux bleus. (C) Quantification des taux de fermeture des plaies (pourcentage de réétalialisation) montrant que les plaies ex vivo d’une peau saine se ferment significativement plus rapidement que les plaies ex vivo de peau diabétique. H = sain. Db = diabétique. (D) Le pourcentage de coloration K14 culmine plus tôt dans la peau saine par rapport à la peau diabétique, puis diminue en fonction de l’augmentation de la différenciation épidermique (flèches vers le bas). (E) K14 (cellule épidermique basale) coloration est perdue à mesure que l’épiderme se différencie. D = différencié. ND = non différencié. Des lignes pointillées blanches représentent les bords intérieurs et extérieurs des plaies. Flèches blanches = direction de migration. n = 6 plaies par donneur, par point temporel. Moyenne +/- SEM. * = P &lt; 0,05, ** = P &lt; 0,01 et *** = P &lt; 0,001. En bonne santé et diabétiques comparés à chaque point de temps de guérison en C (valeurP pour la comparaison la moins significative). Changement temporel de la coloration K14 par rapport au pic pour chaque donneur en D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Nous avons ensuite utilisé la coloration à montage entier pour explorer l’expression tissulaire et la localisation d’autres marqueurs pertinents pour la plaie dans la peau non diabétique (Figure 3). Tous les anticorps utilisés et leurs concentrations de travail sont indiqués dans la Table des matériaux. Les vaisseaux sanguins de la plaie ouverte se sont colorés positivement avec l’anticorps alpha de l’actine du muscle lisse (a-SMA), utilisé en association avec K14 pour délimiter les bords épidermiques dans des images de puissance inférieure(Figure 3A). La matrice dermique a été colorée avec des anticorps contre le collagène de type I (COL 1) et la fibronectine (Fn). Ici, le collagène a été observé comme des fibres épaisses abondantes tandis que les fibres de fibronectine étaient clairsemées, ondulées et minces(Figure 3A). Notre approche de coloration globale est également capable de fournir une résolution de coloration au niveau cellulaire, comme démontré pour les kératinocytes K14 positifs(Figure 3B).
Enfin, nous montrons que les plaies ex vivo humaines possèdent des cellules immunitaires résidentes, avec des cellules de Langerhans détectées autour de l’épiderme nouvellement formé au jour 3 après la blessure (Figure 3C). En effet, ces résultats suggèrent que la coloration à montage entier peut être utilisée pour étudier les caractéristiques clés de la réponse de guérison, y compris l’inflammation, la prolifération et la matrice extracellulaire(Figure 4A). Prises ensemble, nos données révèlent que la procédure combinée de blessure cutanée ex vivo et de coloration complète est une méthode valide pour évaluer divers aspects de la réparation de la peau humaine saine et diabétique (pathologique).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig03.jpg"> Figure 3: Optimisation de l’approche de coloration globale pour une utilisation avec d’autres anticorps. (A) Les vaisseaux sanguins ont été colorés avec de l’actine musculaire alpha lisse (α-SMA, vert) et de la kératine 14 (K14, rouge), tandis que les fibres matricielles ont été colorées avec du collagène I (COL 1, rouge) et de la fibronectine (Fn, vert). (B) La procédure de montage complet fournit jusqu’à la résolution de localisation au niveau de la cellule (K14, vert; K1, rouge). (C) CD1a+ve Cellules de Langerhans (vert) observées dans l’épiderme nouvellement formé. DAPI = noyaux bleus. Barre = 100 μm. Des lignes pointillées blanches montrent les bords intérieurs et extérieurs de la plaie et séparent la plaie de l’épiderme. Cette coloration a été réalisée sur une peau non diabétique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig04.jpg"> Figure 4: Validité de la procédure de coloration à montage complet pour évaluer la cicatrisation des plaies. (A) Illustration illustrant comment la technique de coloration à montage entier peut évaluer les processus pertinents pour la plaie. Anticorps utilisés = texte rouge. K14 = kératine 14. COL 1 = collagène 1. Fn = fibronectine. (B) La procédure de coloration à montage entier (flèches bleues) introduit moins de variabilité dans les mesures de fermeture de la plaie que l’analyse histologique standard (flèches rouges). S1 = section 1. WE = bord de la plaie. Barre = 300 μm. Cette coloration a été réalisée sur une peau non diabétique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Nous démontrons ici une technique optimisée pour évaluer la réparation des plaies à l’aide de peau humaine ex vivo combinée à une approche de coloration à montage complet. Cette méthodologie fournit une plate-forme préclinique pour l’évaluation des thérapies potentielles des plaies.

Modèle de plaie ex vivo humaine et approche de coloration à montage entier pour évaluer avec précision la réparation de la peau

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic ...

