Name: Analyse des modèles de motilité du stentor pendant et après la régénération de l’appareil buccal à l’aide du suivi cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse quantitative de la motilité de Stentor coeruleus pendant la régénération de l'appareil buccal. Ce protocole combine microscopie en time-lapse et suivi automatisé pour étudier la récupération fonctionnelle.

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Ce travail a été soutenu, en partie, par le Marine Biological Laboratory Whitman Early Career Fellowship (JYS). Nous remercions Evan Burns, Mit Patel, Melanie Melo et Skylar Widman pour leur aide dans l’analyse préliminaire et les tests de code. Nous remercions Mark Slabodnick pour ses discussions et ses suggestions. WFM reconnaît le soutien de la subvention R35 GM130327 des NIH.

NOTE: Une population d’environ cent cellules de S. coeruleus a été cultivée conformément à un protocole JoVE8 publié précédemment.
1. Préparation de l’échantillon
<ol><li>Coupez un morceau de feuille d’espacement en silicone de 250 μm d’épaisseur (table des matériaux) légèrement plus petit en hauteur et en largeur qu’une lame de microscope. À l’aide d’un poinçon de trou de 5/16 », créez des puits circulaires. Veillez à laisser suffisamment d’espace entre les puits voisins pour assurer une bonne étanchéité. NOTE : Un espace de 3 mm entre les puits voisins s’est avéré suffisant. Avec de la pratique, dix puits peuvent être placés sur une seule lame d’échantillon.</li>
	<li>Initier la régénération de l’arthrose en incubant les cellules dans 10 % de saccharose ou 2 % d’urée pendant 2 min (Figure 1A). Ensuite, laver trois fois avec du milieu frais8. Pipettez doucement environ dix Stentor dans chaque puits. Veillez à ce que le volume de l’échantillon corresponde le plus possible au volume du puits. REMARQUE : Pour les dimensions de puits utilisées ici, 12,5 μL d’échantillon ont été pipetés dans chaque puits.</li>
	<li>Fermez les puits en abaissant doucement un morceau de verre de couverture (voir Tableau des matériaux) sur les puits à partir d’un bord. Utilisez un objet étroit et légèrement flexible, tel qu’une pointe de pipette de 10 μL, pour appuyer sur le verre de couverture à l’endroit où il entre en contact avec la feuille de silicone, afin d’assurer une bonne étanchéité.</li>
</ol>2. Time-lapse de microscopie à lumière visible
<ol><li>Placez l’échantillon sur la scène du microscope et réglez le grossissement au plus bas disponible de sorte que l’un d’eux tienne bien dans le cadre dans son intégralité. REMARQUE: Un adaptateur de caméra 1,6x et un grossissement 1x sur l’objectif ont été utilisés sur le microscope pour ce protocole.</li>
	<li>Commencez le time-lapse. Acquérir une vidéo de 10 s à 30 images par seconde de chaque puits à chaque point temporel. Si vous utilisez une configuration de microscope avec un étage X-Y motorisé, automatisez l’ensemble du time-lapse. Sinon, assurez-vous qu’un utilisateur est présent à chaque point temporel pour traduire manuellement l’échantillon afin d’enregistrer chaque puits. REMARQUE: Évitez de laisser l’échantillon éclairé lorsque vous n’imaginez pas pour éviter le chauffage et l’évaporation. Les volumes d’échantillons sont faibles et l’évaporation entraînera des bulles d’air.</li>
	<li>Enregistrez les films au format TIFF, MOV ou AVI. REMARQUE: Ce sont les types de fichiers vidéo non propriétaires les plus courants. Selon le logiciel de microscope spécifique, les vidéos peuvent être enregistrées par défaut dans un type de fichier propriétaire, mais peuvent ensuite être exportées vers l’un des types de fichiers susmentionnés.</li>
	<li>Utilisez un facteur de conversion pixel-millimètre pour l’échelle physique et effectuez un étalonnage ou utilisez la taille de pixel connue de la caméra utilisée. Pour calibrer, obtenez une image claire d’une diapositive d’étalonnage ou d’une règle claire avec les mêmes paramètres de grossissement que les vidéos. À l’aide de n’importe quel programme de visualisation d’images, comptez le nombre de pixels entre les marques d’une distance physique connue. REMARQUE: Par exemple, si l’image d’une règle montre la marque de 1 mm et la marque de 2 mm à séparer par 100 pixels, le facteur de conversion est de 1 mm pour 100 pixels. Alternativement, pour dériver ce facteur de la taille des pixels de l’appareil photo, il suffit de multiplier la taille du pixel de l’appareil photo par le grossissement. Par exemple, si l’appareil photo utilisé a 3,45 μm de pixels et que le grossissement utilisé était de 1,6x, la conversion est de 3,45 μm * 1,6 = 5,52 μm par 1 pixel.</li>
</ol>3. Suivi des cellules
<ol><li>Téléchargez les deux scripts, TrackCells.m et CleanTraces.m, dans un emplacement facile à retenir sur l’ordinateur. Si les vidéos de données ne sont pas déjà sur cet ordinateur, transférez-les sur cet ordinateur. REMARQUE : Les vidéos de données et les scripts n’ont pas besoin d’être dans le même dossier.</li>
