Name: Protocole de préparation et de transfert d’échantillons pour la cristallographie à longue longueur d’onde sous vide sur la ligne de faisceau I23 à la source lumineuse Diamond (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Découvrez le protocole de transfert cryogénique d'échantillons pour la cristallographie macromoléculaire à longue longueur d'onde sur la ligne I23 de Diamond Light Source. Cette méthode permet le phasage expérimental direct des protéines natives.

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Nous tenons à remercier Adam Taylor, Adam Prescott, Ken Jones, Arvinder Palaha et Kevin Wilkinson pour leur soutien dans le développement du système de transfert d’échantillons cryogéniques (CTS). Ce travail a été financé par iNEXT-Discovery (Grant 871037) financé par le programme Horizon 2020 de la Commission européenne.

1. Récolte des cristaux
REMARQUE: Utilisez l’équipement de protection individuelle approprié: lunettes et gants, dans la mesure du possible.
<ol><li>Une fois que les SH arrivent au laboratoire de l’utilisateur dans des combipucks (Figure 3C), séparez le couvercle de la base du combipuck de sorte que les SH restent attachés à la base et que les flacons soient conservés dans le couvercle.</li>
	<li>Immerger le couvercle avec des flacons dans de l’azote liquide. Fixez un adaptateur SH + (Figure 3B, à droite) à une baguette magnétique et récoltez les cristaux comme d’habitude.</li>
	<li>Refroidissez chaque échantillon directement dans le combipuck, en notant la position de l’échantillon. Pour fermer la rondelle, utilisez une baguette de rondelle pour attacher la base au couvercle.</li>
	<li>Transférer le combipuck de l’azote liquide à l’expéditeur sec ou au stockage d’azote liquide dewar. Expédiez l’expéditeur sec à Diamond (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Shipping-Samples.html).</li>
</ol>2. Transfert d’échantillon sous vide
<ol><li>Chargement de SH de combipuck au bloc de transfert<ol>
<li>Placez la base de la rondelle de bloc (figure 3H) déjà remplie de blocs de transfert vides (figure 3D) sur sa base de support à l’intérieur de l’azote liquide dans un récipient en mousse (figure 3J-b). REMARQUE: L’orientation des blocs de transfert est importante pour la précision du transfert d’échantillon à l’intérieur de la cuve à vide. En tant que tels, les blocs doivent être placés sur la base de la rondelle de bloc en s’assurant que l’épingle marquée d’une flèche dans la figure 3D se trouve à gauche du bloc.</li>
		<li>Placez la rondelle de flacon dans le récipient en mousse rempli d’azote liquide, en vous assurant que la base de la rondelle est fixée au support magnétique à l’intérieur du récipient en mousse (Figure 3J-a).</li>
		<li>Pré-refroidir tous les outils nécessaires dans de l’azote liquide. Utilisez l’outil séparateur de rondelle illustré à la figure 3G sur le réglage H élevé pour séparer le couvercle de la base, de sorte que la base reste attachée au support magnétique et que les SH soient exposés à l’intérieur de l’azote liquide.</li>
		<li>Pour retirer chaque SH de son adaptateur, utilisez la baguette séparatrice (Figure 3F) pour ramasser le SH de la base combipuck et placez-le dans la position appropriée du bloc de transfert en position horizontale du carrousel dans la Figure 3J-b.<ol>
<li>Placez la baguette du séparateur sur l’adaptateur SH + aussi loin que possible, en vous assurant que la baguette est verticale, pour éviter de toucher l’échantillon.</li>
			<li>Déplacez le petit levier de la baguette du séparateur vers le bas avec le pouce jusqu’à ce qu’il clique, pour fixer le SH à l’intérieur et tirer le SH de l’adaptateur.</li>
			<li>Abaissez le séparateur sur la position souhaitée du bloc, en vous assurant que l’une des trois broches s’insère à l’intérieur du trou central du bloc.</li>
			<li>Relâchez le SH en remontant le levier. Répétez ces étapes pour chaque SH.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pour charger des échantillons dans le bloc d’échantillons suivant, utilisez l’outil clé de carrousel (Figure 3E) pour faire pivoter un bloc vide en position horizontale.</li>
		<li>Fixez l’outil séparateur de rondelle illustré à la figure 3G à l’aide du réglage bas L au couvercle de la rondelle de bloc en vissant dans le sens des aiguilles d’une montre.</li>
		<li>Une fois que tous les SH sont transférés, pour fermer la rondelle de bloc, placez le couvercle dans de l’azote liquide et attendez que la température s’équilibre, puis placez le couvercle sur la base comme dans la figure 3I. Une fois l’outil séparateur fixé, soulevez doucement pour vous libérer du carrousel.</li>
		<li>À ce stade, la rondelle de bloc peut être transférée au CTS (figure 4B) ou à un dewar de stockage d’azote liquide.</li>
	</ol></li>
	<li>Chargement des blocs de transfert dans la cuve à vide<ol><li>Assurez-vous que la navette est bien attachée à la station. Ouvrez les vannes d’azote gazeux et d’air et assurez-vous que les gaz circulent. Allumez le CTS.</li>
		<li>Si aucun message d’avertissement n’apparaît sur l’écran, refroidissez le bain et la navette avec de l’azote liquide. Placez l’entonnoir fourni dans l’orifice de remplissage de la navette et versez lentement de l’azote liquide dans l’entonnoir tout en surveillant le niveau sur l’écran. Arrêtez-vous lorsque l’indicateur passe du rouge au bleu. REMARQUE: La navette est prête à l’emploi lorsque la température du siège froid affichée sur l’écran tactile est inférieure à 100 K. Le bain Sample Station peut être rempli simultanément en utilisant l’entonnoir correct au niveau indiqué sur la paroi du bain ou à 100% sur l’affichage du niveau d’azote liquide. Les niveaux d’azote liquide et les capteurs de température doivent être surveillés en permanence tout au long du fonctionnement; plusieurs recharges seront nécessaires.</li>
		<li>Une fois que la température du siège froid de la navette est inférieure à 100 K et que les niveaux d’azote liquide sur la navette et le bain se stabilisent, transférez une rondelle de bloc d’azote liquide au bain CTS à l’aide de l’outil séparateur de rondelle attaché. Retirez le couvercle de la rondelle de bloc et fermez le couvercle du bain CTS.</li>
		<li>Pour introduire un bloc dans la navette, ouvrez la vanne CTS, si elle n’est pas déjà ouverte, en appuyant sur le bouton Ouvrir la vanne de la navette sur l’écran. Déverrouillez la poignée de la navette en tournant de 90 ° dans le sens des aiguilles d’une montre et avancez-la vers le bain afin que la piste guidée sur la poignée impose le bon chemin de déplacement vers le bain. Une fois que le couvercle de bloc est visible à l’intérieur du bain, laissez le couvercle refroidir. Une fois que le bouillonnement de l’azote liquide autour de la couverture s’est arrêté, avancez jusqu’au bloc de transfert.</li>
		<li>Pour verrouiller le bloc de transfert sur la navette, faites pivoter la poignée de 180° dans le sens des aiguilles d’une montre.</li>
		<li>Rétractez la poignée à la position arrière d’origine, puis « verrouillez-la » en place en tournant de 90 ° dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.</li>
		<li>Appuyez sur Close Shuttle Valve & Pump sur l’écran d’affichage pour lancer l’évacuation de la navette.</li>
		<li>Une fois que le message Shuttle ready to detach s’affiche sur l’écran tactile, appuyez sur le levier situé sous la navette et soulevez-le soigneusement à l’aide de la poignée en haut.</li>
		<li>Transportez la navette jusqu’au sas de la station d’extrémité de vide en position verticale.</li>
		<li>Fixez la navette au sas de la station d’extrémité de vide. REMARQUE: Une fois bien fixé, l’écran tactile de la station d’extrémité confirmera l’état de la navette et du verrouillage.</li>
		<li>Sélectionnez une position de bloc vide dans le récipient en appuyant sur le bouton correspondant sur l’écran tactile et en déplaçant l’hôtel d’échantillon à la position de chargement correcte.</li>
		<li>Une fois que l’exemple d’hôtel est en place, le bouton Ouvrir devient actif. Appuyez sur ce bouton pour lancer la séquence de verrouillage du vide. REMARQUE: La pompe démarrera et la progression sera affichée sur le moniteur. Cela peut prendre jusqu’à deux minutes.</li>
		<li>Une fois la séquence terminée, l’état passera à Airlock open, transfert en cours. Tournez la poignée de 90 ° dans le sens des aiguilles d’une montre pour déverrouiller la tige et poussez doucement la tige dans le récipient afin que la piste guidée impose à nouveau le bon chemin de déplacement vers la position de l’hôtel d’échantillonnage. À l’aide du flux vidéo affiché à l’écran pour vous guider, insérez lentement le bloc dans l’hôtel, en vous assurant que le voyant de position du bloc sur l’écran tactile est activé. Une fois activée, faites pivoter la poignée de 180 ° dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour libérer le bloc et tirez la tige hors du récipient. Une fois complètement rétracté, faites pivoter la poignée de 90° dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour verrouiller la tige.</li>
		<li>Une fois la tige verrouillée, le bouton Fermer devient actif. Appuyez dessus pour fermer la soupape de vide de la station d’extrémité et évacuer l’espace entre la navette et le récipient à la pression atmosphérique, en attendant jusqu’à 20 s pour l’achèvement.</li>
		<li>Attendez que l’affichage affiche l’état OK pour supprimer la navette une fois la séquence terminée. À ce stade, retirez la navette et revenez au CTS pour répéter le processus pour le bloc suivant.</li>
		<li>Pour préparer le bloc suivant pour le transfert, faites pivoter la rondelle de bloc à l’intérieur du bain. Poussez la clé de rotation intégrée sur le dessus du couvercle en acrylique vers le bas dans la serrure au centre de la rondelle de bloc. Tout en le maintenant enfoncé, tournez la clé pour positionner le bloc souhaité en position de ramassage.</li>
