Name: μTongue : une plateforme d’imagerie fonctionnelle basée sur la microfluidique pour la langue in vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Découvrez l'imagerie fonctionnelle des cellules gustatives in vivo avec le système µTongue microfluidique. Cette méthode permet l'analyse calcique des réponses aux saveurs sucrées, umami et salées chez la souris.

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Ce travail a été soutenu par l’Institut des sciences fondamentales (IBS-R015-D1), la subvention de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIT) (n° 2019M3A9E2061789) et par la subvention de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIT) (n° 2019M3E5D2A01058329). Nous sommes reconnaissants à Eunsoo Kim et Eugene Lee pour leur assistance technique.

Toutes les interventions chirurgicales ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université Sungkyunkwan et de l’Université nationale de Séoul.
1. Préparation des solutions: salive artificielle et tastants
<ol><li>Préparer la salive artificielle en dissolvant 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3, 3 mM KHCO3, 0,25 mM CaCl2, 0,25 mM MgCl2, 0,12 mM K2HPO4, 0,12 mM KH2PO4, et 1,8 mM HCl dans de l’eau distillée (>1 L), et ajuster le pH de la solution à 7 (voir tableau des matériaux)12.</li>
	<li>Préparer des tastants, tels que l’acide aigre: acide citrique 10 mM; salé : 400 mM de NaCl, éventuellement avec 50 μM d’amiloride ; doux: 40 mM acésulfame K; amer : mélange de 5 mM de quinine, de 5 mM de dénatonium et de cycloheximide de 20 μM, en dissolvant le produit chimique de dégustation dans la salive artificielle préparée à l’étape 1.1.</li>
</ol>2. Préparation du système microfluidique
REMARQUE : Les tastants ont été livrés à la langue de la souris à l’aide d’un système d’administration fluidique multicanal sous pression (voir la figure 1 et le tableau des matériaux).
<ol><li>Remplissez les réservoirs du système de perfusion à flux sous pression avec la salive artificielle et les tastants.</li>
	<li>Connectez la conduite d’air comprimé à l’entrée du régulateur et réglez la pression d’air entre 30 et 50 psi dans le système de distribution fluidique.</li>
	<li>Réglez la pression de sortie du régulateur sur 0,4 psi et vérifiez si le liquide sort du tube sous cette pression.</li>
	<li>Connectez le collecteur des réservoirs au port d’entrée de μTongue.</li>
	<li>Connectez le port de sortie de μTongue à une pompe à seringue et retirez le liquide avec ~300 μL∙min-1 pour établir l’état d’équilibre. Observez le volume constant d’une gouttelette suspendue sous la μTongue. Ajustez la valeur du paramètre de réglage en fonction de la hauteur de l’échantillon.</li>
	<li>Débranchez la conduite d’air comprimé et arrêtez la pompe à seringue jusqu’à ce que l’étape 3 du protocole soit terminée.</li>
</ol>3. Préparation de la souris pour l’imagerie in vivo (Figure 2).
REMARQUE: Toutes les préparations animales ont été effectuées pendant la journée dans des conditions aseptiques sur un établi de laboratoire.
<ol><li>Anesthésie de la souris<ol>
<li>Préparez une souris de 7 semaines ou plus de l’un ou l’autre sexe. Utilisez une lignée de souris génétiquement modifiée qui exprime des protéines de fluorescence détectant le calcium dans les cellules gustatives.</li>
		<li>La souris est retenue pour l’anesthésie. Un mélange de 100 mg/kg de kétamine et de 10 mg/kg de xylazine est injecté par voie intrapéritonéale chez la souris13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>TriTC-dextran (500 kDa) dans une solution saline tampon phosphate à 2,5 % W/V est administré par voie intraveineuse à la souris par voie rétro-orbitale pour observer la circulation sanguine lors d’une séance d’imagerie.</li>
	<li>Fixez un fixateur de tête sur le crâne de la souris pour minimiser les artefacts de mouvement.<ol>
<li>La tête de la souris est pulvérisée avec 70% d’ETOH tandis que la souris est placée en position couchée. Soulevez légèrement la peau de la tête avec une pince et coupez environ 7 mm2 avec des ciseaux.</li>
		<li>Nettoyez les poils autour du cuir chevelu, retirez le périoste sous la peau, appliquez un adhésif instantané sur le crâne et fixez un fixateur de tête personnalisé.</li>
		<li>Une fois l’adhésif instantané durci, appliquez de la colle dentaire autour du fixateur de tête et éclairez-le avec une lumière bleue pour solidifier la colle dentaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placez la langue de la souris sur l’unité inférieure de μTongue.<ol>
<li>Fixez la lèvre inférieure de la souris à l’unité inférieure de μTongue avec un adhésif instantané.</li>