	<li>Organisez les vidéos de données dans des dossiers, un pour chaque point temporel. Utilisez d’abord le script TrackCells.m pour effectuer un suivi automatisé des cellules dans les vidéos de données. Ouvrez TrackCells.m et exécutez le script.</li>
	<li>Choisissez Ajouter au chemin d’accès si une fenêtre contextuelle vous y invite, ce qui ne se produit généralement que lorsque le script est exécuté pour la première fois à partir d’un dossier donné. Lorsque vous y êtes invité, sélectionnez une ou plusieurs vidéos de données pour lancer le suivi, accédez aux vidéos de données (section 2). Sélectionnez plusieurs fichiers vidéo à l’aide d’un clic tout en maintenant la touche Maj enfoncée, en maintenant la touche Ctrl enfoncée ou en maintenant le bouton gauche de la souris enfoncé tout en déplaçant les fichiers pour les mettre en surbrillance.</li>
	<li>Une fois satisfait de la liste des fichiers dans la case Nom de fichier: en bas de la fenêtre d’invite, cliquez sur Ouvrir. Effectuez d’abord un test sur une vidéo pour confirmer que tous les paramètres sont correctement définis (voir la discussion ci-dessous). REMARQUE: Ce script va maintenant créer un dossier pour chaque fichier vidéo choisi. Il écrira ensuite dans ce dossier chaque image de la vidéo sous forme de fichier .jpg et un fichier nommé position_estimates.mat, qui contient toutes les traces trouvées dans la vidéo. Selon la taille des vidéos, le nombre de vidéos et la vitesse de l’ordinateur, l’exécution de ce script peut prendre des heures.</li>
</ol>4. Vérification des traces
<ol><li>Vérifiez que les étapes décrites à la section 3 ont été suivies correctement en vérifiant qu’il n’y a pas de messages d’erreur avant de continuer. Utilisez le script CleanTraces.m pour rejeter manuellement les traces anormales ou fausses. Ouvrez CleanTraces.m dans la fenêtre de l’éditeur MATLAB en double-cliquant sur le fichier.</li>
	<li>À l’invite , sélectionnez la sortie du dossier de données par TrackCells.m. Il aura le même nom que le fichier vidéo, accédez à l’un des dossiers créés comme décrit dans la section 3. Choisissez un seul dossier. REMARQUE : Ce script affichera désormais les traces une par une dans une fenêtre contextuelle. Ils sont superposés sur l’image de la vidéo où commence la trace, en vert, et sur l’image de la vidéo où la trace se termine, en magenta. Par conséquent, une trace valide devrait lier une cellule verte et une cellule magenta.</li>
	<li>Lorsque vous y êtes invité, entrez 1 pour conserver la trace et 0 pour rejeter la trace. Appuyez sur Entrée pour passer à la trace suivante. REMARQUE : Les nouvelles traces continueront de s’afficher jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de traces ou que les soixante premières aient été affichées. Une fois ce processus terminé, le script crée automatiquement un dossier nommé CLEAN TRACES pour enregistrer les sorties et affiche toutes les traces restantes au-dessus de la première image de la vidéo (Figure 1B). Cette image est automatiquement enregistrée en tant que LabeledTraces.png pour référence ultérieure. Toutes les traces que l’utilisateur avait choisi de conserver seront enregistrées dans le fichier clean_traces.mat.</li>
	<li>Terminez cette étape pour toutes les vidéos en un seul point temporel avant de continuer. NOTE: Pour les données de ce manuscrit, une vidéo a été acquise pour chaque puits à chaque point temporel, pour un total de dix vidéos par point temporel.</li>
</ol>5. Visualisation des données
REMARQUE : Pour comparer visuellement la motilité de l’ensemble de la population cellulaire à différents points temporels, toutes les traces de la section 4 ont été traduites pour commencer à l’origine et créer un déplacement radial par rapport au diagramme temporel pour chaque point temporel (Figure 1C-F, voir la figure supplémentaire S1 pour tous les points temporels).
<ol><li>Commencez par télécharger le script intitulé SpaghettiPlots.m. Ouvrez et exécutez le script. Lorsqu’une fenêtre de navigateur de fichiers s’affiche avec l’invite Sélectionner le dossier temporel contenant les données de puits (clean_traces.mat) à représenter graphiquement, accédez au dossier de l’un des points temporels. Notez que ce dossier doit contenir un dossier pour chacune des vidéos analysées.</li>
	<li>Lorsque vous êtes invité à Calibration : Quel est le nombre de pixels par millimètre ?, tapez la valeur d’étalonnage trouvée à l’étape 2.4, puis appuyez sur Entrée. REMARQUE: Le script va maintenant combiner les traces de toutes les vidéos analysées à ce point temporel en un seul tracé (Figure 1C-F). De faibles cercles pointillés dans le tracé indiquent des déplacements radiaux de 1, 2, 3 et 4 mm.</li>
	<li>Ajustez les axes du tracé si nécessaire en modifiant la ligne 55 du script, qui par défaut, est définie sur rr = 4 pour inclure un rayon allant jusqu’à 4 mm. Enregistrez le tracé.</li>
</ol>