		<li>Une fois que tous les blocs ont été transférés, assurez-vous que la vanne de navette est ouverte pendant qu’elle est montée sur le CTS. Appuyez sur le bouton de cuisson sur l’écran tactile, sélectionnez à la fois le bain et la navette, puis appuyez sur cuire. REMARQUE: Cela réchauffe à la fois la navette et le bain pour faire bouillir l’azote liquide et ensuite évaporer toute glace / condensation accumulée avant la prochaine utilisation. Une fois la cuisson commencée, le gaz et l’air peuvent être éteints.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Green, D. W., Ingram, V. M., Perutz, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+haemoglobin+-+IV.+Sign+determination+by+the+isomorphous+replacement+method%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+A.+Mathematical+and+Physical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The structure of haemoglobin - IV. Sign determination by the isomorphous replacement method.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series A. Mathematical and Physical Sciences. 225 (1162), 287(1954).</li>
<li>Hendrickson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalous+diffraction+in+crystallographic+phase+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Anomalous diffraction in crystallographic phase evaluation.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 47 (1), 49-93 (2014).</li>
<li>Pike, A. C., Garman, E. F., Krojer, T., von Delft, F., Carpenter, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+heavy-atom+derivatization+of+protein+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">An overview of heavy-atom derivatization of protein crystals.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 303-318 (2016).</li>
<li>Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selenomethionyl+proteins+produced+for+analysis+by+multiwavelength+anomalous+diffraction+%28MAD%29%3A+A+vehicle+for+direct+determination+of+three-dimensional+structure%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): A vehicle for direct determination of three-dimensional structure.</a> The EMBO Journal. 9 (5), 1665-1672 (1990).</li>
<li>Liu, Q., Hendrickson, W. A. Contemporary use of anomalous diffraction in biomolecular structure analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiu%2C+Q+%22Protein+Crystallography.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Protein Crystallography. Methods in Molecular Biology</a>. Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. 1607, Humana Press. New York, NY. 377-399 (2017).</li>
<li>Rose, J. P., Wang, B. C., Weiss, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+SAD+is+maturing%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Native SAD is maturing.</a> IUCrJ. 2 (4), 431-440 (2015).</li>
<li>Rozov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+potassium+ions+for+ribosome+structure+and+function+revealed+by+long-wavelength+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Importance of potassium ions for ribosome structure and function revealed by long-wavelength X-ray diffraction.</a> Nature Communications. 10 (1), 2519(2019).</li>
<li>Rocchio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+dynamic%2C+partially+occupied+residues+using+anomalous+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Identifying dynamic, partially occupied residues using anomalous scattering.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75 (12), 1084-1095 (2019).</li>
<li>Langan, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalous+X-ray+diffraction+studies+of+ion+transport+in+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Anomalous X-ray diffraction studies of ion transport in K+ channels.</a> Nature Communications. 9 (1), 4540(2018).</li>
<li>Lolicato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K2p+channel+C-type+gating+involves+asymmetric+selectivity+filter+order-disorder+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">K2p channel C-type gating involves asymmetric selectivity filter order-disorder transitions.</a> Science Advances. 6 (44), (2020).</li>
<li>Thorn, A., Sheldrick, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ANODE%3A+anomalous+and+heavy-atom+density+calculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">ANODE: anomalous and heavy-atom density calculation.</a> Journal of Applied Crystallography. 44 (6), 1285-1287 (2011).</li>
<li>Handing, K. B., Niedzialkowska, E., Shabalin, I. G., Kuhn, M. L., Zheng, H., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+metal-binding+sites+in+proteins+with+X-ray+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Characterizing metal-binding sites in proteins with X-ray crystallography.</a> Nature Protocols. 13 (5), 1062-1090 (2018).</li>
<li>Jungnickel, K. E. J., Parker, J. L., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+amino+acid+transport+by+the+CAT+family+of+SLC7+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural basis for amino acid transport by the CAT family of SLC7 transporters.</a> Nature Communications. 9 (1), 550(2018).</li>
<li>Wagner, A., Duman, R., Henderson, K., Mykhaylyk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vacuum+long-wavelength+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">In-vacuum long-wavelength macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 430-439 (2016).</li>
<li>Wernecke, J., Gollwitzer, C., Müller, P., Krumrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+in-vacuum+PILATUS+1M+detector%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">Characterization of an in-vacuum PILATUS 1M detector.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 21 (3), 529-536 (2014).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li>
<li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIALS%3A+Implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).</li>
<li>Brockhauser, S., Di Michiel, M., Mcgeehan, J. E., Mccarthy, A. A., Ravelli, R. B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+tomographic+reconstruction+of+macromolecular+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">X-ray tomographic reconstruction of macromolecular samples.</a> Journal of Applied Crystallography. 41 (6), 1057-1066 (2008).</li>
<li>Kitano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+membrane+protein+crystal+using+ultraviolet+laser+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Processing of membrane protein crystal using ultraviolet laser irradiation.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 100 (1), 50-53 (2005).</li>
<li>Mykhaylyk, V., Wagner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+long-wavelength+protein+crystallography%3A+Keeping+a+protein+crystal+frozen+in+vacuum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics%3A+Conference+Series%22%5BJournal%5D)">Towards long-wavelength protein crystallography: Keeping a protein crystal frozen in vacuum.</a> Journal of Physics: Conference Series. 425 (1), 012010(2013).</li>
<li>Snell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+sample+mounting+and+alignment+system+for+biological+crystallography+at+a+synchrotron+source%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Automated sample mounting and alignment system for biological crystallography at a synchrotron source.</a> Structure. 12 (4), 537-545 (2004).</li>
<li>The universal container project. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://smb.slac.stanford.edu/robosync/Universal_Puck/">https://smb.slac.stanford.edu/robosync/Universal_Puck/</a> (2020).</li>
<li>Teng, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mounting+of+crystals+for+macromolecular+crystallography+in+a+freestanding+thin-film%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a freestanding thin-film.</a> Journal of Applied Crystallography. 23, 387-391 (1990).</li>
<li>Esposito, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+glycosyltransferase+activity+of+the+salmonella+effector+SseK3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the glycosyltransferase activity of the salmonella effector SseK3.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (14), 5064-5078 (2018).</li>
<li>O'Donnell, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+EMC+reveals+a+path+for+membrane+protein+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The architecture of EMC reveals a path for membrane protein insertion.</a> eLife. 9, 57887(2020).</li>
<li>Mishra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+characterization+of+crimean-congo+hemorrhagic+fever+virus+GP38%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Structure and characterization of crimean-congo hemorrhagic fever virus GP38.</a> Journal of Virology. 94 (8), 02005-02019 (2020).</li>
<li>Rudolf, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphogen+sonic+hedgehog+inhibits+its+receptor+patched+by+a+pincer+grasp+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The morphogen sonic hedgehog inhibits its receptor patched by a pincer grasp mechanism.</a> Nature Chemical Biology. 15 (10), 975-982 (2019).</li>
<li>El Omari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+limits+of+sulfur+sad+phasing%3A+De+novo+structure+solution+of+the+n-terminal+domain+of+the+ectodomain+of+hcv+e1%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Pushing the limits of sulfur sad phasing: De novo structure solution of the n-terminal domain of the ectodomain of hcv e1.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 70 (8), 2197-2203 (2014).</li>
<li>Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XIA2%3A+an+expert+system+for+macromolecular+crystallography+data+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">XIA2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction.</a> Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).</li>
<li>Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Buccaneer+software+for+automated+model+building.+1.+Tracing+protein+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">The Buccaneer software for automated model building. 1. Tracing protein chains.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 62 (9), 1002-1011 (2006).</li>
<li>Skubak, P., Pannu, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+protein+structure+solution+from+weak+X-ray+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Automatic protein structure solution from weak X-ray data.</a> Nature Communications. 4 (1), 2777(2013).</li>
</ol>