		<li>Placez la souris sur la carte (planche de préparation de la souris dans la figure 1B) et placez l’unité inférieure du μTongue sur les poteaux (poteau de maintien μTongue dans la figure 1B). Assurez-vous que les trous sur le bord de l’unité inférieure sont alignés sur le poteau.</li>
		<li>Serrez le fixateur de tête de souris sur le support de fixation de tête au niveau de la carte. Ensuite, ajustez la distance entre la tête de la souris et l’appareil. Faites pivoter la tête de la souris en douceur d’environ 45 ° à l’aide du support de fixation de la tête. Ce processus empêche le contact physique du nez de la souris avec l’objectif du microscope.</li>
		<li>Dessinez doucement la langue de la souris à l’aide d’une pince à épileuse en plastique et fixez la face ventrale de la langue sur la face supérieure de l’unité inférieure de la μTongue. Ensuite, essuyez la surface de la langue de la souris avec un coton-tige humide.</li>
		<li>Faites tremper un morceau de papier dans la salive artificielle et placez-le sur la surface exposée de la langue de la souris pour maintenir un état humide.</li>
		<li>Placez les rondelles incurvées sur les poteaux qui maintiennent les deux extrémités de la partie inférieure de μTongue.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placez la préparation de la souris sur la scène du microscope. Placez la langue de souris exposée sous le centre approximatif de la zone de l’objectif du microscope. Assurez-vous de ne pas vous écarter de la plage dynamique de la scène. Ensuite, serrez la planche de la souris sur la scène avec des vis.</li>
	<li>Placez le coussin chauffant sous le corps de la souris et maintenez la température à 36,5 °C-37,5 °C. Surveillez la température corporelle de la souris avec un capteur de température et contrôlez la température du coussin chauffant à l’aide d’un signal de rétroaction du capteur de température.</li>
	<li>Tournez un mince morceau de papier et placez-le à la bouche de la souris pour empêcher le liquide de pénétrer dans la trachée de la souris.</li>
	<li>Retirez le tissu humide de la langue de la souris et placez la μTongue préparée sur la langue de la souris. Placez un canal microfluidique sur la langue et ajustez sa position pour observer la surface de la langue à travers la fenêtre d’imagerie.</li>
	<li>Fixez le μTongue en vissant doucement les deux extrémités avec une pression de compression minimale.</li>
</ol>4. Acquisition d’imagerie
<ol><li>Allumez le laser à deux photons de 920 nm et le microscope avant utilisation.</li>
	<li>Montez l’objectif d’immersion dans l’eau (16x, NA 0,80 ou 25x, NA 1,1) sur le microscope. Déposez l’eau distillée sur la fenêtre d’imagerie du μTongue et immergez l’objectif.</li>
	<li>En mode caméra, allumez la lumière à l’aide d’une lampe au mercure et éclairez la surface de la languette.</li>
	<li>En ajustant l’axe Z, recherchez le signal autofluorescent des papilles filiformes pour trouver le plan focal approximatif. Ensuite, à l’aide du bouton de réglage X et Y, localisez une papille gustative.</li>
	<li>Passez en mode multiphoton. Définissez les conditions d’acquisition de l’image comme suit : longueur d’onde d’excitation : 920 nm ; jeu de filtres d’émission: 447/60 nm, 525/50 nm et 607/70 nm; mode de balayage raster bidirectionnel, taille de l’image: 512 x 512.</li>
	<li>Ajustez les positions X et Y pour placer la papille gustative au centre de la fenêtre d’image.</li>
	<li>Fouillez les vaisseaux sanguins entourant la papille gustative à environ deux tiers de la hauteur de la papille gustative. Visualiser la circulation sanguine par injection de TRITC-dextran (500 kDa) à partir de l’étape 3.2 du protocole. Si le flux sanguin se bouche, desserrer légèrement les vis de fixation pour permettre la circulation sanguine.</li>
	<li>Ajustez l’axe Z et trouvez le plan Z de la papille gustative qui contient un nombre adéquat de cellules gustatives.</li>
	<li>Procéder à l’imagerie calcique avec 2-6 Hz pendant 80 s. Fournir une solution gustative de 20 s en allumant le réservoir du système fluidique après le début de l’imagerie. Après 20 s de stimulation du goût, revenir au réservoir en salive artificielle.</li>
	<li>Une fois l’imagerie séquentielle terminée, attendez environ 3 à 4 minutes avant la prochaine séance d’imagerie. Gardez la salive artificielle qui coule vers la langue de la souris pour éliminer le tastant rémanent de la séance d’imagerie précédente. Selon la conception de l’expérience, répétez la session au besoin.</li>
	<li>Lorsque l’imagerie calcique in vivo est terminée, euthanasier la souris selon la procédure IACUC. La souris sous anesthésie est sacrifiée dans la chambre CO2. REMARQUE: Vérifiez la profondeur de l’anesthésie à l’aide d’un réflexe de pincement des orteils. Lors d’une séance d’imagerie, la salive artificielle des réservoirs doit être fournie de manière cohérente. Si des bulles apparaissent à la fenêtre d’imagerie du μTongue, retirez les bulles en les poussant à travers l’entrée ou la sortie du μTongue en utilisant une forte pression de liquide.</li>
