Name: Isolement des adipocytes bruns du tissu adipeux brun interscapulaire murin pour l’analyse de l’expression génique et protéique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Découvrez un protocole efficace d'isolement d'adipocytes bruns à partir de tissu adipeux brun murin utilisant la digestion enzymatique et la séparation par densité à l'iodixanol. Cette méthode permet des analyses précises de l'expression génique et protéique.

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Z. Lin a été soutenu par les fonds des National Institutes of Health HL138454-01 et du Masonic Medical Research Institute.

Toutes les souris ont été maintenues dans des conditions exemptes d’agents pathogènes et toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de la recherche médicale maçonnique. UCP1::Cre9 et Rosa 26tdLes lignées de souris Tomato13 ont été signalées précédemment. Toutes les souris ont été maintenues à température ambiante avec un cycle lumière/obscurité de 12 h.
1. Préparation des solutions et du tissu adipeux brun (MTD)
<ol><li>Préparer la solution de digestion et la solution de séparation dans des tubes à centrifuger de 15 mL.</li>
	<li>10 mL de solution de digestion BAT : À 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile, ajouter 3,5 mg/mL de Dispase II, 1 mg/mL de collagénase II et 10 mM de CaCl2 pour obtenir une solution de digestion BAT.</li>
	<li>10 mL de solution d’iodixanol à 12 % (solution de séparation) : Mélanger 1 mL de PBS 10x, 2 mL d’iodixanol à 60 %, 0,01 mL de 1 M MgCl2, 0,025 mL de 1 M KCl, 0,1 mL d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) 0,2 M et 6,865 mL de ddH2O pour obtenir12% d’iodixanol.</li>
	<li>Euthanasier une souris adulte avec une surdose de CO2 . Brièvement, remplissez la cage de la souris avec 100% de CO2 à un taux de déplacement de 10-30% du volume de la cage par min. 5 min plus tard, confirmez la mort en vérifiant l’absence de respiration visible.</li>
	<li>Disséquez l’animal et collectez les MTD interscapulaires. Retirez WAT et les couches musculaires au microscope stéréoscopique.</li>
	<li>Pour avoir une digestion suffisante, couper chaque lobe de la MTD en ~ 3 mm3 parties et les placer dans une fiole propre de 50 ml avec une barre d’agitation métallique et une solution de digestion de 5 ml. Avant de commencer la digestion, laisser reposer la fiole contenant la MTD et le tampon de digestion sur la glace pendant 1 h. REMARQUE: Dans les étapes suivantes, environ 80 mg de BAT ont été utilisés pour l’isolement des adipocytes bruns.</li>
</ol>2. Procédure d’isolement des BA
<ol><li>Placer la fiole sur un agitateur magnétique enfermé dans un incubateur. Réglez la vitesse d’agitation à 60 tr/min et la température de l’incubateur à 35 °C, respectivement. La digestion durera environ 30 min. Si les tranches de MTD forment des amas autour de la barre d’agitation pendant la digestion, utilisez un embout de pipette de 1 mL pour perturber les tissus agrégés.</li>
	<li>Placez un filtre à crépine de 70 μm sur un tube à centrifuger propre de 50 mL. Pipeter environ 4 ml de suspension cellulaire à travers la passoire. Laver la crépine avec 4 mL de solution d’iodixanol à 12%. Pipeter de haut en bas pour mélanger les cellules et la solution d’iodixanol. Transférer le mélange de cellules dans deux tubes à essai en polystyrène transparent de 5 mL. REMARQUE: À la fin de la digestion, la solution de digestion doit être trouble, indiquant une digestion suffisante. Utilisez une solution de digestion fraîche à chaque fois. Une fois préparée, la solution de digestion doit être utilisée dans les 2 heures.</li>
	<li>Répétez les étapes 2.2 et 2.3 une fois de plus si la digestion n’est pas suffisante.</li>
	<li>Laisser les tubes en polystyrène transparent contenant la solution de séparation et les BA sur la glace pendant 1 h. Les BA formeront une couche sur le dessus.</li>
	<li>Retirer 20 μL des BA isolés pour l’examen au microscope.</li>
</ol>3. Isolement de l’ARN et des protéines des BA
<ol><li>Pipeter la couche BA dans deux tubes microcentrifugés de 1,7 mL pour l’isolement de l’ARN et des protéines. Retirez soigneusement la solution excessive d’iodixanol sans perturber la couche BAs.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de Trizol pour isoler simultanément l’ARN, l’ADN et la protéine dans la solution cellulaire. Mélanger suffisamment pour lyser les cellules.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de chloroforme pour séparer les phases.</li>
	<li>Centrifuger le tube pendant 9 981 x g pendant 10 min à 4 °C.</li>
	<li>Après centrifugation, utiliser la phase aqueuse pour l’isolement de l’ARN. Dans cette étude, l’ARN total a été utilisé pour la transcription inverse, et la RT-PCR quantitative a été réalisée avec la PCR en temps réel. Les séquences d’amorces sont énumérées dans le tableau des matériaux.</li>
	<li>Transférer 300 μL de la phase organique dans un tube microcentrifuge de 2 mL.</li>
	<li>A la phase organique, ajouter 2,5 volume 100% éthanol et vortex pendant 10 s.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de 1-Bromo-3-chloropropane et vortex pendant 10 s.</li>
	<li>Ajouter 600 μL d’eau bidistillée et vortex pendant 10 s.</li>
	<li>Laisser reposer la solution mélangée pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Centrifuger à 9 981 x g pendant 10 min à 4 °C. À cette étape, les phases seront séparées. La phase protéique est localisée dans la couche intermédiaire.</li>
	<li>Retirer la solution aqueuse supérieure. Ajouter 1 mL d’éthanol à 100 % dans la solution restante.</li>
	<li>Centrifuger pendant 10 min, 9 981 x g, 4 °C. Après centrifugation, la pastille de protéine se forme. Jetez le surnageant.</li>
	<li>Lavez la pastille avec 1 ml d’éthanol 100 %.</li>
	<li>Centrifuger pendant 10 min, 9981 x g, 4 °C. Conservez la pastille et jetez le surnageant.</li>
	<li>Sécher le granulé à l’air pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Mesurer le poids de la pastille humide. Ajouter une solution de SDS à 1 % dans un rapport de 20 μL/mg de granulés.</li>
	<li>Dissoudre la pastille en mettant le tube dans un shaker chauffé. Réglez la température à 55 °C et la vitesse à 11 x g. Il faut généralement 5 à 10 minutes pour dissoudre complètement la pastille de protéine. NOTE: La concentration de la protéine dissoute peut être mesurée par le dosageBCA 14.</li>
</ol>

