Analyse de la composition lipidique des mycobactéries par chromatographie sur couche mince

Mycobactéries Les lipides sont une caractéristique importante du genre et sont essentiels dans les interactions des mycobactéries hôtes. La rapidité et la polyvalence sont les principaux avantages de cette procédure. Cette méthode peut être utilisée pour comprendre le rôle des lipides et la pathogénicité des mycobactéries et leur effet immunostimulant.

Pour l’extraction des lipides liés non covalents, ajouter 15 millilitres d’un à deux chloroforme à une solution de méthanol dans un tube de verre avec un bouchon à vis en PTFE sous une hotte à flux laminaire. Ensuite, grattez 200 milligrammes de mycobactéries d’un milieu solide et ajoutez les mycobactéries au tube de verre. Incuber le tube pendant la nuit en remuant constamment.

Le lendemain, filtrez les solvants organiques à travers un entonnoir en verre tapissé de papier filtre dans un tube en verre. Après avoir utilisé le flux d’azote gazeux, pour évaporer la phase liquide dans le tube, remplissez le tube d’azote gazeux, pour stocker le tube à quatre degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 15 millilitres d’un chloroforme de deux à un à une solution de méthanol aux débris cellulaires et incubez le tube pendant la nuit avec une agitation constante.

Le lendemain matin, laissez reposer le mélange pendant une heure, avant d’utiliser une pipette Pasteur pour transférer les solvants organiques dans un entonnoir en verre doublé de papier filtre dans le même tube de collecte en verre. Ensuite, évaporez la phase liquide comme démontré, avant de remplir le tube d’azote gazeux pour un stockage de quatre degrés Celsius. Pour l’extraction à l’acide mycolique, ajouter deux à cinq millilitres d’une solution agitante et 200 milligrammes de biomasse de mycobactéries dans un tube en verre hermétique avec un bouchon à vis de doublure en PTFE, et mélanger le contenu par vortex.

Incuber le mélange dans un bain sec à 80 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, lorsque le tube a refroidi la température ambiante, ajoutez deux millilitres d’hexane N et mélangez le contenu pendant 30 secondes par vortex. Laissez le tube se déposer jusqu’à ce que deux phases claires apparaissent et transférez la phase supérieure de N hexane dans un nouveau tube.

Mélanger deux millilitres supplémentaires de N hexane avec le contenu du tube et recueillir à nouveau la couche supérieure. Ensuite, évaporez le contenu du tube par écoulement d’azote et stockez l’échantillon recouvert d’azote à quatre degrés Celsius comme démontré. Pour analyser les échantillons par TLC, recouvrez une paroi de la chambre TLC d’un morceau de papier filtre, ajoutez de la vaseline sur les coins de la chambre pour sceller la chambre, pour mettre le mélange de solvant sur le papier filtre et ajoutez le volume restant du solvant au fond de la chambre TLC.

Fermez la chambre TLC pendant au moins 20 minutes pour la rendre saturée. Pendant ce temps, dissoudre les lipides dans le tube de verre dans 200 à 1000 microlitres de chloroforme et utiliser un tube de verre capillaire pour appliquer 10 microlitres de la suspension de chloroforme lipidique directement sur la plaque TLC. Après avoir permis à l’échantillon de sécher pendant cinq minutes, insérez la plaque dans la chambre TLC saturée et laissez la phase mobile traverser le TLC.

Lorsque le solvant atteint un centimètre de l’extrémité supérieure de la plaque, placez la plaque sous un flux laminaire jusqu’à ce que la silice soit complètement sèche. Ensuite, vaporisez la plaque séchée avec 15 à 20 millilitres d’hydrate phosphorique à 10% de données molaires dans de l’éthanol jusqu’à ce que la plaque soit jaune vif, et chauffez la plaque pendant deux à cinq minutes à 120 degrés Celsius. Dans cette analyse représentative, l’acide mycolique extrait de diverses espèces de mycobactéries a été analysé par TLC unidimensionnel en utilisant deux systèmes d’élution différents et un TLC bidimensionnel.

Deux types de procédures de méthylation ont également été effectués pour confirmer la présence d’acide mycolique de type cinq. Dans les deux systèmes d’élution, les acides mycoliques étaient situés approximativement au milieu de la plaque, bien que la tache correspondant à l’acide mycolique de type cinq n’ait été observée qu’après saponification. Le TLC bidimensionnel permet également d’identifier des types individuels d’acide mycolique.

Par exemple, mycobacterium brumae n’exprime que les acides mycoliques de type un, mycobacterium bovis BCG exprime les types un et quatre, mycobacterium fortuitum exprime les types un et cinq, et mycobacterium abcessus exprime les profils d’acides mycoliques de type un et deux. Les extraits lipidiques totaux de diverses espèces de mycobactéries ont été analysés en fonction de leur polarité et de leur taille. Il révèle que la plupart des lipides polaires A, tels que les PDIM, sont présents dans mycobacterium bovis BCG, mais pas dans mycobacterium fortuitum, mycobacterium brumae et le morphotype lisse de M abcessus.

Les glycolipides phénoliques ne sont présents que dans mycobacterium bovis BCG, tandis que les glycopeptidolipides ne sont observés que dans des échantillons de mycobacterium abcessus. Semblable aux acides mycoliques, les acylglycérols et les PDIM, les MIP, peuvent également être facilement visualisés grâce à une analyse TLC unidimensionnelle ou TLC 2D. Deux types de taches ont été utilisés pour révéler les MIP dans un TLC unidimensionnel.

La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de ce protocole est de ne pas utiliser d’instruments en plastique tout au long de la procédure.