</ol>5. Analyse d’images (Figure 3)
<ol><li>Conversion d’image<ol>
<li>Ouvrez les fichiers image bruts à l’aide de Fiji14 ou d’un logiciel d’analyse d’images similaire.</li>
		<li>Convertissez le fichier image en fichier de pile RVB pour utiliser le code NPL Bud Analyzer.<ol>
<li>Image > couleur > canaux fractionnés</li>
			<li>
Image > Couleur > Fusionner les couches et sélectionnez l’image à l’étape 5.2.1.</li>
			<li>Image > pile de > couleur en RVB</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enregistrement d’image Remarque : Utilisez le code écrit sur mesure pour l’analyse des données. Veuillez vous référer à https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.<ol>
<li>Exécutez le code nommé Taste_GUI.m; une fenêtre d’interface graphique nommée NPL Bud Analyzer apparaîtra. Cliquez sur le bouton Nouvelle analyse dans le coin supérieur droit, puis chargez l’image convertie à partir de l’étape 5.1. Définissez la fréquence d’images au-dessus de l’image chargée.</li>
		<li>Dessinez la région d’intérêt (ROI) sur l’image chargée pour l’enregistrement. Double-cliquez sur le ROI sélectionné et une inscription calculée automatiquement commencera.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Obtenir les changements relatifsd’intensité de fluorescence (ΔF/F)<ol>
<li>Revenez à la fenêtre NPL Bud Analyzer pour afficher automatiquement l’image enregistrée à partir de l’étape 5.2. Si l’utilisateur dispose déjà d’un fichier reg, cliquez sur le bouton Charger les données et sélectionnez le fichier _reg.tif.</li>
		<li>Cliquez sur le bouton CIRCLE ou POLYGON et positionnez le ROI de la cellule de goût sur l’image de la papille gustative.</li>
		<li>Celui-ci présente l’intensité de fluorescence brute et la trace de calcium (ΔF/F)de la cellule gustative sélectionnée automatiquement sous l’image de la papille gustative.</li>
		<li>Cliquez sur Enregistrer la trace pour présenter la trace de calcium (ΔF/F) sur le côté droit de l’interface graphique, tandis que le retour sur investissement est affiché sur l’image de la papille gustative. Répétez les étapes 5.3.2 à 5.3.4 jusqu’à ce que la sélection du retour sur investissement soit terminée. REMARQUE: Cliquez sur le bouton Supprimer la trace si le retour sur investissement est mal sélectionné pour éliminer le dernier retour sur investissement sélectionné et la trace de calcium.</li>
		<li>Une fois la sélection du retour sur investissement terminée, écrivez le nom du fichier dans le coin inférieur droit et cliquez sur le bouton Terminer pour exporter la trace de calcium ΔF/F au format .xls et l’image tase bud avec des retours sur investissement au format .bmp.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse de la trace de calcium<ol>
<li>Analyser la trace de calcium obtenue à partir de l’étape 5.3. Considérez que les cellules gustatives ont réagi au tastant lorsque l’intensité de fluorescence augmente de plus de deux écarts-types de la ligne de base après que le tastant est délivré4, et que les valeurs de psont inférieures à 0,01, en utilisant des tests tappariés ou non appariés10.</li>
		<li>Considérez la cellule gustative comme une cellule répondeuse, si elle répond à un certain tastant plus de deux fois sur trois essais (~60%)15.</li>
		<li>Obtenir les traces de calcium représentatives en faisant la moyenne des traces de calcium individuelles acquises à partir de l’étape 5.4.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Danilova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glossopharyngeal+nerves+to+taste+stimuli+in+C57BL+%2F+6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BME+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice.</a> BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).</li>
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<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Tan, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut-brain+axis+mediates+sugar+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The gut-brain axis mediates sugar preference.</a> Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).</li>
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<li>Kusuhara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+responses+in+mice+lacking+taste+receptor+subunit+T1R1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1.</a> Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent des intérêts financiers concurrents : J. Han et M. Choi sont les inventeurs de la technologie brevetée μTongue décrite dans cet article, et le système μTongue est disponible dans le commerce via SciTech Korea.