Le protocole actuel a été développé pour se conformer aux exigences de préparation des échantillons pour les expériences MX à longue longueur d’onde sous vide sur la ligne de faisceau I23. Il est utilisé sur la ligne de faisceau depuis un an et a contribué à la réussite de plusieurs projets. Comme l’indiquent les résultats présentés ici, le protocole permet un transfert sûr et fiable des échantillons vers la station d’extrémité du vide tout en préservant leur qualité de diffraction. Il s’agit d’un aspect important pour l’exploitation de la ligne de faisceau et sera accompagné d’une formation en personne des utilisateurs par le personnel de la ligne de faisceau. Certaines des étapes méritent d’être soulignées comme essentielles à l’achèvement réussi et sûr de la procédure: le transfert d’échantillons de bases combipuck à des blocs d’échantillons nécessite précision et attention pour éviter d’endommager les échantillons (voir étape 2.1.4); la surveillance du niveau d’azote liquide à tous les stades est importante pour éviter que les échantillons ne soient exposés à l’air ou qu’ils soient en contact étroit avec des pièces qui ne sont pas correctement refroidies (2.1.3 et 2.2.2); attendre que la séquence de fermeture (2.2.14) soit complètement terminée, avant de retirer la navette de la station d’extrémité (2.2.15), afin d’éviter la dégradation du vide de la station d’extrémité.
La conception du protocole a été initiée en même temps qu’un effort d’ingénierie visant à développer un équipement spécialement conçu pour le transfert de cristaux de protéines dans l’environnement sous vide. Les produits finaux de ce projet étaient le CTS et les outils de manipulation des échantillons associés décrits ci-dessus. Le CTS est une amélioration significative par rapport à son prédécesseur, le Leica EM VCT10014, et supprime de multiples limitations, telles que l’absence de blindage des échantillons et d’environnement de vide pendant le transfert, l’accumulation de glace à l’intérieur du bain d’azote liquide et l’absence d’interface utilisateur intuitive et de fonctions de sécurité. Les caractéristiques supplémentaires du CTS qui améliorent l’expérience utilisateur sont la surveillance de la température et du niveau d’azote liquide à l’intérieur de la navette et de la station d’échantillonnage, un bain de plus grande capacité pouvant accueillir quatre blocs simultanément, plutôt qu’un, et un mécanisme autoguidé pour le fonctionnement de la navette. Le CTS est entièrement intégré au système de contrôle de la ligne de faisceau avec une interface tactile conviviale et une sécurité mécanique et de vide améliorée lors de l’interfaçage avec la station d’extrémité.
Beamline I23 est le premier instrument synchrotron MX à longue longueur d’onde de ce type et, en tant que tel, l’introduction de cristaux de protéines dans un environnement à vide poussé et leur stockage à des températures cryogéniques ont nécessité des efforts considérables. Des améliorations aux outils et au protocole de préparation des échantillons, ainsi que des efforts visant à rationaliser les processus, sont en cours. Dans le cadre du support utilisateur, le personnel de la ligne de faisceau est toujours disponible pour aider au dépannage. Un exemple d’un tel scénario serait les problèmes qui compromettent l’intégrité du système de vide, ce qui entraîne des difficultés à attacher ou à retirer la navette vers / depuis le CTS ou le sas de la station d’extrémité. Différents niveaux de tests sont effectués sur une base hebdomadaire et quotidienne, et la formation des utilisateurs couvrira des contrôles supplémentaires pour éviter les défaillances potentielles, comme l’inspection visuelle des joints toriques sur les interfaces auxquelles la navette se fixe. Alors que l’environnement sous vide ouvre la possibilité d’effectuer des expériences de diffraction dans une gamme de longueurs d’onde non accessible à d’autres lignes de faisceau, l’étape de transfert supplémentaire réduit le débit global de l’échantillon.
Le transfert manuel avec seulement quatre échantillons par bloc de transfert et jusqu’à cinq blocs à l’intérieur de la cuve à vide limite la capacité totale à 20 échantillons. Par conséquent, pour les projets avec un échantillon important à la variabilité de l’échantillon, les échantillons doivent être présélectionnés aux lignes de faisceau à haut débit Diamond, puis seuls les échantillons les plus prometteurs doivent être transférés pour l’expérience de longue longueur d’onde optimisée ultérieure. Alors que les porte-échantillons et les blocs de transfert sont inchangés par rapport à leur introduction initiale il y a quelques années, les outils de manipulation présentés ici sont tous de nouveaux développements. Les porte-échantillons dédiés I23 sont immuables en raison de leur rôle dans le concept de refroidissement de la ligne de faisceau. En tant que tel, la conception des outils de manipulation des échantillons visait à créer un lien entre ce nouveau type de support et les outils standard disponibles dans le commerce que la communauté des utilisateurs MX avait adoptés depuis longtemps, tels que les combipucks, les baguettes de récolte de cristaux et le système de transport de l’expéditeur sec. Leur conception a nécessité une consultation importante avec la communauté des utilisateurs et a nécessité plusieurs itérations. L’équipement, les outils et le protocole présentés ici représentent un système simple et robuste pour le transfert d’échantillons d’utilisateurs pour des expériences à la ligne de faisceau I23 à Diamond Light Source. Cet instrument de cristallographie macromoléculaire à longue longueur d’onde sous vide ouvre de nouvelles opportunités pour la biologie structurale.