<ol><li>Lillie, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+smallest+parts+of+stentor+capable+of+regeneration%3B+a+contribution+on+the+limits+of+divisibility+of+living+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter.</a> Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).</li>
<li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+proportionate+structures+in+Stentor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).</li>
<li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTartar%2C+V+%22The+Biology+of+Stentor%22">The Biology of Stentor</a>. Kerkut, G. A. , Pergamon Press. (1961).</li>
<li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactions+of+Stentor+coeruleus+to+certain+substances+added+to+the+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Reactions of Stentor coeruleus to certain substances added to the medium.</a> Experimental Cell Research. 13 (2), 317-332 (1957).</li>
<li>Kelleher, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+model+for+microtubule+polymerization+during+oral+regeneration+in+Stentor+coeruleus%5BTitle%5D)+AND+%22Biosystems%22%5BJournal%5D)">A kinetic model for microtubule polymerization during oral regeneration in Stentor coeruleus.</a> Biosystems. 9 (4), 269-279 (1977).</li>
<li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinase+regulator+Mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+Stentor+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis.</a> PLOS Biology. 12 (5), 1001861(2014).</li>
<li>Wan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+complex+ciliary+flows+around+regenerating+Stentor+coeruleus%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Reorganization of complex ciliary flows around regenerating Stentor coeruleus.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 375 (1792), 20190167(2020).</li>
<li>Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+study+of+regeneration+in+Stentor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Methods for the study of regeneration in Stentor.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (136), e57759(2018).</li>
<li>Sood, P., McGillivary, R., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+program+of+regeneration+in+the+giant+single+cell%2C+Stentor+coeruleus%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The transcriptional program of regeneration in the giant single cell, Stentor coeruleus.</a> bioRxiv. , 240788(2017).</li>
<li>Onsbring, H., Jamy, M., Ettema, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+Stentor+cell+fragments+reveals+transcriptional+changes+during+cellular+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of Stentor cell fragments reveals transcriptional changes during cellular regeneration.</a> Current Biology. 28 (8), 1281-1288 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

