Protocole de préparation et de transfert d’échantillons pour la cristallographie à longue longueur d’onde sous vide sur la ligne de faisceau I23 à la source lumineuse Diamond

La cristallographie macromoléculaire à longue longueur d’onde exploite le signal anormal des atomes de lumière présents nativement dans les protéines et les acides nucléiques. Cette technique est utilisée pour résoudre expérimentalement le problème du visage cristallographique et pour déterminer l’identité et l’emplacement de ces éléments. Beamline I23 à Diamond Light Source est un instrument synchrotron unique optimisé pour les expériences à de longues longueurs d’onde jusqu’à cinq angstrom.

Il permet d’accéder aux bords d’absorption d’éléments de haute pertinence biologique, tels que le calcium, le potassium, le chlore, le soufre et le phosphore. En raison de l’absorption importante des rayons X par l’air dans le régime des longues longueurs d’onde, ces expériences sont réalisées dans un environnement sous vide. Pour maintenir les échantillons à des températures cryogéniques à l’intérieur de l’environnement sous vide, les cristaux sont montés sur des porte-échantillons dédiés et thermoconducteurs.

Le transfert d’échantillon cryogénique de l’azote liquide à la station d’extrémité du vide est très similaire aux techniques utilisées en cryo-microscopie électronique. Ce protocole présente la procédure de transfert des cristaux dans l’environnement sous vide à l’aide des outils et équipements développés chez Diamond Light Source. Commencez par séparer le couvercle de la base du CombiPuck de manière à ce que les porte-échantillons restent attachés à la base et que les flacons soient retenus dans le couvercle.

Immergez le couvercle avec des flacons dans de l’azote liquide, puis fixez un porte-échantillon et un adaptateur à une baguette magnétique et récoltez les cristaux. Refroidir chaque échantillon directement dans le CombiPuck, en notant la position de l’échantillon. Pour fermer la rondelle, utilisez une baguette de rondelle pour attacher la base au couvercle.

Transférez le CombiPuck de l’azote liquide à l’expéditeur sec ou au stockage. Placez la base de la rondelle de bloc déjà remplie de blocs de transfert vides sur sa base de support dans un récipient en mousse, puis remplissez-la d’azote liquide. Ensuite, placez le CombiPuck dans le récipient en mousse rempli d’azote liquide, en vous assurant que la base de la rondelle est fixée au support magnétique à l’intérieur du récipient en mousse.

Pré-refroidir tous les outils nécessaires dans de l’azote liquide. Ensuite, séparez le couvercle de la base à l’aide de l’outil séparateur de rondelle sur le réglage haut, de sorte que la base reste attachée au support magnétique, exposant les porte-échantillons à l’intérieur de l’azote liquide. Placez la baguette du séparateur sur le porte-échantillon et l’adaptateur aussi loin que possible, en vous assurant que la baguette est verticale.

Déplacez le petit levier de la baguette du séparateur vers le bas avec votre pouce jusqu’à ce qu’il clique pour fixer le porte-échantillon à l’intérieur et tirez le porte-échantillon de l’adaptateur. Abaissez le séparateur sur la position souhaitée du bloc de transfert, en vous assurant que l’une des trois broches s’insère à l’intérieur du trou central du bloc de transfert. Relâchez le porte-échantillon en remontant le levier.

Pour charger des échantillons dans le bloc de transfert suivant, utilisez l’outil de clé de carrousel pour faire pivoter un bloc de transfert vide en position horizontale. Une fois que tous les porte-échantillons sont transférés, fermez la rondelle de bloc en plaçant le couvercle dans de l’azote liquide. Attendez que la température s’équilibre, puis placez le couvercle sur la base et soulevez doucement pour vous libérer du carrousel.

Attachez la navette à la gare. Ouvrez les vannes d’azote gazeux et d’air et assurez-vous que les gaz circulent. Ensuite, allumez le CTS.

Refroidissez le bain et la navette avec de l’azote liquide. Placez l’entonnoir fourni dans l’orifice de remplissage de la navette et versez lentement de l’azote liquide dans l’entonnoir tout en surveillant le niveau sur l’écran. Arrêtez-vous lorsque l’indicateur passe du rouge au bleu.

Remplissez le bain d’azote liquide à l’aide de l’entonnoir. Transférez une rondelle de bloc d’azote liquide vers le bain CTS à l’aide de l’outil séparateur de rondelle attaché. Retirez le couvercle de la rondelle de bloc et fermez le couvercle du bain CTS.

Pour introduire un bloc de transfert dans la navette, déverrouillez la poignée de la navette en tournant de 90 degrés dans le sens des aiguilles d’une montre et avancez-la vers le bain afin que la piste guidée sur la poignée impose le bon chemin de déplacement. Une fois le couvercle du bloc refroidi, avancez la poignée pour introduire le bloc dans la navette. Pour verrouiller le bloc de transfert sur la navette, faites pivoter la poignée de 180 degrés dans le sens des aiguilles d’une montre.