La diffraction des rayons X à longue longueur d’onde est utilisée pour exploiter les propriétés de diffusion anormales d’atomes de lumière spécifiques présents nativement dans les macromolécules. Cela aide à résoudre le problème de la phase cristallographique et à confirmer sans ambiguïté l’identité et l’emplacement de ces éléments dans les macromolécules. Alors qu’aux débuts de la cristallographie macromoléculaire, les structures de novo étaient résolues par de multiples remplacements isomorphes1, avec l’avènement des lignes de faisceau de rayons X accordables aux synchrotrons, le phasage expérimental basé sur des techniques de diffraction anormale multi-longueurs d’onde et à longueur d’onde unique (SAD) est devenu la méthode dominante2 . Les deux méthodes se sont historiquement appuyées sur le signal isomorphe ou anormal des métaux lourds, qui doivent être introduits artificiellement dans les cristaux par cocristallisation ou trempage des cristaux3. L’approche par essais et erreurs et les résultats imprévisibles peuvent rendre ces expériences frustrantes et chronophages. L’incorporation de séléno-méthionine lors de l’expression des protéines4 est un moyen très élégant de surmonter ces limitations et d’exploiter la diffraction anormale à de courtes longueurs d’onde, bien qu’elle puisse être très difficile dans les systèmes d’expression des protéines eucaryotes.
La MX à longue longueur d’onde est extrêmement attrayante pour la détermination de la structure par des expériences natives de TAS5,6 en raison de la commodité d’utiliser des cristaux directement issus d’un essai de cristallisation réussi sans traitement supplémentaire. De plus, l’accès aux bords d’absorption d’éléments de haute importance biologique, tels que le calcium, le potassium, le chlore, le soufre et le phosphore, ouvre la possibilité d’identifier directement les positions de ces éléments dans les macromolécules7,8,9,10. À moyenne et basse résolution, l’assignation d’éléments basée sur la densité d’électrons 2Fo-Fc et l’environnement chimique peut être difficile, en particulier pour les éléments ayant un nombre similaire d’électrons ou des ions faiblement liés avec des occupations partielles. Ces ambiguïtés peuvent être résolues en collectant des données au-dessous et au-dessus du bord d’absorption de l’élément d’intérêt et en interprétant la différence anormale par le modèle résultante des cartes de Fourier11,12. La localisation des positions des atomes de soufre dans ces cartes peut également faciliter la construction de modèles dans des cartes de densité d’électrons à basse résolution13. Les bords d’absorption de ces éléments lumineux sont observés à des longueurs d’onde comprises entre λ = 3 et 6 Å (voir Figure 1, en haut). Cette gamme de longueurs d’onde a été bien au-delà des capacités de toute ligne de faisceau SYNCHROTRON MX, et un fonctionnement efficace dans cette gamme nécessite de surmonter plusieurs défis techniques, comme indiqué ci-dessous.
La ligne de faisceau I23 de Diamond Light Source, au Royaume-Uni, est un instrument unique, spécialement conçu pour faciliter les expériences MX de longue longueur d’onde, accordable dans une gamme de longueurs d’onde comprise entre λ = 1,13 et 5,9 Å (plage d’énergie comprise entre E = 2,1 et 11 keV). En fonctionnant dans un environnement à vide poussé14, l’absorption et la diffusion de l’air sont éliminées, ce qui améliore l’efficacité des expériences de diffraction et le rapport signal/bruit. Une grande station d’extrémité de vide englobe tous les composants de l’environnement de l’échantillon, y compris le détecteur semi-cylindrique Pilatus 12M, un goniomètre multi-axes, les systèmes de visualisation et de collimation en ligne, ainsi que l’équipement sur mesure pour le transfert et le stockage des échantillons (Figure 2). Chaque équipement a été optimisé pour garantir la collecte de données de longue longueur d’onde de la meilleure qualité. Le détecteur pilatus 12M incurvé peut collecter des angles de diffraction de 2θ = ±100°, ce qui donne des données de diffraction suffisamment élevées, même aux longueurs d’onde les plus longues (Figure 1, en bas). Les 120 modules de détection ont été spécifiquement sélectionnés pour la compatibilité à faible consommation d’énergie et des étalonnages pour un mode de gain ultra-élevé supplémentaire ont été fournis.
Le seuil de détection le plus bas possible est de 1,8 keV, ce qui entraîne une augmentation des effets de coin et de bord pour les énergies inférieures à 3,6 keV et une qualité de données compromise aux longueurs d’onde les plus longues, en particulier pour les cristaux de faible mosaïquence, peut être observée. Cet effet, combiné à la diminution de l’efficacité quantique du détecteur15, doit être pris en considération lors de la planification d’une expérience. Le goniomètre multi-axes permet la réorientation des cristaux pour permettre des stratégies de collecte de données qui maximisent la qualité et la force du signal anormal, ainsi que l’exhaustivité des données anormales collectées. L’absorption de l’échantillon est un facteur limitant pour les expériences, en particulier aux longueurs d’onde les plus longues. Les corrections d’absorption, telles qu’elles sont mises en œuvre dans les progiciels de traitement MX couramment utilisés16,17, fonctionnent bien à des longueurs d’onde autour de 3 Å. Des longueurs d’onde plus longues nécessiteront des corrections analytiques d’absorption basées sur des reconstructions tomographiques18 ou une ablation au laser pour éliminer les matériaux non diffractants et découper les cristaux en formes bien définies19. Ce dernier aidera également à réduire la taille des cristaux plus gros, car les expériences de diffraction des rayons X à des longueurs d’onde plus longues sont plus efficaces pour les cristaux plus petits14. Le défi de la conservation des échantillons à des températures cryogéniques pendant la collecte des données est relevé par le refroidissement conducteur, car l’utilisation de dispositifs à flux de gaz froid à flux ouvert n’est pas compatible avec un environnement sous vide. Par conséquent, des matériaux thermiquement conducteurs, tels que le cuivre, sont nécessaires pour connecter l’échantillon à un refroidisseur cryogénique à tube d’impulsion. Les broches standard SPINE en acier inoxydable utilisées dans MX, ainsi que tout autre support d’échantillon disponible dans le commerce, ne conviennent pas à la MX à longue longueur d’onde sous vide en raison de leur faible conductivité thermique.
Les porte-échantillons (SH) pour MX sous vide doivent être une partie essentielle de la voie thermique d’évacuation de la chaleur (Figure 3A). En tant que tels, ils se composent d’un corps et d’une broche en cuivre thermiquement conducteurs et comprennent deux caractéristiques importantes: une base magnétique forte pour assurer une liaison thermique adéquate avec la tête du goniomètre froid, et un support d’échantillon, en polyimide, pour minimiser l’absorption et la diffusion des rayons X20. Des efforts ont été déployés pour s’assurer que l’expérience utilisateur de la récolte des cristaux et du refroidissement par flash est presque identique à celle associée aux pratiques MX standard. Comme les I23 SH dédiés ne sont pas directement compatibles avec d’autres lignes de faisceau synchrotron, un adaptateur en acier inoxydable est utilisé pour la compatibilité avec les baguettes magnétiques à récupération de cristaux et les interfaces goniomètre existantes sur d’autres lignes de faisceau MX (Figure 3B). L’adaptateur est également important pour utiliser les installations d’automatisation sur d’autres lignes de faisceau Diamond MX, qui sont basées sur des têtes de préhension de robot de type ALS21 et des configurations de base de style unipuck22, si la variation de l’échantillon nécessite un pré-criblage rapide pour la sélection des meilleurs cristaux diffractants. Le protocole de préparation et de chargement de l’échantillon peut être divisé en deux étapes :
Étape 1 : Récolte des cristaux et congélation éclair effectuée par les utilisateurs dans leurs propres laboratoires
Après l’évaluation de l’adéquation du projet pour la collecte de données I23, des porte-échantillons avec des boucles correspondant à la taille des cristaux (pré-assemblés avec des adaptateurs) sont envoyés aux laboratoires utilisateurs pour la récolte des cristaux. Pour éviter tout dommage, les SH et les adaptateurs ne doivent pas être séparés et doivent être utilisés comme une seule unité dans le but de pêcher des cristaux avec des boucles de taille appropriée à l’aide de baguettes magnétiques standard de récolte de cristaux. Comme c’est souvent le cas en MX, cette tâche est effectuée manuellement au microscope et les cristaux sont immédiatement refroidis par flash dans un dewar en mousse avec de l’azote liquide23. En raison d’un décalage des forces magnétiques, les SH ne sont actuellement pas compatibles avec les unipucks. Le stockage et l’expédition sont réalisés à l’aide de combipucks (voir le tableau des matériaux), qui sont disponibles pour les utilisateurs sur demande, ainsi que les inserts d’expéditeur sec compatibles (Figure 3C). Ces rondelles partagent la même plaque de base avec les unipucks largement utilisés et permettent un pré-criblage rapide des échantillons sur d’autres lignes de faisceau Diamond MX. Le prêt de cet équipement aux utilisateurs est actuellement le meilleur arrangement, jusqu’à ce que les porte-échantillons sur mesure soient disponibles dans le commerce. Le transport vers la ligne de faisceau nécessite les expéditeurs secs standard utilisés dans la communauté MX.
Étape 2 : Transfert des échantillons cryo-refroidis dans la station d’extrémité sous vide
Une fois que les échantillons arrivent sur la ligne de faisceau, ils sont préparés pour être transférés dans la station d’extrémité du vide. Cela implique le retrait des SH des combipucks et la séparation des adaptateurs. L’introduction d’échantillons biologiques dans le vide est systématiquement effectuée dans le domaine de la cryo-microscopie électronique. Certains des concepts bien établis ont été adaptés pour le transfert d’échantillons I23. En bref, les SH sont transférés sous azote liquide sur des blocs de transfert (Figure 3D). Ces blocs ont une excellente conductivité thermique et une masse thermique importante, empêchant les cristaux d’atteindre la température de transition vitreuse dans le vide. Jusqu’à quatre blocs, d’une capacité de quatre échantillons chacun, sont chargés sous azote liquide dans une rondelle de bloc (figure 3H), qui est utilisée soit pour transférer des échantillons vers le système de transfert cryogénique (CTS), soit pour le stockage dans des dewars d’azote liquide entre les expériences.
Le système de transfert cryogénique développé à Diamond Light Source comprend deux sous-ensembles, la station d’échantillonnage et la navette (Figure 4A). La station d’échantillonnage se compose d’un bain d’azote liquide pour le stockage temporaire des cristaux de protéines et possède des caractéristiques spécifiques pour assurer la sécurité et permettre une expérience conviviale (Figure 5). Le CTS est contrôlé par un contrôleur logique programmable via une interface à écran tactile conviviale. La station d’échantillonnage est équipée de diodes électroluminescentes intégrées pour une meilleure visualisation et d’un ensemble de dispositifs de chauffage contrôlés en boucle rapprochée pour automatiser le séchage du bain d’azote liquide une fois les échantillons transférés. Il dispose également d’une variété de capteurs pour assurer la sécurité et le fonctionnement efficace du système. La station d’échantillonnage dispose d’un matériel sur mesure pour fournir une interface électrique fiable permettant d’interagir avec la navette pour les opérations, telles que le pompage jusqu’au vide brut pour le transfert d’échantillons, ainsi que la surveillance des niveaux d’azote liquide et de la température à l’intérieur de la navette.
La navette (figure 6) est un dispositif portable utilisé pour ramasser un bloc de transfert du bain d’azote liquide de la station d’échantillonnage et le transférer à l’intérieur d’un environnement cryogénique et sous vide jusqu’à la station finale. Il comprend un dewar à l’azote liquide pour garder les échantillons au froid pendant le transfert, une surveillance du niveau de liquide dans le dewar et une variété de capteurs pour le fonctionnement et la sécurité de l’utilisateur. Le bras de transfert est équipé d’un entraînement magnétique et comprend des rainures usinées pour guider les utilisateurs dans le chargement et le déchargement en toute sécurité des blocs de transfert dans la station d’extrémité. Le transfert de la navette à la cuve à vide s’effectue via un sas. Le sas est une interface pour la navette sur la station d’extrémité utilisée pour évacuer l’espace entre la navette et la station d’extrémité, avant d’ouvrir la navette et les soupapes de dépression de la station d’extrémité. Les séquences de pompage et de ventilation sont entièrement automatisées et peuvent être commandées via un grand écran tactile avec une interface conviviale (Figure 4C). Le protocole actuel est utilisé pour transférer un cristal de thaumatine à la station d’extrémité du vide pour la collecte de données.