<ol><li>Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical%2C+physiological%2C+and+functional+diversity+of+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue.</a> Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).</li>
<li>Symonds, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue+growth+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Scientifica%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue growth and development.</a> Scientifica. 2013, Cairo. 305763(2013).</li>
<li>Giralt, M., Villarroya, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White%2C+brown%2C+beige%2Fbrite%3A+Different+adipose+cells+for+different+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions.</a> Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).</li>
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<li>Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iodixanol%3A+A+nonionic+iso-osmotic+centrifugation+medium+for+the+formation+of+self-generated+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients.</a> Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).</li>
<li>Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+senescent+cells+by+iodixanol+%28OptiPrep%29+density+gradient-based+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation.</a> Cell Proliferation. 52, 12674(2019).</li>
<li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((versatile+manufacturing+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+at+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale.</a> Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).</li>
<li>Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELi+protocol%3A+Optimization+for+protein+extraction+from+white%2C+brown%2C+and+beige+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues.</a> MethodsX. 6, 918-928 (2019).</li>
<li>Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invited+Review%3A+effects+of+heat+and+cold+stress+on+mammalian+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression.</a> Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).</li>
<li>Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+autonomous+myogenic+cell+populations+revealed+by+ablation+of+Myf5-expressing+cells+during+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis.</a> Development. 135, 1597-1604 (2008).</li>
</ol>

Dans cette étude, une nouvelle méthode d’isolement des BA pour l’analyse de l’expression des gènes et des protéines a été développée.
Dans un protocole d’isolation BAs publié, une solution BSA à 3% a été utilisée pour enrichir les BA12. Néanmoins, les BA enrichis obtenus par ce protocole publié n’ont pas pu être directement utilisés pour l’analyse de l’expression protéique. En effet, le BSA concentré existant dans la solution de BAs interfère avec l’extraction des proté...