De nombreux algorithmes de suivi des particules et des cellules existent actuellement, certains entièrement gratuits. Le coût et la convivialité sont souvent des compromis qui nécessitent des compromis. De plus, de nombreux programmes de suivi cellulaire existants sont conçus pour suivre le mouvement lent des cellules de culture tissulaire, plutôt que le mouvement de nage rapide de Stentor, qui tourne pendant la natation et peut subir des changements soudains de direction. Après avoir testé bon nombre de ces opt...

Stentor coeruleus (Stentor) est un organisme modèle bien connu qui a été utilisé pour étudier la régénération unicellulaire en raison de sa grande taille, de sa capacité à résister à plusieurs techniques microchirurgicales et de sa facilité de culture en laboratoire 1,2,3. Les premières études de régénération se sont concentrées sur la caractéristique la plus importante et la plus morphologiquement distincte de Stentor – l’ARTH – qui est complètement éliminée lors d’un choc chimique 4,5,6. Le remplacement de novo d’une arthrose perdue commence par l’émergence d’une nouvelle bande membranellelle, un ensemble de cils qui se déplacent progressivement vers l’avant de la cellule avant de former une arthrose fonctionnelle au cours de huit stades morphologiques3. Ces étapes ont été observées séquentiellement, quelle que soit la température, et constituent un point de référence universel pour presque toutes les études5.
L’analyse mécaniste de la régénération stentor nécessite des outils de mesure du moment de la régénération qui sont suffisamment robustes et simples pour être appliqués à plusieurs échantillons dans le cadre d’un criblage chimique ou moléculaire. La méthode standard pour effectuer un test cellulaire est l’imagerie, dans ce cas, l’imagerie de la formation d’une nouvelle arthrose pendant la régénération. Cependant, de tels tests basés sur l’imagerie sont plus efficaces lorsque la structure régénérante contient des composants moléculaires distincts qui peuvent être utilisés comme marqueurs, de sorte qu’ils seraient facilement détectés dans une image de fluorescence. Dans le cas du Stentor OA, les composants connus (cils, corps basaux) sont également présents sur le reste de la surface cellulaire ; par conséquent, la reconnaissance de la restauration de l’accès ouvert ne peut être obtenue simplement en recherchant la présence ou l’absence d’un composant.
Au contraire, une certaine forme de reconnaissance de forme serait nécessaire pour détecter une arthrose, ce qui est potentiellement très difficile étant donné que les cellules Stentor changent souvent de forme via un processus contractile rapide. Cet article présente un test alternatif pour la régénération qui repose sur l’activité mobile du corps et des cils OA. Au fur et à mesure que l’arthrose se régénère, les cils nouvellement formés subissent des changements reproductibles de position et d’activité, ce qui affecte la motilité de nage de la cellule. En analysant la motilité, il est possible d’effectuer un test de « régénération fonctionnelle » qui quantifie la régénération en quantifiant la fonction des structures régénérées. L’analyse antérieure de la fonction ciliaire de Stentor pendant la régénération utilisait la vélocimétrie d’image de particules, combinée à des billes traceuses ajoutées au milieu externe, pour observer les changements dans le schéma d’écoulement à différents stades de la régénération7; cependant, cette approche nécessite une imagerie laborieuse des cellules individuelles et de leurs champs d’écoulement associés, une à la fois.
En utilisant le mouvement de la cellule elle-même comme proxy pour le flux généré par les cils, il serait possible d’analyser un plus grand nombre de cellules en parallèle, en utilisant des systèmes d’imagerie à basse résolution compatibles avec les plates-formes de criblage à haut débit. Ce test peut, en principe, être utilisé pour étudier le développement et la régénération fonctionnelle chez d’autres organismes nageurs à l’échelle des centaines de microns à millimètres. La section 1 du protocole décrit la construction d’une lame d’échantillon multipuits, qui permet l’imagerie à haut débit d’une population de cellules sur une journée entière. Des détails sont fournis sur la façon de s’ajuster pour une utilisation avec d’autres types de cellules. La section 2 du protocole couvre l’acquisition de données vidéo pour ce test, qui peut être réalisée sur un microscope à dissection avec un appareil photo reflex numérique à objectif unique. La section 3 du protocole fournit une procédure pas à pas du suivi des cellules et du calcul de la vitesse des cellules à l’aide du code MATLAB (informations supplémentaires). La section 4 du protocole explique comment transformer les résultats numériques en graphiques, comme le montrent les figures 1C-F et 2C pour faciliter l’interprétation des résultats.