Décrit ici est un protocole détaillé pour appliquer μTongue à l’étude des activités fonctionnelles des cellules gustatives in vivo. Dans ce protocole, l’imagerie fonctionnelle sur les cellules gustatives à l’aide d’indicateurs de calcium génétiquement codés est effectuée. En plus de l’utilisation de souris transgéniques, la charge électrophorétique de colorants calciques (ou colorants à détection de tension) sur les cellules gustatives peut être une option alternative.
Toutes les solu...

Le microscope à fluorescence intravitale est largement utilisé pour étudier la dynamique spatio-temporelle sur les tissus vivants. Les chercheurs développent rapidement des capteurs génétiquement codés qui fournissent des transformations spécifiques et sensibles des processus biologiques en signaux de fluorescence - qui peuvent être enregistrés facilement à l’aide de microscopes à fluorescence largement disponibles1,2. Bien que la plupart des organes internes chez les rongeurs aient été étudiés au microscope, son application réussie sur la langue n’a pas encore été couronnée de succès3.
Des études antérieures sur l’imagerie calcique des cellules gustatives ont été menées ex vivo en sectionnant finement un tissu de la langue pour obtenir des papilles gustatives circumvallates4,5,6 ou en décollant l’épithélium gustatif pour obtenir des papilles gustatives fongiformes7,8. La préparation de ces échantillons était inévitablement invasive, de sorte que les microenvironnements naturels tels que l’innervation des nerfs, les barrières de perméabilité et la circulation sanguine étaient largement perturbés. La première fenêtre d’imagerie intravitale de la langue a été rapportée en 2015 par Choi et al., mais un enregistrement fonctionnel fiable n’était pas réalisable en raison du mouvement et des artefacts optiques causés par les stimuli de tastant fluidique9.
Récemment, la microfluidique sur langue (μTongue) a été introduite10. Cet appareil intègre un système microfluidique avec une fenêtre d’imagerie sur la langue de la souris. En atteignant un flux quasi stable de stimuli tastant tout au long de la période d’imagerie, les artefacts du mouvement fluidique pourraient être minimisés (Figure 1). Le port d’entrée est alimenté par une série de régulateurs de pression multicanaux, tandis que le port de sortie est connecté à une pompe à seringue, qui maintient 0,3 mL / min. De plus, les artefacts optiques causés par la différence dans les indices de réfraction des solutions de tastant ont été minimisés par une analyse ratiométrique introduisant un indicateur insensible au calcium (tdTomato) ainsi que l’indicateur de calcium (GCaMP6)11. Cette conception a fourni une stabilité microscopique des cellules gustatives in vivo, même avec une commutation brusque entre les canaux fluidiques. Par conséquent, le μTongue met en œuvre un criblage fonctionnel fiable de plusieurs tastants aux papilles gustatives de la souris in vivo.
Dans ce protocole, les procédures expérimentales sont expliquées en détail pour l’imagerie calcique des papilles gustatives fongiformes de souris in vivo à l’aide de μTongue. Tout d’abord, la préparation de salive artificielle et de solutions savoureuses est décrite. Deuxièmement, la mise en place du système microfluidique pour atteindre le flux quasi-stable est introduite. Troisièmement, les procédures utilisées pour monter la langue de la souris sur le μTongue afin de permettre l’acquisition d’images sont délimitées. Enfin, chaque étape de l’analyse d’image, y compris la correction des artefacts de mouvement latéral et de la ratiométrie, est spécifiée. Ce protocole peut être facilement adapté à n’importe quel laboratoire de recherche avec une installation de souris et un microscope à deux photons ou un équipement équivalent.