Les souris et les humains ont deux types de tissus adipeux : le tissu adipeux blanc (WAT) et le tissu adipeux brun (MTD)1. WAT stocke l’énergie sous forme de triglycérides dans les adipocytes blancs, et les adipocytes bruns (BA) de BAT dissipent l’énergie chimique sous forme de chaleur2. En fonction de leur origine développementale, les BA sont ensuite classés en BA classiques (cBA) qui se sont formés au cours du développement embryonnaire et en BA dérivés d’adipocytes blancs (cellules beiges / brite, converties à partir d’adipocytes blancs dans des conditions de stress)3. Les BA sont multiloculaires et expriment la protéine thermogénique de découplage 1 (UCP1)4. Le dépôt de MTD interscapulaire (iBAT) est l’un des principaux dépôts de cBA chez les petits mammifères5, tandis que les cellules beiges sont dispersées dans WAT6. 
En raison de leur nature de dissipation de l’énergie, les BA ont reçu beaucoup d’attention en tant que cible thérapeutique pour réduire l’obésité7. Pour exploiter les BA dans le but de traiter l’obésité, il est essentiel de comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent la fonction, la survie et le recrutement des BA. Les tissus adipeux, y compris la MTD et la WAT, sont hétérogènes. À l’exception des adipocytes, les tissus adipeux contiennent de nombreux autres types de cellules, telles que les cellules endothéliales, les cellules souches mésenchymateuses et les macrophages8. Bien qu’il existe des outils génétiques pour épuiser spécifiquement les gènes candidats chez les souris BA, tels que UCP1::Cre line9, les techniques de purification des BAT ou WAT sont limitées, ce qui rend difficile l’étude des BA au niveau d’un type unicellulaire. De plus, sans obtenir des BA purs, la relation entre les BA et les non-BA ne sera pas clairement définie. Par exemple, le récepteur alpha du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFRα) a été utilisé comme marqueur pour les cellules mésenchymateuses indifférenciées, et il est exprimé dans les cellules endothéliales et interstitielles de la MTD. Dans les MTD soumises à un stress froid, les cellules progénitrices PDGFRα positives donnent naissance à de nouveaux BAs10. PDGFRα est activé par son ligand PDGF, un facteur de croissance qui régule la croissance et la prolifération des cellules mésenchymateuses11; cependant, il n’est pas clair si les BA influencent le comportement des cellules progénitrices PDGFRα positives en sécrétant PDGF. 
Récemment, un protocole d’isolement des BA a été publié, basé sur le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)12. Dans ce protocole, une solution d’albumine sérique bovine (BSA) à 3 % a été utilisée pour séparer les BA des non-BA, et les BA enrichies ont été purifiées par FACS. L’application de ce protocole est limitée par l’exigence du processus FACS, qui repose à la fois sur l’équipement et sur l’expérience d’exploitation du FACS. Dans cette étude, un nouveau protocole pour isoler les BA des MTD a été développé. Les BA isolés par ce protocole peuvent être directement utilisés pour des études d’expression génique et protéique. De plus, les données de cette étude suggèrent que les AB sont une ressource importante du FGPD.

<table><tbody><tr><td><Anticorps forts></forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><>antigène</forts><</td><td>forts>entreprise</forts></td><td><forts>Catalog</forts></td><td></td></tr><tr><td>PPAR&gamma ;</td><td>LSBio</td><td>Ls-C368478</td><td></td></tr><tr><td>PDGFRa</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-398206</td><td></td></tr><tr><td>UCP1</td><td>R& Système D</td><td>IC6158P</td><td></td></tr><tr><td><fort>Chimique et solutions</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Collagénase, type II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>1-Bromo-3-chloropropane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B62404</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)&nbsp ;</td><td>Goldbio</td><td>A-421-10</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Bio Basic</td><td>CT1330</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>IBI Scientific</td><td>IB05040</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, protéase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5693</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio Basic</td><td>EB0107</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>IBI Scientific</td><td>IB15724</td><td></td></tr><tr><td>LiQuant Universal Green qPCR Master Mix</td><td>LifeSct</td><td>LS01131905Y</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>Boston BioProducts</td><td>P-855</td><td></td></tr><tr><td>OneScrip Plus Synthèse d’ADNc SuperMix</td><td>ABM</td><td>G454</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep (Iodixanol)</td><td>Cosmo Bio USA</td><td>AXS-1114542</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL07</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL06</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Boston BioProducts</td><td>P-1435</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue safe Stain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Dodecyl sulfate de sodium (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de trizol</td><td>Technologies de la vie</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nom du gène (Species)&nbsp ;</td><td>Forward</td><td>Reverse</td><td></td></tr><tr><td>Pdgfra (Souris)</td><td>CTCAGCTGTCTCCTCACAgG</td><td>CAACGCATCTCAGAGAAAAGG</td><td></td></tr><tr><td>Pdgfa (Souris)</td><td>TGTGCCCATTCGCAGGAGAGA</td><td>TTGGCCACCTTGACACTGCG</td><td></td></tr><tr><td>36B4(Souris)</td><td>TGCTGAACATCTCCCCCTTC</td><td>TCTCCACAGACAATGCCAGGAC</td><td></td></tr><tr><td>Ucp1</td><td>ACTGCCACACCTCCAGTCATT</td><td>CTTTGCCTCACTCAGGATTGG</td><td></td></tr><<tr><td> strong>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Application</td><td></td></tr><tr><td>Keyence BZ-X700</td><td>Keyence</td><td>Imaging adipocytes</td><td></td>bruns</tr><tr><td>Agitateur magnétique</td><td>VWR</td><td>Dissociate BAT</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex Système de PCR en temps réel</td><td>Appliqué Biosystème</td><td>PCR</td><td></td>quantitative</tr><tr><td>L’Odyssey Fc Système d’imagerie</td><td>LI-COR</td><td>Western blot immaging</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement des adipocytes bruns du tissu adipeux brun interscapulaire murin pour l’analyse de l’expression génique et protéique

Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis

Le tissu adipeux brun (MTD) est responsable de la thermogenèse non frissonnante chez les mammifères, et les adipocytes bruns (BA) sont les unités fonctionnelles des MTD. Les BA contiennent à la fois des gouttelettes lipidiques multiloculaires et des mitochondries abondantes, et ils expriment la protéine de découplage 1 (UCP1). Les BA sont classés en deux sous-types en fonction de leur origine : les BA classiques dérivés d’embryons (ABAc) et les BA dérivés d’adipocytes blancs. En raison de leur densité relativement faible, les BA ne peuvent pas être isolés des MTD avec la méthode de centrifugation traditionnelle. Dans cette étude, une nouvelle méthode a été développée pour isoler les BA de souris pour l’analyse de l’expression des gènes et des protéines. Dans ce protocole, les MTD interscapulaires de souris adultes ont été digérées avec une solution de collagénase et de dispase, et les BA dissociés ont été enrichis avec une solution d’iodixanol à 6%. Les BA isolés ont ensuite été lysés avec le réactif Trizol pour l’isolement simultané de l’ARN, de l’ADN et des protéines. Après isolement de l’ARN, la phase organique du lysat a été utilisée pour l’extraction des protéines. Nos données ont montré que la solution d’iodixanol à 6% enrichissait efficacement les BA sans interférer avec les études de suivi sur l’expression des gènes et des protéines. Le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) est un facteur de croissance qui régule la croissance et la prolifération des cellules mésenchymateuses. Par rapport au tissu adipeux brun, les BA isolés avaient une expression significativement plus élevée de Pdgfa. En résumé, cette nouvelle méthode fournit une plate-forme pour étudier la biologie des adipocytes bruns au niveau d’un seul type cellulaire.

Préparation de la MTD interacapulaire pour l’isolement des adipocytes bruns Le processus d’isolement des adipocytes bruns (BA) est illustré à la figure 1A. L’ensemble du processus, de la préparation des MTD et des solutions de digestion/séparation à l’obtention de BA isolés, prendra environ 4 h.
Chez les souris adultes, la MTD abondante existe dans la région interscapulaire. Cette MTD interscapulaire (iBAT) est recouverte de couches musculaires...

Cette étude décrit une nouvelle méthode d’isolement des adipocytes bruns murins pour l’analyse de l’expression des gènes et des protéines.

Isolement des adipocytes bruns du tissu adipeux brun interscapulaire murin pour l’analyse de l’expression génique et protéique

Brown adipose tissue (BAT) is responsible for non-shivering thermogenesis in mammals, and brown adipocytes (BAs) are the functional units of BAT. BAs ...

