Knock-in de gènes par CRISPR/Cas9 et tri cellulaire dans les lignées de macrophages et de lymphocytes T

L’objectif de ce protocole est de simplifier l’expérience d’entraînement médiée par CRISPR/Cas9 dans les lignées de macrophages et de lymphocytes T, à l’aide de rapporteurs fluorescents et d’affecter le tri cellulaire. ROSA26 Locus est connu comme un site génomique sûr pour l’insertion de transgènes. Il est habituel d’exprimer une protéine d’intérêt avec ou sans attaque dans le monde de la souris de 26 locus, ou dans l’ortho log humain.

Partie 1: Conception et construction plasmidique des sgRNA ciblant le locus Rosa26. Tout d’abord, concevez des sgRNA à partir du locus Rosa26 de la souris, en utilisant des séquences de l’informatique du génome de la souris et d’Ensemble Genome Browser, puis téléchargez la séquence génomique du gène Rosa26 de la souris. Accédez à l’outil Web en ligne, CRISPOR, collez 100 paires de bases de la séquence d’entrée du Locus Rosa26.

Sélectionnez ensuite un génome, par exemple, Mus musculus-souris génome de référence 2011. Ensuite, sélectionnez le type de PAM. Utilisez le motif NGG"PAM 20bp, reconnu par spCas9.

Cliquez sur Envoyer. Choisissez un guide avec un score de spécificité élevé, un score de performance élevé et un moins grand nombre de cibles. Les guides indiqués comme inefficaces doivent être évités.

Notamment, il est préférable de sélectionner deux guides avec des séquences qui se chevauchent, ce qui peut augmenter l’efficacité de frappe comme indiqué. Pour la séquence de repas chauds, synthétisez un avant illégal et un renversement illégal, qui recuit phosphoré et prêt pour le clonage à factoriser. Préparer la diminution linéarisée par Vactor à laquelle pourrait exprimer si je dois reporter par BBS une digestion, comme obtenir le Neal, les légaux au vecteur linéarisé pour générer la construction finale, qui exprime simultanément l’ARN guide et le noyau CAS neuf liés à un DSRIP deux reporter fluorescents.

Deuxième partie: Construction du vecteur de ciblage en tant que modèle de recombinaison homologue. Pour l’expression de la protéine d’intérêt. Par exemple, l’humain a duré.

Vous voulez synthétiser la séquence d’ADNc par source commerciale et la balise OST d’affinité ou toute autre attaque couramment utilisée pour la purification des protéines peut être fusionnée à la séquence d’ADNc. N’oubliez pas d’inclure la séquence de consensus Kazak avant le lancement de l’ADNc. Digéré par l’enzyme de restriction Asc1, et comme obtenir le CD et l’insert dans l’épine dorsale.

Vactor, à savoir pKhR26-IBFP IBP donnant le ciblage final concentre le conteneur, chacun, KB de cinq bras homologues premiers et trois premiers. L’ensemble d’expressions comprend un promoteur CG, le restaurant UST, si vous voulez la région de Koonin liée à un Iris, si VFD reporter et un poly AC fonds. Enfin, sur le vecteur de ciblage à l’horizon à l’aide d’enzymes de coupe uniques, telles que EcoR1 ou BamH1, les digestes et le produit sont purifiés dans un magasin de moins 20 degrés sur des notes d’électroporation.

Il est recommandé d’obtenir une concentration élevée d’ADN vectoriel linéarisé. Troisième partie: L’électroporation des lignées de macrophages et de lymphocytes T prépare la culture cellulaire suivie de la séparation pour les cellules Geritalk. La densité cellulaire optimale était d’environ 0,5 million de cellules par ML au moment de la transfection.

L’électroporation complète en dix formats macro little nuclear fashion tip prépare une plaque de 24 puits contenant 500 microlitres de croissance complète, milieu sans antibiotiques dans chaque puits. Précharssez les plaques dans un humidifié de 37 degrés, couvrant à 5% cet incubateur de réglage. Baissez les paramètres d’électroporation d’entrée du système d’exploitation électrique pour jet cat ou Rosales.

Préparer des suivis de mélange d’ADN cellulaire ou opérer collecter des cellules de poulet. Curchin 25 centimètres carrés flacon de cellules de transfert chez les 15 animaux. Depuis vous tube, puis Phillip les cellules par centrofugation à 90 fois G pendant huit minutes à température ambiante, demandez-le, les surnageants.

Pour le lavage, resuspendez les cellules avec les cinq PBS ML, puis faites tourner la suspension cellulaire par centrifugation en utilisant la même condition que l’étape précédente. Supprimez les DPP. Et ressuspendez les oreillers cellulaires en utilisant deux ML de DBS.

Vous restez micro petite suspension de cellule et mélangez avec le volume égal de 0,2% Trepan Ballou pour estimer l’échantillon de charge de comptage en termes de fente de comptage insérer Connie glisser dans la cellule automatisée Connor et voir l’image eux-mêmes. Obtenez ensuite un résultat de comptage de cellules. Calculer 2 millions de cellules trouvera des réputations d’électroporation par expérience de frappe transférer le nombre de cellules dans 1,5 ML.Centrifuger deux cellules à granulés par centrifugation.

Pour gagner du temps, un mélange d’électroporation peut être préparé pendant la centrifugeuse qui ajoute 2,5 microgrammes de chacun des neuf vecteurs CRISPR CAS 2,4 microgrammes de riz Belinda, vecteur bavard, et ressaison Buffalo. Notre volume total total de 55 macro litières dans un nouveau tube centrifuge de 1,5 ML vertéxe doucement et. Tenez-vous brièvement debout pour bien mélanger.