<table><tbody><tr><td>acésulfame K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04054-25G</td><td>Salalive artificielle / dégustation</td></tr><tr><td>solution de chlorure de calcium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>21115-100ML</td><td>Salive artificielle / dégustation</td></tr><tr><td>acide citrique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0759-100G</td><td>Suve artificielle / dégustation</td></tr><tr><td>cycloheximide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>01810-5G</td><td>Savie artificielle / dégustation</td></tr><tr><td>denatonium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5765-5G</td><td>Salalive artificielle / tastant</td></tr><tr><td>Colle dentaire</td><td>Denkist</td><td>P0000CJT-A2</td><td>Préparation animale</td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td>ImageJ</td><td>Analyse de données</td></tr><tr><td>IMP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57510-5G</td><td>Salalive artificielle / tastant</td></tr><tr><td>Adhésif instantané</td><td>Loctite Loctite</td><td>4161, Henkel</td><td>Préparation animale</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786-100G</td><td>Salive artificielle / dégustation</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541-500G</td><td>Salive artificielle / dégustation</td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Yuhan</td><td>50</td><td>Préparation animale</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662-25G</td><td>Salive artificielle / dégustation</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>237205-500G</td><td>Artificielle salive / tastant</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathwork</td><td>MATLAB</td><td>Analyse de données</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td>Salalive artificielle / tastant</td></tr><tr><td>MPG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49601-100G</td><td>Salalive artificielle / tastant</td></tr><tr><td>Microscope Mutiphoton</td><td>Thorlab</td><td>&nbsp ; Microscope Bergamo II</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014-500G</td><td>Salive artificielle / dégustation</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>792519-500G</td><td>Salive artificielle / dégustation</td></tr><tr><td>Objectif</td><td>Nikon</td><td>N16XLWD-PF</td><td>Microscope</td></tr><tr><td>Octaflow</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>OCTAFLOW II</td><td>Contrôle fluidique</td></tr><tr><td>PC</td><td>LG</td><td>Lg15N54</td><td>Contrôle fluidique</td></tr><tr><td>PH-mètre</td><td>Thermoscientifique</td><td>ORION STAR AZ11</td><td>Salve artificielle / dégustation</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>806562</td><td>Salive artificielle / dégustation</td></tr><tr><td>quinine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Q1125-5G</td> Pompe à seringue <td>de salive artificielle / dégustation</td></tr><tr><td></td><td>Havard Apparatus</td><td>PHD ULTRA 4400</td><td>Contrôle fluidique</td></tr><tr><td>TRITC-dextran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52194-1G</td><td>Préparation des animaux</td></tr><tr><td>Laser à fibre ultrarapide</td><td>Toptica</td><td>FFultra920 01042</td><td>Microscope</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer Korea</td><td>Rompun</td><td>Préparation des animaux</td></tr></tbody></table>

μtongue : une plateforme d’imagerie fonctionnelle basée sur la microfluidique pour la langue in vivo

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

La microscopie à fluorescence intravitale est un outil largement utilisé pour étudier la dynamique multicellulaire chez un animal vivant. Cependant, il n’a pas été utilisé avec succès dans l’organe sensoriel du goût. En intégrant la microfluidique dans la fenêtre d’imagerie intravitale de la langue, le μTongue fournit des images fonctionnelles fiables des cellules gustatives in vivo sous exposition contrôlée à de multiples tastants. Dans cet article, une procédure détaillée étape par étape pour utiliser le système μTongue est présentée. Il y a cinq sous-sections : préparation de solutions tastantes, mise en place d’un module microfluidique, montage d’échantillons, acquisition de données d’images fonctionnelles et analyse de données. Quelques conseils et techniques pour résoudre les problèmes pratiques qui peuvent survenir lors de l’utilisation de la μTongue sont également présentés.