Dans cet article, nous présentons un protocole ex vivo optimisé pour les plaies cutanées humaines qui peut fournir des données d’efficacité importantes dans le cadre d’un pipeline translationnel clinique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une évaluation précise à haut débit de la réparation des plaies dans la peau humaine vivante. Elizabeth Roberts, chercheuse postdoctorale, et Alexandria Kidd, assistante de recherche de notre laboratoire, feront la démonstration de la procédure.Pour préparer un échantillon de tissu cutané pour la plaie, placez le derme cutané vers le bas dans une boîte de Petri de 90 millimètres et utilisez des ciseaux stériles pour enlever le tissu adipeux. Lorsque toute la graisse a été enlevée, placez la peau dans 25 millilitres de HBSS complétés par des antibiotiques pendant 10 minutes à température ambiante avec des secousses intermittentes pour éliminer tout sang résiduel dans le tissu adipeux. Après 10 minutes, rincez la peau dans 25 millilitres de DPBS.Après 10 minutes, répétez le rinçage HBSS sans antibiotiques, puis effectuez un rinçage final dans 25 millilitres de DPBS. Ensuite, placez une membrane filtrante stérile en nylon sur la pile de tampon absorbant et séchez le côté dermique de la peau sur de la gaze stérile dans une boîte de Petri de 90 millimètres pour éliminer le DPBS résiduel. Placez le derme de la peau séchée sur un couvercle de boîte de Petri propre de 90 millimètres pour éliminer tout DPBS résiduel et tamponnez l’épiderme avec de la gaze stérile fraîche.Pour créer une plaie, appuyez sur un coup de biopsie de deux millimètres contre la peau tout en maintenant la peau serrée et en la tordant doucement. À l’aide d’une pince à tissu denté incurvé, ramassez chaque côté de la plaie d’environ deux millimètres de diamètre et crochetez des ciseaux Iris incurvés sous la plaie. Utilisez un poinçon de biopsie de six millimètres pour biopsier autour de la plaie centrale de deux millimètres pour créer une explantation de six millimètres avec une plaie partielle d’épaisseur de deux millimètres au centre.Ensuite, placez l’épiderme de l’explantation de la plaie sur la pile de membranes filtrantes en nylon pour une incubation d’un à sept jours à 32 à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Pour la coloration fluorescente, recueillir les explantes de plaie dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de fixateur cutané par tube et incuber les explantes pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, remplacez le fixateur par un millilitre de tampon de lavage de coloration.Après le lavage, couvrir chaque échantillon avec environ 150 microlitres de tampon bloquant et incuber pendant une heure à température ambiante. Après avoir retiré le tampon bloquant, ajoutez 150 microlitres d’anticorps primaire dilués dans un tampon bloquant par tube et incubez les explantations de la plaie pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, rincez les échantillons avec 500 microlitres de tampon de lavage de coloration contenant 0,2% d’azide de sodium suivi de trois rinçages dans un tampon de lavage régulier.Après le lavage, ajouter 150 microlitres d’un anticorps secondaire conjugué à la florescence approprié dilué dans un tampon de lavage de coloration à chaque puits pour une incubation d’une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation, rincer l’explante trois fois pendant 30 minutes dans 500 microlitres de tampon de lavage de coloration par lavage avant de contre-tacher chaque explante avec 150 microlitres de DAPI pendant 10 minutes à température ambiante. Enfin, lavez l’explantation deux fois pendant 30 minutes avec 500 microlitres de tampon de lavage par lavage.Pour l’imagerie explant, placez une boîte de Petri de 60 millimètres sur la plate-forme d’imagerie d’un microscope confocal et ajoutez une couche d’environ un millilitre de DPBS à la boîte. Utilisez des pinces pour transférer les explantations de la plaie dans le plat. Après avoir configuré le logiciel d’imagerie approprié pour l’expérience, placez la plaie au centre du plan d’imagerie et obtenez des images des biopsies de la plaie.Pour effectuer une imagerie au microscope numérique sans fil afin d’obtenir des images de haute qualité de manière rentable, connectez un téléphone ou un ordinateur portable à un microscope numérique sans fil. Placez les explants enroulés sur un morceau de tissu de laboratoire et retirez tout tampon de lavage résiduel de l’échantillon. Positionnez ensuite l’explant au centre du champ de vision du microscope et acquérez des images à l’aide de la caméra connectée.L’immunoperoxydase et l’immunofluorescence peuvent être utilisées pour la coloration des tissus de la monture entière. En outre, la coloration vivante / morte peut être effectuée sur des tissus frais et imagée avant ou après la fixation. La coloration complète des plaies peut être utilisée pour déterminer les taux de fermeture des plaies de manière reproductible.Dans cette analyse représentative, une fermeture saine de la plaie cutanée a été observée après quatre à cinq jours, tandis que les plaies cutanées diabétiques n’ont pas réussi à se refermer complètement au cours de la période d’analyse de sept jours. L’expression de K14 a culminé le deuxième jour dans les plaies cutanées saines avant de diminuer rapidement avec une différenciation épidermique accrue. Cette réétitélialisation et la différenciation épidermique subséquente ont été retardées dans les plaies cutanées diabétiques.La reformation de la barrière épidermique précoce exclut la pénétration de l’anticorps K14 dans les couches épidermiques différenciées. Au début du processus de réépithélialisation, les kératinocytes de la couche basale K14 positive migrent vers l’intérieur sur la plaie ouverte, de sorte que l’épiderme plus proche du bord externe de la plaie se forme plus tôt que l’épiderme plus près du bord interne de la plaie. Plus tard dans la phase de réparation, la coloration K14 est perdue car l’épiderme se différencie de l’extérieur vers l’intérieur.La coloration de montage entier peut également être utilisée pour étudier l’expression et la localisation d’autres marqueurs pertinents de la plaie dans la peau, ainsi que la présence de cellules immunitaires d’intérêt sur le site de la plaie à différents stades de cicatrisation. Générer des plaies excisionnelles reproductibles peut être difficile au début. Nous vous conseillons de pratiquer la procédure de blessure en utilisant un surplus de peau.

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Un modèle chirurgical de plaie cutanée chez le rat : une approche pour les études de cicatrisation des plaies et l’évaluation des biomatériaux

Découvrez un protocole de plaie cutanée ex vivo optimisé pour évaluer avec précision la réparation tissulaire. Cette méthode permet d'étudier la ré-épithélialisation dans des échantillons de peau humaine saine et diabétique.

Modèle de plaie ex vivo humaine et approche de coloration à montage entier pour évaluer avec précision la réparation de la peau

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