<table><tbody><tr><td>Feuille de silicone de 0,25 mm d’épaisseur</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>CWS-S-0.25</td><td></td></tr><tr><td>24 x 50 mm, verre de protection #1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1034527</td><td>Comme indiqué dans la discussion, un verre de protection plus petit peut être utilisé si moins de puits d’échantillon sont placés sur une lame.</td></tr><tr><td>Caméra</td><td></td><td></td> CCD <td>Nous avons utilisé Nikon D750</td></tr><tr><td>Chlamydomonas 137c WT souche</td><td>Chlamydomonas Resource Center</td><td>CC-125</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MATHWORKS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB Image Processing Toolbox</td><td>MATHWORKS</td><td></td><td>nécessaire pour TrackCells.m et CleanTraces.m</td></tr></tbody></table>

analyse des modèles de motilité du stentor pendant et après la régénération de l’appareil buccal à l’aide du suivi cellulaire

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

Stentor coeruleus est un organisme modèle bien connu pour l’étude de la régénération unicellulaire. L’analyse transcriptomique de cellules individuelles a révélé des centaines de gènes – dont beaucoup ne sont pas associés à l’appareil buccal (OA) – qui sont régulés différemment par phases tout au long du processus de régénération. On a émis l’hypothèse que cette réorganisation systémique et cette mobilisation des ressources cellulaires vers la croissance d’une nouvelle arthrose entraîneront des changements observables dans le mouvement et le comportement correspondant dans le temps aux phases d’expression différentielle des gènes. Cependant, la complexité morphologique de S. coeruleus a nécessité le développement d’un test pour capturer les statistiques et l’échelle de temps. Un script personnalisé a été utilisé pour suivre les cellules dans de courtes vidéos, et des statistiques ont été compilées sur une grande population (N ~ 100). Lors de la perte de l’OA, S. coeruleus perd initialement la capacité de mouvement dirigé; puis à partir de ~4 h, il présente une baisse significative de vitesse jusqu’à ~8 h. Ce test fournit un outil utile pour le dépistage des phénotypes de motilité et peut être adapté pour l’étude d’autres organismes.

L’objectif de ce test est de quantifier le changement progressif des schémas de mouvement et l’augmentation progressive de la vitesse de mouvement des cellules au sein d’une grande population de stentors régénérants (N ~ 100). Pour faciliter l’interprétation des résultats, le code personnalisé inclus dans ce protocole génère deux types de tracés : une superposition de toutes les traces de mouvement des cellules dans un ensemble de données vidéo (Figure 1C-F<...

Nous présentons un protocole pour la caractérisation de la motilité et du comportement d’une population de cellules de taille cent microns à millimètres en utilisant la microscopie à fond clair et le suivi cellulaire. Ce test révèle que Stentor coeruleus passe par quatre phases comportementalement distinctes lors de la régénération d’un appareil buccal perdu.