La souris Pirt-GCaMP6f-tdTomato a été utilisée pour obtenir une image de papille gustative. La surface de la langue de la souris était recouverte de papilles filiformes autofluorescentes. Les papilles gustatives sont éparpillées sur la surface de la langue (Figure 4A). Les images de la papille gustative et de sa structure ont été acquises à l’aide de trois détecteurs de filtres différents. En utilisant l’ensemble de filtres 607/70 nm, le signal tdTomato des cellules gustatives a été obtenu p...

L’article présente le dispositif μTongue (microfluidique sur langue) pour l’imagerie fonctionnelle des cellules gustatives in vivo en intégrant la microfluidique dans une fenêtre d’imagerie intravitale sur la langue.

μTongue : une plateforme d’imagerie fonctionnelle basée sur la microfluidique pour la langue in vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...

Ce protocole permet d’observer les fonctions des cellules gustatives dans un microenvironnement naturel avec des connexions neuronales et une circulation sanguine restant intactes. Grâce à cette technique, la communication de cellule à cellule peut être étudiée in vivo. Pour commencer, remplissez les réservoirs du système de perfusion à flux pressurisé avec de la salive artificielle et des tastants.Connectez la conduite d’air comprimé à l’entrée du régulateur et réglez la pression d’air dans le système de distribution fluidique à 30 à 50 livres par pouce carré. Réglez la pression de sortie du régulateur à 0,4 livre par pouce carré et vérifiez si du liquide commence à s’écouler du tube. Connectez le collecteur des réservoirs au port d’entrée de la micro-langue, puis connectez l’orifice de sortie de la micro-langue à une pompe à seringue et retirez le liquide à environ 300 microlitres par minute pour établir une condition d’état d’équilibre.Confirmez que le volume de la gouttelette suspendue sous la micro languette reste constant et ajustez la pression d’air et le débit pour obtenir la hauteur d’échantillon souhaitée. Une fois le système microfluidique installé, débranchez la conduite d’air comprimé et éteignez la pompe à seringue jusqu’à ce que la souris soit préparée pour l’imagerie in vivo. Après avoir administré l’anesthésie à la souris, injecter par voie intraveineuse TRITC-dextran par une voie rétro-orbitale pour observer la circulation sanguine pendant l’imagerie.Avec la souris placée en position couchée, vaporisez 70% d’éthanol sur sa tête. Utilisez des pinces pour soulever légèrement la peau de la tête, puis utilisez des ciseaux pour couper environ sept millimètres carrés de peau. Après avoir nettoyé les cheveux autour du cuir chevelu, retirez le périoste sous la peau et appliquez un adhésif instantané sur le crâne.Fixez ensuite le fixateur de tête personnalisé. Une fois l’adhésif instantané durci, appliquez de la colle dentaire autour du fixateur de tête et solidifiez-le par un éclairage avec une lumière bleue. En utilisant un adhésif instantané pour coller la lèvre inférieure de la souris à l’unité inférieure de la micro langue, puis placez la souris sur la planche de préparation de la souris et fixez l’unité inférieure à la micro langue aux poteaux de maintien en alignant les trous au bord de la micro langue avec les poteaux.Serrez le fixateur de tête de souris sur le support de fixation de tête sur la carte et ajustez la distance entre la tête de souris et l’appareil. Ensuite, à l’aide du support de fixation de la tête, faites pivoter la tête de la souris en douceur d’environ 45 degrés. Après avoir attaché la souris à la planche, utilisez une pince à épileuse en plastique pour tirer doucement sa langue.Ensuite, à l’aide d’un adhésif instantané, fixez la face ventrale de la langue à la face supérieure de l’unité inférieure de la micro langue. Pour garder la langue humide, essuyez la surface avec un coton-tige humide, puis placez un morceau de tissu imbibé de salive artificielle sur la surface exposée de la langue. Placez les rondelles incurvées sur les poteaux, en tenant la partie inférieure de la micro langue, puis déplacez la préparation de la souris à l’étape du microscope.Placez la langue exposée