<table><tbody><tr><td>Détecteur 12M</td><td>Dectris, Suisse</td><td></td><td>Détecteur de rayons X à comptage de photons uniques</td></tr><tr><td>CombiPuck</td><td>MiTeGen</td><td>SKU : M-CBP-P1</td><td>Cryopucks utilisés pour le stockage cryogénique et le transport de porte-échantillons I23 et d’échantillons</td></tr><tr><td>Baguette magnétique de récolte de cristaux</td><td>Dimensions moléculaires</td><td>MD7-411</td><td>Utilisé pour la récolte de cristaux</td></tr><tr><td>Dry Shipper (CX100)</td><td>Dimensions moléculaires</td><td>MD7-21</td><td>Utilisé pour le stockage cryogénique et le transport de porte-échantillons I23 et d’échantillons Insert d’expédition</td></tr><tr><td>sec (CombiPuck Transport Cane)</td><td>MiTeGen</td><td>SKU : M-CBP-PTC1</td><td>Utilisé pour le stockage cryogénique et le transport de porte-échantillons I23 et d’échantillons</td></tr><tr><td>Kapton polyimide</td><td></td><td></td><td>support d’échantillon en polyimide Kapton</td></tr><tr>, couvercle <td></td><td></td><td>Perpsex</td><td>, couvercle acrylique avec clé de rotation intégrée</td></tr><tr>,<td>poudre de thaumatine</td><td>&nbsp ; Sigma-Aldrich<</td><td>strong>T7638</td><td>Utilisé pour la production de cristaux de thaumatine par diffusion de vapeur</td></tr></tbody></table>

protocole de préparation et de transfert d’échantillons pour la cristallographie à longue longueur d’onde sous vide sur la ligne de faisceau i23 à la source lumineuse diamond