Analyse des modèles de motilité du stentor pendant et après la régénération de l’appareil buccal à l’aide du suivi cellulaire

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds ...

Stentor coeruleus a longtemps été utilisé comme organisme modèle pour comprendre la régénération unicellulaire. Bien que la chronologie de la régénération morphologique visuelle soit connue, la chronologie de la régénération fonctionnelle reste inconnue. Ce test suit la motilité de la population centrale subissant une régénération synchronisée de sorte que la récupération de la fonction de perte peut être quantifiée.Il peut être adapté pour une utilisation avec d’autres types de cellules. L’absence d’un joint sécurisé de la chambre d’imagerie entraînera des fuites de puits les uns dans les autres ou la formation de bulles d’air à l’intérieur des puits. Pour les chercheurs qui ne sont pas familiers avec l’utilisation d’entretoises en silicone, nous recommandons fortement que le PSSP ou un autre milieu propre soit pipeté dans chacun des puits pour tester les fuites avant utilisation.La construction des chambres d’échantillonnage est plus facile à montrer qu’à décrire verbalement. Tout comme le processus d’extraction des modèles de motilité à partir des données vidéo acquises. Pour commencer, coupez un morceau de feuille d’espacement en silicone de 250 micromètres d’épaisseur légèrement plus petit en hauteur et en largeur qu’une lame de microscope.Utilisez un poinçon entier pour créer des puits circulaires laissant suffisamment d’espace entre les puits voisins pour assurer une bonne étanchéité. Initier la régénération de l’appareil buccal en incubant des cellules de stentor coeruleus dans 10% de saccharose ou 2% d’uri pendant deux minutes. Ensuite, lavez trois fois avec du milieu frais.Pipettez doucement environ 10 pupitres dans chaque puits. En prenant soin de faire correspondre le volume de l’échantillon au volume du puits aussi étroitement que possible. Fermez les puits en abaissant doucement un morceau de verre de couverture sur les puits à partir d’un bord.Utilisez un objet étroit et légèrement flexible, tel qu’une pointe de pipette de 10 microlitres pour appuyer sur le verre de couverture où il entre en contact avec la feuille de silicone pour assurer une bonne étanchéité. Placez l’échantillon sur l’étage du microscope et réglez le microscope sur le grossissement le plus bas disponible afin qu’il s’insère bien dans le cadre. Commencez le laps de temps et acquérez une vidéo de dix secondes à 30 images par seconde de chaque puits à chaque point temporel.Pour calibrer, obtenez une image claire d’une diapositive d’étalonnage ou d’une règle claire avec les mêmes paramètres de grossissement que les vidéos. À l’aide de n’importe quel programme de visualisation d’images, comptez le nombre de pixels entre les marques d’une distance physique connue. Téléchargez les deux scripts, les cellules de suivi et nettoyez les traces dans un emplacement facile à retenir sur l’ordinateur et transférez également les vidéos de données sur cet ordinateur.Organisez les vidéos de données dans des dossiers. Un pour chaque point de temps. Utilisez les cellules de piste de script pour effectuer un suivi automatisé des cellules dans les vidéos de données en ouvrant les cellules de piste et en exécutant le script Choisissez ajouter au chemin d’accès si vous y êtes invité par une fenêtre contextuelle qui ne se produira généralement que lorsque le script est exécuté pour la première fois à partir d’un dossier donné.Lorsque vous y êtes invité, sélectionnez une ou plusieurs vidéos de données pour lancer le suivi. Accédez aux vidéos de données et une fois satisfait de la liste des fichiers, cliquez sur ouvrir"Pour rejeter manuellement les traces anormales ou fausses, ouvrez les traces propres dans la fenêtre de l’éditeur MATLAB en double-cliquant sur le fichier. À l’invite, sélectionnez la sortie du dossier de données par cellules de piste.Accédez à l’un des dossiers créés et sélectionnez-le. Lorsque vous y êtes invité, entrez un pour conserver la trace et zéro pour rejeter la trace. Appuyez ensuite sur Entrée pour passer à la trace suivante.Commencez par télécharger le script intitulé spaghetti plots. Ouvrez et exécutez le script. Lorsque la fenêtre du navigateur de fichiers apparaît avec l’invite, sélectionnez le dossier à ouvrir.Accédez au dossier de l’un des points temporels. Lorsque vous y êtes invité, étalonnage, quel est le nombre de pixels par millimètre? Saisissez la valeur d’étalonnage et appuyez sur Entrée.Ajustez les axes du tracé si nécessaire en modifiant la ligne 55 du script, qui par défaut est définie sur RR égal à quatre. pour inclure un rayon allant jusqu’à quatre millimètres. Enregistrez le tracé.Les résultats montrent la motilité collective de la population de cellules stentor à deux, trois, sept et huit heures dans le processus de régénération de l’appareil buccal. Ces graphiques montrent à la fois l’augmentation attendue du nombre d’individus mobiles et l’augmentation par quatre de la gamme des cellules les plus mobiles au sein de la population. Les cellules de nage les plus rapides, si elles sont démarrées près du bord, sont limitées à nager entièrement en ligne droite et leur amplitude de mouvement semble plus petite.Les cellules du tractus ont été classées en trois catégories distinctes, non mobiles sans maintien visible, non mobiles avec maintien visible et mobiles. Le résultat a montré un histogramme empilé résumant le nombre relatif de cellules dans ces catégories en fonction de la nôtre en régénération. Plus tard, un nombre important de cellules ont été trouvées dans des colonies avec des jeûnes de maintien visibles suggérant fortement qu’elles avaient exploré l’environnement et s’étaient attachées de préférence près d’autres de leur espèce.Il est important de sélectionner les dimensions du puits d’échantillonnage qui fonctionnent bien pour stentor coeruleus qui mesurent environ un millimètre. Cela comprend une épaisseur d’espacement en silicone de 5/16e de pouce de diamètre et 10 cellules par puits. Ces chiffres doivent être ajustés lors de l’adaptation de ce protocole à d’autres types de cellules.Ce test peut être effectué en conjonction avec l’ARN-I pour étudier et comparer la régénération de différents phénotypes de stentor.