Pour étudier les aspects biologiques du tissu adipeux brun, il est essentiel de nettoyer la taille adipeuse brune purifiée. Actuellement, aucune purification de taille adipeuse brune n’est venue et les masses sont disponibles. Dans cette étude, nous avons élaboré un protocole simple pour résoudre ce problème.Maintenant, une compétence est requise pour ce protocole. Il nécessite beaucoup moins de matériaux d’étude que d’autres méthodes et la taille adipeuse brune purifiée peut être directement utilisée pour l’analyse de l’expression des gènes et des protéines. Ce protocole fournit une nouvelle méthode pour étudier la biologie de la taille adipeuse brune classique.Il peut également être appliqué pour étudier le processus de brunissement des adipocytes blancs. La démonstration de la procédure sera Amanda, une assistante de recherche de mon laboratoire. Commencez par placer la fiole contenant la MTD et la solution de digestion sur un agitateur magnétique à 60 rotations par minute dans un incubateur à 35 degrés Celsius pendant 30 minutes.Utilisez une pipette d’un millilitre pour perturber les amas de tissus agrégés de tranches de MTD autour de la barre d’agitateur. Après la digestion, placez un filtre de crépine de 70 micromètres sur un tube à centrifuger propre de 50 millilitres et pipette environ quatre millilitres de suspension cellulaire à travers la crépine. Ensuite, lavez-le avec quatre millilitres de solution d’iodixanol à 12%.Pipeter de haut en bas pour mélanger les cellules avec une solution d’iodixanol, puis transférer le mélange de cellules dans deux tubes à essai en polystyrène transparent de cinq millilitres. Placez les tubes de polystyrène contenant le mélange cellulaire sur de la glace pendant une heure, ce qui provoque la formation d’une couche sur le dessus des BA par les BA. Retirez 20 microlitres des BA isolés pour l’examen au microscope.Pour l’isolement de l’ARN et des protéines, pipeter la couche BA dans deux tubes microcentriques de 1,7 millilitre. Ensuite, retirez délicatement la solution iodixonale excessive sans perturber la couche BA. Ensuite, ajoutez un millilitre de TRIzol dans la solution cellulaire pour isoler simultanément l’ARN, l’ADN et les protéines et mélanger suffisamment pour lyser les cellules.Pour séparer les phases, ajoutez 200 microlitres de chloroforme et centrifugez dans le tube à 9 981 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, utiliser la phase aqueuse pour l’isolement de l’ARN. Transférez 300 microlitres de la phase organique dans un tube microcentrifuge de deux millilitres et ajoutez 750 microlitres d’éthanol à 100%.Après avoir vortex pendant 10 secondes, ajoutez 200 microlitres de 1-Bromo-3-chloropropane et vortex à nouveau pendant 10 secondes. Ajouter 600 microlitres d’eau distillée double avant de vorer pendant 10 secondes. Laisser reposer la solution mélangée pendant 10 minutes à température ambiante.Après centrifugation, ajouter 9,981 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Les phases seront séparées avec la phase protéique localisée dans la couche intermédiaire. Retirer la solution aqueuse supérieure et ajouter un millilitre d’éthanol à 100% dans la solution restante.Après centrifugation à 9, 981 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, jeter le surnageant et laver la pastille avec un millilitre d’éthanol à 100%. Centrifuger à 9, 981 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir retiré le surnageant, sécher à l’air libre le granulé pendant 10 minutes à température ambiante et mesurer le poids du granulé humide.Ajouter une solution de FDS à 1% dans un rapport de 20 microlitres par milligramme de granulés. Dissoudre complètement la pastille en mettant le tube dans un shaker chauffé à 55 degrés Celsius et 11 G pendant cinq à 10 minutes. Dans le protocole, du PBS contenant 3 % de BSA a été utilisé pour séparer les BA des MTD.Les cellules isolées étaient en forme de framboise avec des gouttelettes lipidiques multiloculaires à l’intérieur et étaient tdTom positives, confirmant qu’il s’agissait de BA. La protéine a été isolée des BA avec un protocole GTPC amélioré et a ensuite été examinée avec un gel SDS-PAGE. Une bande dominante associée à la BSA a été observée dans l’échantillon de BA, suggérant son interférence dans l’extraction des protéines.Pour éviter les interférences BSA, une solution iodixonal à 6% a été utilisée pour l’isolement des BA, qui avaient une forme typique de framboise et contenaient des gouttelettes lipidiques multiloculaires. Les protéines extraites de ces BA ont été bien séparées dans le gel SDS-PAGE. Ces cellules se sont avérées tdTomato positives alors que les cellules récupérées à partir de la pastille étaient tdTomato négatives sans gouttelettes lipidiques évidentes, suggérant une séparation efficace des BA des cellules non adipeuses.Dans l’analyse de l’expression génique, les niveaux d’ARNm de UCP1 et PDGFA étaient significativement plus élevés dans les BA isolés. Mais l’ARNm de PDGFRA n’a été détecté que dans les MTD. La protéine UCP1 a été trouvée enrichie dans des BA isolés.L’EDGFR alpha a été détecté dans les MTD, mais pas dans les BA isolées. Ces résultats confirment l’efficacité de la méthode d’isolement des BA et démontrent que les BA isolés conviennent aux études d’expression génique et protéique. Lorsque vous essayez ce protocole, utilisez un tampon de digestion frais pour dissocier le tissu adipeux brun et éviter la formation d’amas tissulaires pendant la période de digestion.Cette nouvelle méthode facilite l’étude de la biologie du tissu adipeux brun au niveau du robinet unicellulaire. En appliquant cette méthode, on peut effectuer des études d’expression GN et protéique avec des adipocytes bruns purs disséquant précisément le programme d’expression génique des adipocytes bruns, sans se soucier de la contamination à l’origine par des cellules non adipeuses.

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