de la souris sous le centre approximatif de la zone d’objectif du microscope, en veillant à ne pas vous écarter de la plage dynamique de la scène, puis serrez les vis pour fixer fermement la carte de la souris sur la scène. Placez un coussin chauffant sous la souris pour maintenir sa température corporelle entre 36,5 et 37,5 degrés Celsius. Pour empêcher le liquide de pénétrer dans la trachée de la souris, placez un mince morceau de papier torsadé dans la bouche de la souris, puis retirez le tissu humide placé à la surface de la langue et placez la micro-langue préparée sur la langue de la souris, de sorte que la surface de la langue soit visible à travers la fenêtre d’imagerie.Fixez la micro langue en vissant doucement les deux extrémités avec une pression de compression minimale. Pour commencer à acquérir des images, ouvrez le logiciel du microscope, puis allumez le laser à deux photons de 920 nanomètres. Montez l’objectif d’immersion dans l’eau sur le microscope, puis abaissez l’objectif sur la fenêtre d’imagerie de la micro langue et immergez l’objectif.En mode caméra, illuminez la surface de la langue en allumant la lumière bleue d’une lampe au mercure. Pour trouver le plan focal approximatif, ajustez l’axe Z et recherchez un signal d’autofluorescence provenant des papilles filiformes. Ensuite, à l’aide du bouton de réglage X et Y, localisez une papille gustative.Passez en mode multiphoton, puis définissez la longueur d’onde d’excitation, le jeu de filtres d’émission, le mode de balayage et la taille de l’image pour l’acquisition d’images. Avec la papille gustative au centre de la fenêtre d’imagerie, localisez les vaisseaux sanguins entourant la papille gustative à environ deux tiers de la hauteur de la papille gustative et visualisez la circulation sanguine. Si le flux sanguin est bouché, desserrer légèrement les vis de fixation pour reprendre le flux sanguin.Ajustez l’axe Z pour trouver le plan Z d’une papille gustative contenant un nombre suffisant de cellules gustatives, puis procédez à l’imagerie calcique à deux à six Hertz pendant 80 secondes. Après le début de l’imagerie, allumez le réservoir du système fluidique pour fournir une solution de goût pendant 20 secondes. Après 20 secondes de stimulation du goût, revenir au réservoir en salive artificielle.Pendant l’imagerie, attendez environ trois à quatre minutes entre les séances en fournissant constamment de la salive artificielle pour garder la langue humide et laver le tastant restant de la séance précédente. La surface de la langue de la souris Pirt-GCaMP6f-tdTomato est recouverte de papilles filiformes autofluorescentes et de papilles gustatives peu étalées. Les papilles filiformes en jaune sont capturées à l’aide d’un photodétecteur de 500 à 550 nanomètres et peuvent être observées de la surface même de la langue jusqu’à environ 25 micromètres de profondeur.Les signaux GCaMP en vert détectés par le filtre de 500 à 550 nanomètres et les signaux tdTomato en rouge, détectés par le filtre de 607 à 670 nanomètres, représentent les cellules gustatives. Le signal tdTomato est obtenu pour l’analyse métrique du ratio. Les vaisseaux sanguins qui entourent la papille gustative sont acquis à l’aide du filtre de 500 à 550 nanomètres situé dans le tissu conjonctif de collagène, qui soutient structurellement la papille gustative, est acquis à l’aide de l’ensemble de filtres de 447 à 460 nanomètres.Dans cet exemple représentatif de dépistage du goût in vivo à l’aide de l’imagerie calcique, chaque cellule gustative est délimitée par des lignes pointillées. Dans cet essai, la cellule 2 a répondu à la fois aux tastants sucrés et umami. Et la cellule 3 a répondu à la fois à des tastants à faible et à haute teneur en sel.Aucune des cellules de cette papille gustative n’a répondu aux goûts acides. Étant donné que le but de cette expérience est d’observer le goût de la fonction cellulaire dans l’environnement naturel, il est important de délivrer les fluorescents dans les vaisseaux sanguins à l’étape de préparation et de confirmer leur circulation pendant l’expérience.

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