Préparation de lamelles à partir d’échantillons biologiques vitreux à l’aide d’un microscope électronique à balayage à double faisceau pour la cryotomographie électronique

Ce protocole décrit la préparation de lamelles vitrées de globules rouges infectés par Plasmodium-falciparum pour la cryotomographie électronique. Cela permet d’observer directement des informations structurelles détaillées sur la façon dont le parasite cause le paludisme. La cryotomographie électronique enregistre des informations à haute résolution sur l’intérieur des cellules.

Il est assez puissant pour observer des complexes protéiques uniques in situ, qui peuvent être extraits et moyennés par calcul pour révéler des informations structurelles tridimensionnelles sur les protéines. Ce protocole peut être facilement adapté à différents types de cellules et peut être un point de départ pour quelqu’un de nouveau dans la production de lamelles vitreuses pour la cryo-tomographie électronique. Il s’agit d’Alejandra Carbajal, qui appliquera le protocole aujourd’hui.

Pour commencer, filtrez les grilles de cuivre gelées à l’aide d’un CryoStage pour un microscope optique avec une attention particulière au gradient de glace à travers la grille. Vérifiez les carrés de la grille individuelle pour la couverture cellulaire dans les zones les plus minces de la glace. Utilisez un marqueur noir indélébile pour marquer l’avant et le côté opposé des jantes Autogrid spécifiques à Cryo-FIB-SEM.

Chargez la grille clipsée dans la navette Cryo-FIB-SEM avec le côté carbone vers le haut et appliquez une couche rotative de carbone ou de platine à faisceau électronique de quatre nanomètres d’épaisseur à la surface des cellules. Chargez la navette dans le Cryo-FIB-SEM et évaluez la distribution des cellules sur chaque grille par MEB à cinq kilovolts. Prenez une vue d’ensemble à faible grossissement à 100 puissance pour examiner les gradients de glace sur la grille.

Ensuite, prenez des images à fort grossissement à 5 000 pour regarder les carrés individuels de la grille. Appliquez une couche organoplatine de deux micromètres à la surface de chaque grille en insérant l’aiguille du système d’injection de gaz dans la chambre au-dessus de la grille et en réchauffant la source organoplatine à une température définie pendant un temps défini pour produire un flux de vapeur. Pour observer l’échantillon, inclinez l’échantillon de sorte que le plan de la grille soit à environ 10 degrés de l’angle d’incidence du faisceau d’ions et déplacez le centre d’un carré de grille approprié pour être vu dans les images SEM et FIB.

en utilisant le faisceau d’ions à faible courant, Examinez la grille à fort grossissement pour visualiser les cellules au centre d’un carré de grille. Marquez deux motifs rectangulaires à fraiser, l’un au-dessus et l’autre au-dessous d’une région protégée de trois micromètres d’épaisseur. Choisissez ensuite les réglages du faisceau et corrigez l’astigmatisme en ajustant la luminosité et le contraste.

une fois la configuration terminée, commencez à fraiser à un courant de 300 picoampères tout en surveillant la progression en direct dans la vue du faisceau d’ions et par intermittence par MEB. L’échantillon est vérifié dans la vue MEB et après le premier fraisage, Si le faisceau d’ions n’a pas traversé l’échantillon au-dessus et au-dessous de la région protégée, enlever plus de matière en augmentant la hauteur des motifs rectangulaires. Arrêtez le fraisage lorsque la surface au-dessus et au-dessous de la lamelle est complètement lisse dans la vue du faisceau d’ions.

Répétez le processus de fraisage par étapes, en réduisant le courant du faisceau d’ions à chaque fois jusqu’à ce qu’une épaisseur de 300 nanomètres soit atteinte. Notez la position X Y Z de chaque lamelle. Pour polir les lamelles à la fin de l’expérience, utilisez une vue d’ensemble SEM à faible grossissement pour sélectionner un groupe de lamelles à polir et marquer la racine de polissage.

Une fois la racine de polissage marquée, réduisez l’espace entre les deux motifs rectangulaires à 100 à 200 nanomètres et commencez le polissage à un courant de faisceau d’ions de 30 picoampères. Surveiller la progression par SEM à deux ou trois kilovolts. Arrêtez le polissage lorsque le contraste dans la lamelle est perdu par SEM ou lorsque la couche organoplatine ou la lamelle elle-même commence à perdre son intégrité.

Acquérir et enregistrer des images SEM à faible grossissement de chaque lamelle. Une fois l’expérience terminée, retirez la navette du microscope. Retirez les grilles avec des lamelles et conservez-les sous azote liquide.

Manipulez les grilles avec soin. Pour étudier la morphologie, les schizontes ont été bloqués à différents stades de sortie en utilisant le composé deux dans les inhibiteurs E-64. En présence du composé deux, la limite entre les membranes parasites et l’hémoglobine environnante dans le globule rouge hôte était bien définie.

Les vacuoles parasitophores intactes, ou PV, étaient emballées avec des mérozoïtes dans un seul groupe de cristaux d’hémozoïne. Lorsque les deux schizontes synchronisés composés ont été lavés dans E-64, la membrane PV a été rompue et les mérozoïtes se sont répandus dans le globule rouge. Un exemple typique de bonne distribution cellulaire sur une grille de cuivre montre de gros globules rouges avec une périphérie bien définie et une membrane vacuole intacte.

Dans un globule rouge hôte partiellement effondré, les mérozoïtes individuels ont été visualisés comme de petits groupes de cellules. Chaque schizonte avait une tache noire en son centre indiquant la position des cristaux d’hémozoïne. Après le broyage, les grilles ont été chargées dans le TEM pour identifier les positions des lamelles et trouver des zones appropriées à cibler par tomographie.

Dans l’échantillon micrographique, on peut voir un globule rouge récemment envahi par un mérozoïte. Le mérozoïte entouré par la membrane dérivée de la cellule hôte pouvait être vu à l’intérieur des limites du globule rouge. À l’extrémité apicale du mérozoïte, les deux membranes entourant la cellule et les quatre membranes empilées au sommet du mérozoïte associées à une caractéristique en forme de champignon dense en électrons étaient clairement visibles.

Dans le cytoplasme du mérozoïte, un événement de fusion entre la membrane plasmique du mérozoïte et une vésicule multicouche a été identifié. Dans une analyse TEM supplémentaire d’une lamelle de 230 nanomètres d’épaisseur, la morphologie typique d’un mérozoïte mature traité avec E-64 a été observée. Dans la membrane des globules rouges, la membrane plasmique mérozoïte peut être vue avec des organites comme le complexe de membrane interne, les anneaux polaires, les micronèmes, les rhoptries et l’enveloppe nucléaire.

La partie la plus importante de cette technique est l’optimisation des grilles pour permettre une production reproductible et efficace de lamelles minces. Le développement ultérieur de cette technique permettra aux chercheurs de visualiser les molécules monoprotéiques dans les parasites du paludisme et de déterminer leur rôle dans l’évacuation du paludisme.