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Le géant cilié, Stentor coeruleus, est un excellent système pour étudier la régénération et la guérison des plaies. Nous présentons des procédures pour établir des cultures de cellules de Stentor de cellules individuelles ou des fragments de cellules, induisant la régénération de cellules de coupe, chimiquement induisant la régénération de la bande de membranellar et appareil oral, imagerie et analyse des cellules régénération.

Méthodes pour l’étude de la régénération de Stentor

De nombreuses bactéries utilisent la motilité entraînée par les flagelles pour naviguer dans leur environnement et coloniser un environnement favorable à la fois individuellement et collectivement. Démontré ici est l’utilisation de trois méthodes établies qui exploitent la motilité comme un outil de sélection pour identifier les composants / voies contribuant à la natation et la motilité de l’essaimage.

Étudier la motilité induite par flagelle chez Escherichia coli en appliquant trois techniques établies dans une série

Nous présentons un protocole d’isolement et de culture de cellules mésenchymateuses palatales embryonnaires primaires de souris pour l’imagerie en accéléré de la croissance bidimensionnelle (2D) et des tests de réparation des plaies. Nous fournissons également la méthodologie d’analyse des données d’imagerie time-lapse afin de déterminer la formation de flux cellulaire et la motilité directionnelle.

Isolement et imagerie en accéléré de cellules de mésenchyme palatales embryonnaires primaires de souris pour analyser les attributs de mouvement collectif

Découvrez une méthode d'analyse quantitative de la motilité de Stentor coeruleus pendant la régénération de l'appareil buccal. Ce protocole combine microscopie en time-lapse et suivi automatisé pour étudier la récupération fonctionnelle.

Analyse des modèles de motilité du stentor pendant et après la régénération de l’appareil buccal à l’aide du suivi cellulaire

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