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

La cristallographie macromoléculaire (MX) à longue longueur d’onde exploite les propriétés de diffusion anormales d’éléments, tels que le soufre, le phosphore, le potassium, le chlore ou le calcium, qui sont souvent présents nativement dans les macromolécules. Cela permet la solution de structure directe des protéines et des acides nucléiques via un phasage expérimental sans avoir besoin d’un marquage supplémentaire. Pour éliminer l’absorption d’air importante des rayons X dans ce régime de longueur d’onde, ces expériences sont réalisées dans un environnement sous vide. Beamline I23 à Diamond Light Source, au Royaume-Uni, est le premier instrument synchrotron de ce type, conçu et optimisé pour les expériences MX dans la gamme des longues longueurs d’onde vers 5 Å. 
Pour rendre cela possible, une grande cuve à vide entoure tous les composants de la station d’extrémité de l’environnement de l’échantillon. La nécessité de maintenir les échantillons à des températures cryogéniques pendant le stockage et la collecte de données sous vide nécessite l’utilisation de porte-échantillons thermoconducteurs. Cela facilite l’élimination efficace de la chaleur pour assurer le refroidissement de l’échantillon à environ 50 K. Le protocole actuel décrit les procédures utilisées pour la préparation des échantillons et le transfert des échantillons sous vide sur la ligne de faisceau I23. Assurant l’uniformité des pratiques et des méthodes déjà établies au sein de la communauté de la cristallographie macromoléculaire, le refroidissement des échantillons à la température de l’azote liquide peut être effectué dans n’importe quel laboratoire équipé d’outils MX standard. 
Le stockage cryogénique et le transport des échantillons ne nécessitent que l’équipement standard disponible dans le commerce. Un équipement spécialisé est nécessaire pour le transfert de cristaux refroidis cryogéniquement de l’azote liquide vers la station d’extrémité du vide. Des outils de manipulation d’échantillons sur mesure et un système de transfert cryogénique (CTS) dédié ont été développés en interne. Les données de diffraction recueillies sur les échantillons préparés à l’aide de ce protocole montrent d’excellentes statistiques de fusion, indiquant que la qualité des échantillons n’est pas modifiée pendant la procédure. Cela ouvre des opportunités uniques pour la MX sous vide dans une gamme de longueurs d’onde au-delà des lignes de faisceau synchrotron standard.

