Génération d’un modèle tridimensionnel simplifié de peau sur puce dans une plate-forme microfluidique micro-usinée

Il s’agit d’un nouveau protocole sans lithographie pour la modélisation d’une peau sur puce 3D à l’aide de couches de vinyle adhésives micro-usinées et d’une méthodologie à flux parallèle pour la génération de compartiments dermiques. Le vinyle micro-usiné offre plus de simplicité dans le processus de fabrication et de polyvalence dans la disposition de l’appareil, surmontant certaines des limites du PDMS et des approches lithographiques traditionnelles. Cette peau sur puce multicouche peut être utilisée pour des approches de test de médicaments et de cosmétiques, car elle permet un dépistage à haut débit à moindre coût et pourrait être utilisée pour modéliser plusieurs maladies.

Commencez par concevoir une puce microfluidique à l’aide du logiciel Brother Canvas Workspace. Créez un espace de travail de 30 par 30 centimètres et remplissez-le avec les motifs de conception des différentes couches de la puce avant de le stocker dans un fichier svg. Découpez les feuilles de vinyle de 30 par 30 centimètres.

Collez-le sur un tapis adhésif à faible adhérence et éliminez toutes les bulles d’air, si nécessaire. À l’aide d’une clé USB, téléchargez le fichier svg sur le traceur de bord et définissez les paramètres de coupe comme la pression de coupe au niveau zéro, la lame de coupe au niveau trois et le niveau un pour la vitesse de coupe. Lorsque les paramètres sont définis, placez le tapis adhésif avec le vinyle dans le traceur et commencez le processus de découpe des motifs de canaux sur du vinyle de 95 micromètres d’épaisseur.

Assemblez l’ensemble de l’appareil à l’aide d’un aligneur pour obtenir des canaux de réglage, des entrées et des sorties appropriés. Empilez pour les couches de vinyle avec une conception de micromachine correspondante pour assembler le canal inférieur, en gardant le ruban de couverture de la couche inférieure pour éviter de coller à l’aligneur. Coupez et placez la membrane poreuse en polycarbonate sur le dessus du canal inférieur sans recouvrir les entrées.

Ajoutez 10 couches de vinyle avec la conception de la chambre supérieure et collez une couche finale de ruban adhésif double face sur le dessus. Retirez la puce de l’aligneur pour la coller sur la glissière en verre. Placez une feuille PDMS de deux millimètres d’épaisseur sur la couche de vinyle de ruban adhésif double face.

Pour vous assurer que la puce est complètement étanche, laissez un poids sur le dessus de la puce pendant la nuit. Le lendemain, stérilisez la puce en la rinçant avec de l’éthanol à 70% pendant cinq minutes, suivie d’un lavage à l’eau distillée. Connectez la pompe un et la pompe deux à l’entrée de la chambre supérieure un et à l’entrée de la chambre supérieure deux, respectivement.

Connectez la pompe trois à l’entrée de la chambre inférieure, puis connectez les sorties de la chambre supérieure et de la chambre inférieure à une cuve à déchets. Connectez les seringues à chaque entrée à l’aide de tubes en PTFE et de connecteurs en acier inoxydable de calibre 18. Pompe PBS avec pompe trois à travers l’entrée de la chambre inférieure à 50 microlitres par minute, et avec la pompe deux à travers l’entrée de la chambre supérieure deux à 100 microlitres par minute.

Ensuite, chargez la seringue avec le pré-gel de fibrinogène, placez-la immédiatement dans la première pompe et faites-la fonctionner à 200 microlitres par minute. Une fois que le pré-gel sort de la sortie de la chambre supérieure, arrêtez les pompes une et deux, puis, sans retirer le tuyau, laissez la puce pour permettre la gélification à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après la gélification, bloquez l’entrée de la chambre supérieure avec un bouchon et pompez le milieu de culture à travers l’entrée de la chambre supérieure deux avec la pompe trois à 50 microlitres par heure pendant la nuit.

24 heures après la génération du compartiment dermique, vérifiez que les cellules fibroblastiques primaires humaines sont réparties dans l’assemblage, puis introduisez cinq fois 10 aux 6 HKC par millilitre par l’entrée du canal supérieur deux à 40 microlitres par minute pendant une minute. Pour la fixation des cellules, placez la puce pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur saturé d’humidité. Commencez à pomper le milieu de culture frais avec la pompe trois uniquement par l’entrée de la chambre inférieure à 50 microlitres par minute.

Dans l’analyse représentative, la hauteur de l’hydrogel le long de la chambre supérieure de l’assemblage est affichée. Une hauteur moyenne de 550 micromètres était optimale pour le fonctionnement du gel à des débits de 100 et 200 microlitres par minute pour le PBS sacrificiel et le pré-gel, respectivement. L’échec du rinçage du PBS par le canal inférieur a entraîné des écarts entre la hauteur théorique du gel et celle mesurée, avec une différence de 40%Après 24 heures à compter du début du protocole à flux parallèle, les fibroblastes primaires humains se sont répandus avec succès dans le gel de fibrine dans la chambre supérieure de l’assemblage, après quoi, les HKC exprimant les protéines fluorescentes vertes pourraient être efficacement ensemencés sur l’hydrogel.

L’enlèvement des tubes sans garder le système fermé pendant la nuit pour permettre au HKCS de sédimenter a entraîné une monocouche de cellules non uniforme et confluente. L’analyse confocale 3D du modèle de peau indifférencié dans la puce microfluidique a clairement montré la surface de l’hydrogel séparant les HKC en haut du fibroblaste incorporé en bas. La peau générée pourrait être exposée à l’interface air/liquide pour obtenir un épiderme mature et différencié, et être caractérisée à l’aide de plusieurs marqueurs dermiques et épidermiques.

Cette technique permet une fabrication de dispositif plus rapide et moins chère, et la génération de peau multicouche à l’aide de la microfluidique, offrant une approche plus réaliste pour les tests de médicaments et de cosmétiques.