Laisser le mélange sous pression louxor et la température ambiante avant utilisation. Après avoir filé l’asparte, le DTB est essentiellement ce fusible pendant 30 secondes supplémentaires, retirez autant de surnageant que possible des cellules de suspension en ajoutant doucement la pipette de mélange d’électroporation préparée de haut en bas. L’électroporation demandée pour le mélangeur d’électroporation de cellule utilisant 10 micro petite pointe de faction nucléaire était des pipettes importantes.

Évitez les bulles d’air pendant la mise en place, cela coûtera une défaillance de la galvanoplastie. Appuyez sur Démarrer. après quoi l’opération transfère l’échantillon en un certain temps.

Puits de 24, les plaques de puits avec un pré-avertissement du milieu brut effectuent la même pression électrique et les mêmes procédures que ci-dessus sur les quatre échantillons répliqués restants, bercent doucement la plaque pour assurer une distribution uniforme des cellules. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 degrés pendant 48 à 72 heures. Avant les faits, le tri cellulaire À 24 heures après la transfection, examiner l’expression de disrupt two pour le journaliste de restaurant en utilisant la microscopie fluorescente détachée du représentant pour nous-mêmes indique que l’électroporation fonctionne correctement.

Partie 4: tri des cellules pour isoler les cellules knock-in putatives. Avant le tri cellulaire préparer, dans 96 plaques de puits avec 150 micro peu de milieu brut spécifique de type cellulaire par puits utiliser mauvais micro endroit inférieur pour la culture et lui-même et le micro endroit à fond plat pour toutes les cellules transférer les cellules dans un FACS stérile pour garder le tube sur la glace et mettre la boîte dans le chemin à travers la fenêtre, Connexion à la salle de tri cellulaire le cas échéant régler le trieur de cellules avec une buse de 85 micromètres et un faible débit pour le tri des cellules immunitaires afin d’obtenir une évaluabilité et une survie cellulaires optimales, prélever des échantillons du sommet de la fenêtre de passage brièvement et charger l’échantillon dans les acquisitions. Champer a mis en place un patinage de faits pour le tri cellulaire d’abord défini des entonnoirs de vente pour la dispersion Ford et la dispersion latérale, puis définir les cellules de vie en gagnant l’ensemble parle des cellules rouges négatives.

Ensuite, ils trouvent une cellule unique vivante par un seul contrôle unique en utilisant le FSC H par rapport à FSE un bloc multi-varié. Enfin, définissez une porte pour les DSR souhaités deux et B si la sous-population positive volvo, ce qui indique que les cellules ont réussi à se transfecter avec le vecteur CRISPR et le vecteur de poche. Ainsi, 10 cellules simples dans chaque puits des 96, plaque de puits complétée par le pré-préchauve, le milieu de croissance complet en utilisant le mode période ou le mode cellule unique après tri incubent les 96 plaques de puits dans l’incubateur de culture cellulaire pour l’expansion cellulaire.

Cinquième partie: dépistage de l’élévation des cellules knock-in positives Après environ deux semaines d’expansion cellulaire après la survie, les cellules de la plaque de 48 puits évaluent l’expression de la BFP ou de la cytométrie en flux en utilisant une petite proportion de proliférer elle-même en utilisant les cellules de type paroi comme populations de cellules témoins négatives, possédant un pourcentage plus élevé de cellules BFP positives sont conservées pour remplir la validation extraire l’ADN génomique des cellules que nous devrions exprimer Les BFP transmettent l’ADN génomique isolé par PCR avec des amorces couvrant chaque côté des bras homologues, à savoir une localisation primaire dans la séquence génomique, à l’extérieur du vecteur cible. Le côté vu de parler au vecteur dans cette expérience, la taille prédite du produit PCR amplifié avec le primaire est de 1,2 KV. Et avec F deux et R deux est 1,2 Ko résultats de séquençage de Sanger. Ainsi, les produits PCR montrent les séquences de chaque jonction d’intégration démontrant la position correcte et de frappe dans le Rosa 26 Lucas.

Je dis comme immuno blotting permet la validation du cognement correct au niveau de la protéine partie six résultats représentatifs. À titre d’exemple, publié dans une étude précédente, nous avons exprimé que 45 molécules tack que l’inter avec une étiquette OSD, et il y avait un 26 locus dans les cellules T de paiement par la suite USD tact. J’obtiens 45 et des directeurs d’incident ou tirés vers le bas par purification d’affinité et un sujet à la spectrométrie de masse.

Les données protéomiques ont révélé l’interaction des lymphocytes T. Par conséquent, ce pool de produits a grandement facilité la recherche de nouveaux intercalateurs pour élucider la fonction d’une protéine donnée. Cette présentation technique a montré que par augmentation transitoire de l’appel d’offres par ligne de coulée avec le vecteur parlant co-exprimé et BFP pour le locus Rosa 26.

Nous avons généré des lignées cellulaires de frappe avec une expression génique permanente dans les cellules T et les macrophages, qui sont difficiles à réaliser dans les manipulations génétiques. Ces méthodes et recommandations sont applicables à Chris autorisé dans les affirmations de grand segment d’ADN pour les études mécanistes des cellules immunitaires, telles que pour l’identification des protéines, l’étude de l’interaction protéique.