Un cristal de thaumatine a été introduit dans la station d’extrémité du vide en utilisant le protocole décrit ci-dessus. Les données de diffraction ont été collectées à une longueur d’onde de 2,7552 Å (E = 4500 eV) sous forme d’images 3600 avec un incrément de rotation de 0,1° et une exposition de 0,1 s par image. La taille du faisceau a été ajustée à 150 μm x 150 μm et réduite à 10% de transmission, avec une mesure de flux correspondante de 7,1 x 109 photons / s. Le choix de λ = 2,7552 Å est basé sur un compromis entre l’augmentation des effets d’absorption du signal anormal et de l’échantillon et la diminution de la résolution à des longueurs d’onde plus longues. Bien qu’elle ne soit pas proche du bord d’absorption théorique du soufre (λ = 5,0095 Å), à cette longueur d’onde, la contribution imaginaire au facteur de diffusion du soufre f » est de 1,57 e- , un facteur de 1,6-2,1 plus grand par rapport aux longueurs d’onde comprises entre 1,7 et 2 Å. Les signaux anormaux plus forts qui en résultent permettent un phasage S-SAD réussi pour des projets plus difficiles.
Diverses expériences de phasage difficiles ont déjà été menées sur la ligne de faisceau I2324,25,26,27, avec des données collectées à cette longueur d’onde. Bien que le phasage par S-SAD soit possible en utilisant des longueurs d’onde beaucoup plus courtes, cela nécessite souvent la construction d’un signal anormal en fusionnant les données de nombreux cristaux isomorphes pour atteindre des valeurs de multiplicité supérieures à 10028. En raison du signal anormal amélioré à des longueurs d’onde plus longues, la plupart des projets de phasage résolus sur I23 ne nécessitaient que des données d’un seul cristal. Une image de diffraction représentative est illustrée à la figure 7, à gauche. Le traitement des données à l’aide de Xia2-3dii29 a produit d’excellentes statistiques de fusion, comme indiqué dans le tableau 1. La figure 7, à droite, montre une partie d’une image de diffraction représentative de l’ensemble de données thaumatin et illustre le faible arrière-plan entourant les réflexions de Bragg, ce qui contribue aux grandes valeurs I/σ(I) généralement observées dans la configuration du vide, garantissant que seuls les rayons X diffusés par l’échantillon atteignent le détecteur.
La résolution maximale réalisable de 1,8 Å est due à la géométrie du détecteur et à la longueur d’onde choisie du rayonnement X. L’ensemble de données a produit un signal anormal très fort, reflété dans la pente moyenne du paramètre de probabilité normale anormale de 2,677, facilitant la solution de la structure par le pipeline de phasage automatique CRANK2. La haute qualité de la carte de densité d’électrons résultante a permis la construction automatique réussie de modèles par le module Buccaneer30 dans CRANK231, avec un placement correct pour 100% de la séquence d’acides aminés de la thaumatine. La carte de Fourier à différence anormale phasée, calculée avec ANODE11, révèle 16 atomes de soufre très bien ordonnés et un atome de soufre de Cys159 avec deux conformations alternatives, comme le confirment les 18 hauteurs significatives des pics aux positions des diffuseurs anormaux du tableau 2. Les 16 résidus de cystéine dans la thaumatine forment 8 ponts disulfurés, qui sont tous clairement visibles sur la carte 2Fo-Fc (Figure 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig01.jpg"> Figure 1 : Données de diffraction à haute résolution provenant d’expériences MX de longue longueur d’onde. (A) Tracé des valeurs f » par rapport à l’énergie, indiquant les bords d’absorption des éléments lumineux accessibles sur la ligne de faisceau I23. (B) Résolution maximale réalisable aux coins du détecteur P12M contre l’énergie. Abréviation : MX = cristallographie macromoléculaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig02.jpg"> Figure 2 : Section horizontale à travers la cuve à vide avec tous les composants de la station d’extrémité. Abréviation : OAV = système de visualisation sur axe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig03.jpg"> Figure 3: Outils de manipulation des échantillons. (A) I23 Porte-échantillons. (B) Broche standard MX (à gauche) à côté d’un porte-échantillon I23 avec adaptateur (à droite). (C) Couvercle et base Combipuck avec porte-échantillons I23 (bleu). Couvercle et base de la rondelle de bloc avec deux blocs de transfert (or). Une canne d’expéditeur sèche, compatible avec les combipucks et les rondelles de bloc, est visible à l’arrière. (D) Bloc de transfert avec quatre porte-échantillons I23. (E) Outil clé utilisé pour la rotation de la base de la rondelle de bloc. (F) Baguette de séparation. (G) Outil séparateur de rondelle avec deux flèches indiquant les paramètres haut et bas. (H) Base de rondelle de bloc avec quatre blocs de Cu vides. (I) Couvercle pour la rondelle de bloc. (J) Récipient en mousse avec tous les outils nécessaires pour transférer les porte-échantillons des bases combipuck aux blocs de cuivre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig04.jpg"> Figure 4 : Système de transfert cryogénique. (A) Station d’échantillonnage CTS avec navette attachée et les entonnoirs utilisés pour le remplissage. (B) Une rondelle de bloc avec deux blocs de transfert positionnés à l’intérieur du CTS. (C) Écran tactile du logiciel de contrôle CTS. Abréviation : CTS = Cryogenic Transfer System. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig05.jpg"> Figure 5 : Station d’échantillonnage du système de transfert cryogénique. Abréviations: LED = diodes électroluminescentes; LN2 = azote liquide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig06.jpg"> Figure 6 : Navette du système de transfert cryogénique. Abréviations: LED = diodes électroluminescentes; LN2 = azote liquide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig07.jpg"> Figure 7 : Images de diffraction. À gauche, une image de diffraction de l’ensemble de données recueillie sur le cristal de thaumatine. À droite, un point de diffraction entouré de pixels d’arrière-plan à faible nombre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig08.jpg"> Figure 8 : Solution de structure de Thaumatin avec pipeline automatique CRANK2 (réglages par défaut, pas d’affinement ultérieur). (A) Vue d’ensemble de thaumatin avec carte 2Fo-Fc à 1,6σ (bleu) et différence anormale phasée carte de Fourier à 5σ calculée en ANODE (vert). (B) Vue d’ensemble de la thaumatin montrant seulement la différence anormale phasée de la carte de Fourier à 5σ. (C) Vue rapprochée d’un pont disulfure présent dans la thaumatine avec la carte 2Fo-Fc à 1,6σ (bleu) et la carte de Fourier à différence anormale phasée à 5σ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig08large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nom</td>
			<td>Thaumatin</td>
		</tr>
<tr>
<td>Longueur d’onde de collecte de données (Å) (énergie (eV))</td>
			<td>2.7552 (4500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nombre d’images x taille du coin (°)</td>
			<td>3600 x 0,1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Groupe d’espace</td>
			<td>
P 41212</td>
		</tr>
<tr>
<td>Constantes de cellule unitaire</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(a = b, c) (Å)</td>
			<td>57.8, 150.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>(α = β = γ) (°)</td>
			<td>90</td>
		</tr>
<tr>
<td>Résolution (Å)</td>
			<td>150.22–1.80 (1.84–1.80)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Complétude</td>
			<td>96.3 (81.1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Isa</td>
			<td>36.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas</td>
			<td>0.042 (0.118)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rpim</td>
			<td>0.01 (0.049)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC1/2</td>
			<td>1 (0.989)</td>
		</tr>
<tr>
<td>I/σ(I)</td>
			<td>57.9 (14.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Multiplicité</td>
			<td>15.0 (5.4)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pente moyenne</td>
			<td>2.677</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1: Statistiques de collecte et de traitement des données pour Thaumatin à 2,755 Å longueur d’onde à la ligne de faisceau I23, DLS. Pour la résolution, l’exhaustivité, Rmerge, Rmeas, Rpim, CC1/2, I/σ(I) et la multiplicité, les coques haute résolution sont indiquées entre parenthèses. Abréviation : DLS = Diamond Light Source.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Atome le plus proche</td>
			<td>Hauteur maximale (sigma)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS9</td>
			<td>25.83</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS56</td>
			<td>25.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>MET112</td>
			<td>24.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS149</td>
			<td>24.37</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS126</td>
			<td>24.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS145</td>
			<td>24.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS134</td>
			<td>23.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS177</td>
			<td>23.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS204</td>
			<td>23.43</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS66</td>
			<td>23.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS164</td>
			<td>22.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS193</td>
			<td>22.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS158</td>
			<td>21.51</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS77</td>
			<td>21.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS121</td>
			<td>20.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS71</td>
			<td>19.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS159_1</td>
			<td>12.27</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS159_2</td>
			<td>8.34</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Différence anormale des hauteurs de pic de la carte de Fourier calculées par ANODE à l’aide du modèle phasé et construit automatiquement à partir de CRANK2.

Nous présentons ici un protocole pour la préparation d’échantillons cryogéniques et le transfert de cristaux dans la station d’extrémité sous vide sur la ligne de faisceau I23 à Diamond Light Source, pour des expériences de cristallographie macromoléculaire à rayons X de longue longueur d’onde.

Protocole de préparation et de transfert d’échantillons pour la cristallographie à longue longueur d’onde sous vide sur la ligne de faisceau I23 à la source lumineuse Diamond