Rétractez la poignée à la position arrière d’origine et verrouillez-la en place en tournant de 90 degrés dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Appuyez sur Close Shuttle Valve Pump sur l’écran d’affichage pour lancer l’évacuation de la navette. Une fois que les messages Shuttle prêt à bouger et Ne pas bouger la tige, valve fermée sont affichés sur l’écran tactile, appuyez sur le levier sous la navette et soulevez-le soigneusement à l’aide de la poignée en haut.

Portez la navette jusqu’au sas de la station d’extrémité de l’aspirateur en position verticale et fixez-la. Sélectionnez une position de bloc vide dans le récipient en appuyant sur le bouton correspondant sur l’écran tactile et en déplaçant l’hôtel d’échantillon à la position de chargement correcte. Une fois qu’un exemple d’hôtel est en position, appuyez sur le bouton Ouvrir pour lancer la séquence de verrouillage du vide.

Une fois la séquence terminée et le sas devient sas ouvert, bloquez la navette, tournez la poignée de 90 degrés dans le sens des aiguilles d’une montre pour déverrouiller la tige. Poussez doucement la tige dans le récipient afin que la piste guidée impose le bon chemin de déplacement vers l’hôtel échantillon. Insérez lentement le bloc de transfert dans l’hôtel à l’aide du flux vidéo affiché à l’écran pour vous guider, en vous assurant que l’icône de position du bloc sur l’écran tactile est activée.

Une fois activée, faites pivoter la poignée de 180 degrés dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour libérer le bloc de transfert et tirer la tige hors du récipient. Une fois complètement rétracté, faites pivoter la poignée de 90 degrés dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour verrouiller la tige. Appuyez sur le bouton Fermer pour fermer la soupape de vide de la station d’extrémité et évacuer l’espace entre la navette et le récipient à la pression atmosphérique.

Retirez la navette lorsque l’affichage du sas affiche l’état OK à détacher. Retournez la navette au bain CTS et appuyez sur Open Shuttle Valve pour évacuer la navette avant de charger le bloc d’échantillon suivant. Une fois que le feu de circulation est vert et que le message OK pour déplacer la tige apparaît, le prochain bloc de transfert peut être introduit dans la navette.

Pour préparer le prochain bloc de transfert, faites pivoter la rondelle de bloc à l’intérieur du bain. Poussez la clé de rotation intégrée sur le dessus du couvercle en acrylique vers le bas dans la serrure au centre de la rondelle de bloc. Tout en le maintenant enfoncé, tournez la clé pour positionner le bloc de transfert souhaité en position de ramassage.

Une fois que tous les blocs ont été transférés, assurez-vous que la vanne de navette est ouverte, appuyez sur le bouton Bake sur l’écran tactile, sélectionnez Bath et Shuttle, puis appuyez sur Start Bake. La ligne de faisceau de cristallographie macromoléculaire de longue longueur d’onde I23 à Diamond Light Source peut accéder aux bords d’absorption d’éléments de haute importance biologique, tels que le calcium, le potassium, le chlore, le soufre et le phosphore, donnant un signal anormal amélioré qui peut être utilisé pour phaser ou localiser ces éléments dans des macromolécules. Les données de diffraction ont été recueillies à partir d’un seul cristal de thaumatine à une longueur d’onde de 2,75 angström, choisi comme compromis entre l’augmentation du signal anormal et les effets d’absorption de l’échantillon à des longueurs d’onde plus longues.

La configuration du vide garantit que seuls les rayons X diffusés par l’échantillon atteignent le détecteur, fournissant un faible arrière-plan autour des réflexions de Bragg. L’ensemble de données a produit un signal anormal très fort, facilitant la solution de structure par le pipeline de phasage automatique CRANK2. La haute qualité de la carte de densité d’électrons résultante a permis la construction de modèles automatiques réussis, avec un placement correct pour 100% de la séquence d’acides aminés de la thaumatine.

Les 16 résidus de cystéine dans la thaumatine forment huit ponts disulfures, qui sont tous clairement visibles sur la carte de densité d’électrons. Étant donné que la cristallographie des protéines à longue longueur d’onde sous vide est un nouveau domaine, nous avons développé de nouveaux outils et équipements de manipulation d’échantillons. Ce protocole guide les utilisateurs dans le transfert en toute sécurité des échantillons dans la station d’extrémité de vide sur la ligne de faisceau I23 à Diamond Light Source.

L’environnement du vide ouvre des opportunités uniques pour effectuer des expériences de diffraction dans une gamme de longueurs d’onde non accessible à d’autres lignes de faisceau. La cristallographie aux rayons X à longue longueur d’onde permet le phasage expérimental de macromolécules directement à partir de cristaux natifs. Il permet également d’identifier sans ambiguïté les ions liés aux molécules.