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

La cristallographie macromoléculaire à longue longueur d’onde exploite le signal anormal des atomes de lumière présents nativement dans les protéines et les acides nucléiques. Cette technique est utilisée pour résoudre expérimentalement le problème du visage cristallographique et pour déterminer l’identité et l’emplacement de ces éléments. Beamline I23 à Diamond Light Source est un instrument synchrotron unique optimisé pour les expériences à de longues longueurs d’onde jusqu’à cinq angstrom.Il permet d’accéder aux bords d’absorption d’éléments de haute pertinence biologique, tels que le calcium, le potassium, le chlore, le soufre et le phosphore. En raison de l’absorption importante des rayons X par l’air dans le régime des longues longueurs d’onde, ces expériences sont réalisées dans un environnement sous vide. Pour maintenir les échantillons à des températures cryogéniques à l’intérieur de l’environnement sous vide, les cristaux sont montés sur des porte-échantillons dédiés et thermoconducteurs.Le transfert d’échantillon cryogénique de l’azote liquide à la station d’extrémité du vide est très similaire aux techniques utilisées en cryo-microscopie électronique. Ce protocole présente la procédure de transfert des cristaux dans l’environnement sous vide à l’aide des outils et équipements développés chez Diamond Light Source. Commencez par séparer le couvercle de la base du CombiPuck de manière à ce que les porte-échantillons restent attachés à la base et que les flacons soient retenus dans le couvercle.Immergez le couvercle avec des flacons dans de l’azote liquide, puis fixez un porte-échantillon et un adaptateur à une baguette magnétique et récoltez les cristaux. Refroidir chaque échantillon directement dans le CombiPuck, en notant la position de l’échantillon. Pour fermer la rondelle, utilisez une baguette de rondelle pour attacher la base au couvercle.Transférez le CombiPuck de l’azote liquide à l’expéditeur sec ou au stockage. Placez la base de la rondelle de bloc déjà remplie de blocs de transfert vides sur sa base de support dans un récipient en mousse, puis remplissez-la d’azote liquide. Ensuite, placez le CombiPuck dans le récipient en mousse rempli d’azote liquide, en vous assurant que la base de la rondelle est fixée au support magnétique à l’intérieur du récipient en mousse.Pré-refroidir tous les outils nécessaires dans de l’azote liquide. Ensuite, séparez le couvercle de la base à l’aide de l’outil séparateur de rondelle sur le réglage haut, de sorte que la base reste attachée au support magnétique, exposant les porte-échantillons à l’intérieur de l’azote liquide. Placez la baguette du séparateur sur le porte-échantillon et l’adaptateur aussi loin que possible, en vous assurant que la baguette est verticale.Déplacez le petit levier de la baguette du séparateur vers le bas avec votre pouce jusqu’à ce qu’il clique pour fixer le porte-échantillon à l’intérieur et tirez le porte-échantillon de l’adaptateur. Abaissez le séparateur sur la position souhaitée du bloc de transfert, en vous assurant que l’une des trois broches s’insère à l’intérieur du trou central du bloc de transfert. Relâchez le porte-échantillon en remontant le levier.Pour charger des échantillons dans le bloc de transfert suivant, utilisez l’outil de clé de carrousel pour faire pivoter un bloc de transfert vide en position horizontale. Une fois que tous les porte-échantillons sont transférés, fermez la rondelle de bloc en plaçant le couvercle dans de l’azote liquide. Attendez que la température s’équilibre, puis placez le couvercle sur la base et soulevez doucement pour vous libérer du carrousel.Attachez la navette à la gare. Ouvrez les vannes d’azote gazeux et d’air et assurez-vous que les gaz circulent. Ensuite, allumez le CTS.Refroidissez le bain et la navette avec de l’azote liquide. Placez l’entonnoir fourni dans l’orifice de remplissage de la navette et versez lentement de l’azote liquide dans l’entonnoir tout en surveillant le niveau sur l’écran. Arrêtez-vous lorsque l’indicateur passe du rouge au bleu.Remplissez le bain d’azote liquide à l’aide de l’entonnoir. Transférez une rondelle de bloc d’azote liquide vers le bain CTS à l’aide de l’outil séparateur de rondelle attaché. Retirez le couvercle de la rondelle de bloc et fermez le couvercle du bain CTS.Pour introduire un bloc de transfert dans la navette, déverrouillez la poignée de la navette en tournant de 90 degrés dans le sens des aiguilles d’une montre et avancez-la vers le bain afin que la piste guidée sur la poignée impose le bon chemin de déplacement. Une fois le couvercle du bloc refroidi, avancez la poignée pour introduire le bloc dans la navette. Pour verrouiller le bloc de transfert sur la navette, faites pivoter la poignée de 180 degrés dans le sens des aiguilles d’une montre.Rétractez la poignée à la position arrière d’origine et verrouillez-la en place en tournant de 90 degrés dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Appuyez sur Close Shuttle Valve Pump sur l’écran d’affichage pour lancer l’évacuation de la navette. Une fois que les messages Shuttle prêt à bouger et Ne pas bouger la tige, valve fermée sont affichés sur l’écran tactile, appuyez sur le levier sous la navette et soulevez-le soigneusement à l’aide de la poignée en haut.Portez la navette jusqu’au sas de la station d’extrémité de l’aspirateur en position verticale et fixez-la. Sélectionnez une position de bloc vide dans le récipient en appuyant sur le bouton correspondant sur l’écran tactile et en déplaçant l’hôtel d’échantillon à la position de chargement correcte. Une fois qu’un exemple d’hôtel est en position, appuyez sur le bouton Ouvrir pour lancer la séquence de verrouillage du vide.Une fois la séquence terminée et le sas devient sas ouvert, bloquez la navette, tournez la poignée de 90 degrés dans le sens des aiguilles d’une montre pour déverrouiller la tige. Poussez doucement la tige dans le récipient afin que la piste guidée impose le bon chemin de déplacement vers l’hôtel échantillon. Insérez lentement le bloc de transfert dans l’hôtel à l’aide du flux vidéo affiché à l’écran pour vous guider, en vous assurant que l’icône de position du bloc sur l’écran tactile est activée.Une fois activée, faites pivoter la poignée de 180 degrés dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour libérer le bloc de transfert et tirer la tige hors du récipient. Une fois complètement rétracté, faites pivoter la poignée de 90 degrés dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour verrouiller la tige. Appuyez sur le bouton Fermer pour fermer la soupape de vide de la station d’extrémité et évacuer l’espace entre la navette et le récipient à la pression atmosphérique.Retirez la navette lorsque l’affichage du sas affiche l’état OK à détacher. Retournez la navette au bain CTS et appuyez sur Open Shuttle Valve pour évacuer la navette avant de charger le bloc d’échantillon suivant. Une fois que le feu de circulation est vert et que le message OK pour déplacer la tige apparaît, le prochain bloc de transfert peut être introduit dans la navette.Pour préparer le prochain bloc de transfert, faites pivoter la rondelle de bloc à l’intérieur du bain. Poussez la clé de rotation intégrée sur le dessus du couvercle en acrylique vers le bas dans la serrure au centre de la rondelle de bloc. Tout en le maintenant enfoncé, tournez la clé pour positionner le bloc de transfert souhaité en position de ramassage.Une fois que tous les blocs ont été transférés, assurez-vous que la vanne de navette est ouverte, appuyez sur le bouton Bake sur l’écran tactile, sélectionnez Bath et Shuttle, puis appuyez sur Start Bake. La ligne de faisceau de cristallographie macromoléculaire de longue longueur d’onde I23 à Diamond Light Source peut accéder aux bords d’absorption d’éléments de haute importance biologique, tels que le calcium, le potassium, le chlore, le soufre et le phosphore, donnant un signal anormal amélioré qui peut être utilisé pour phaser ou localiser ces éléments dans des macromolécules. Les données de diffraction ont été recueillies à partir d’un seul cristal de thaumatine à une longueur d’onde de 2,75 angström, choisi comme compromis entre l’augmentation du signal anormal et les effets d’absorption de l’échantillon à des longueurs d’onde plus longues.La configuration du vide garantit que seuls les rayons X diffusés par l’échantillon atteignent le détecteur, fournissant un faible arrière-plan autour des réflexions de Bragg. L’ensemble de données a produit un signal anormal très fort, facilitant la solution de structure par le pipeline de phasage automatique CRANK2. La haute qualité de la carte de densité d’électrons résultante a permis la construction de modèles automatiques réussis, avec un placement correct pour 100% de la séquence d’acides aminés de la thaumatine.Les 16 résidus de cystéine dans la thaumatine forment huit ponts disulfures, qui sont tous clairement visibles sur la carte de densité d’électrons. Étant donné que la cristallographie des protéines à longue longueur d’onde sous vide est un nouveau domaine, nous avons développé de nouveaux outils et équipements de manipulation d’échantillons. Ce protocole guide les utilisateurs dans le transfert en toute sécurité des échantillons dans la station d’extrémité de vide sur la ligne de faisceau I23 à Diamond Light Source.L’environnement du vide ouvre des opportunités uniques pour effectuer des expériences de diffraction dans une gamme de longueurs d’onde non accessible à d’autres lignes de faisceau. La cristallographie aux rayons X à longue longueur d’onde permet le phasage expérimental de macromolécules directement à partir de cristaux natifs. Il permet également d’identifier sans ambiguïté les ions liés aux molécules.

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Réalisation d’un criblage efficace des fragments dans l’installation de XChem à Diamond Light Source

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Cristallisation et collecte in situ de données à température ambiante à l’aide de l’installation de cristallisation de Harwell et de la ligne de faisceau VMXi, source de lumière au diamant

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Protocole de préparation et de transfert d’échantillons pour la cristallographie à longue longueur d’onde sous vide sur la ligne de faisceau I23 à la source lumineuse Diamond (Vidéo) | JoVE Journal

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