Name: Génération de xénogreffes larvaires de poisson zèbre et analyse du comportement tumoral (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Découvrez la génération de xénogreffes larvaires de poisson zèbre pour l'analyse comportementale des tumeurs humaines. Ce protocole standardisé permet l'étude in vivo de la prolifération, de l'angiogenèse et des réponses thérapeutiques.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions la Fondation Champalimaud, Congento (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, cofinancée par FCT/Lisboa2020) pour son financement. Bourses FCT pour VP (SFRH/BD/118252/2016), MML (PD/BD/138203/2018). Tous les membres du Fior Lab pour des discussions critiques; B. Costa et C. Rebelo de Almeida pour le partage de données ; et les membres de notre laboratoire C. Rebelo de Almeida, M. Barroso et L. Leite pour leur participation à la vidéo. Nous tenons à remercier l’installation de pêche des FC (C. Certal, J. Monteiro et al) et l’équipe de communication, d’événements et de sensibilisation de Champalimaud, en particulier Alexandre Azinheira pour la réalisation de films fantastiques et Catarina Ramos et Teresa Fernandes pour leur aide.

<ol><li>Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Little+Fish%2C+Big+Data%3A+Zebrafish+as+a+Model+for+Cardiovascular+and+Metabolic+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease.</a> Physiological Reviews. 97, 889-938 (2017).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).</li>
<li>Stoletov, K., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+of+the+day%3A+zebrafish+as+a+human+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Catch of the day: zebrafish as a human cancer model.</a> Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).</li>
<li>Weintraub, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+eyes+on+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animals%22%5BJournal%5D)">All eyes on zebrafish.</a> Lab Animals. 46, 323-326 (2017).</li>
<li>Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: Model for the Study of Inflammation and the Innate Immune Response to Infectious Diseases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNovoa%2C+B+%22Current+Topics+in+Innate+Immunity+II%22">Current Topics in Innate Immunity II</a>. Lambris, J. D., Hajishengallis, G. , Springer. 253-275 (2012).</li>
<li>Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+patient+avatars+in+cancer+biology+and+precision+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 20, 263-273 (2020).</li>
<li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8234-8243 (2017).</li>
<li>Póvoa, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+evasion+revealed+in+a+colorectal+zebrafish+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Innate immune evasion revealed in a colorectal zebrafish xenograft model.</a> Nature Communications. 12, 1156(2021).</li>
<li>Galletti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Macrophages+Sensitizes+Chronic+Lymphocytic+Leukemia+to+Apoptosis+and+Inhibits+Disease+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Targeting Macrophages Sensitizes Chronic Lymphocytic Leukemia to Apoptosis and Inhibits Disease Progression.</a> Cell Reports. 14, 1748-1760 (2016).</li>
<li>Rebelo de Almeida, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+xenografts+as+a+fast+screening+platform+for+bevacizumab+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish xenografts as a fast screening platform for bevacizumab cancer therapy.</a> Communications Biology. 3, 1-13 (2020).</li>
<li>Varanda, A. B., Martins-Logrado, A., Godinho Ferreira, M., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Xenografts+Unveil+Sensitivity+to+Olaparib+beyond+BRCA+Status%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Xenografts Unveil Sensitivity to Olaparib beyond BRCA Status.</a> Cancers. 12, 1769(2020).</li>
<li>Osmani, N., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+Imaging+of+Metastasis+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multiscale Imaging of Metastasis in Zebrafish.</a> Trends in Cancer. 5, 766-778 (2019).</li>
<li>Hyenne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+Fate+of+Tumor+Extracellular+Vesicles+at+High+Spatiotemporal+Resolution+Using+the+Zebrafish+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Studying the Fate of Tumor Extracellular Vesicles at High Spatiotemporal Resolution Using the Zebrafish Embryo.</a> Developmental Cell. 48, 554-572 (2019).</li>
<li>Costa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+zebrafish+avatars+as+radiotherapy+sensitivity+reporters+-+towards+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Developments in zebrafish avatars as radiotherapy sensitivity reporters - towards personalized medicine.</a> EBioMedicine. 51, 102578(2020).</li>
<li>Costa, B., Estrada, M. F., Mendes, R. V., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Avatars+towards+Personalized+Medicine-A+Comparative+Review+between+Avatar+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Avatars towards Personalized Medicine-A Comparative Review between Avatar Models.</a> Cells. 9, 293(2020).</li>
<li>TRICAINE - Protocols. ZFIN Community Wiki. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE">https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE</a> (2021).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Xenograft+Model+in+Zebrafish+for+High-Resolution+Investigating+Dynamics+of+Neovascularization+in+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A Novel Xenograft Model in Zebrafish for High-Resolution Investigating Dynamics of Neovascularization in Tumors.</a> Plos One. , (2011).</li>
<li>Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooking+the+big+one%3A+the+potential+of+zebrafish+xenotransplantation+to+reform+cancer+drug+screening+in+the+genomic+era%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era.</a> Disease Models & Mechanisms. 7, 745-754 (2014).</li>
<li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate%2C+migrate%2C+produce+melanin%2C+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9, 139-151 (2006).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+New+Age+of+Chemical+Screening+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">The New Age of Chemical Screening in Zebrafish.</a> Zebrafish. 7, 1(2010).</li>
<li>Mycoplasma Contamination of Cell Cultures. InvivoGen. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.invivogen.com/review-mycoplasma">https://www.invivogen.com/review-mycoplasma</a> (2016).</li>
<li>van Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+steps+of+metastasis%3A+cell+invasion+and+endothelial+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration.</a> Mutation Research. 728, 23-34 (2011).</li>
</ol>

L’importance croissante du poisson zèbre comme modèle pour le développement du cancer et le dépistage des médicaments a donné lieu à de nombreuses publications3,4,7,13,14,16,18,19,20,21. Cependant, l’injection de cellules cancéreuses dans des embryons de poissons zèbres est une technique qui nécessite un niveau élevé de dextérité qui peut être difficile pour les chercheurs. Dans ce protocole, nous visons à fournir des informations pratiques et quelques conseils qui peuvent aider à surmonter les défis initiaux de la mise en place de xénogreffes embryonnaires de poisson zèbre.
Manipulation cellulaire de l’injection antérieure Ce protocole optimisé pour la génération de xénogreffes de poisson zèbre avec des lignées cellulaires peut être adapté à différents types de cellules (cancéreuses) avec différentes morphologies. Nous recommandons que toutes les lignées cellulaires utilisées pour les xénogreffes de poisson zèbre soient exemptes de mycoplasmes. Contrairement à d’autres contaminations bactériennes, la présence de mycoplasmes dans la culture cellulaire ne génère pas de changements qui peuvent être facilement détectés au microscope22. La contamination par mycoplasme peut affecter le potentiel de greffe des lignées cellulaires, leur sensibilité aux médicaments, ainsi que la viabilité des embryons de poisson zèbre.
Bien que les cellules puissent continuer à proliférer pendant une période prolongée, leur phénotype et leur génotype peuvent être sujets aux changements. Il est important de se familiariser avec la morphologie et le comportement des lignées cellulaires en culture. Nous vous recommandons de garder le nombre de passages cellulaires après décongélation entre 3 et 12 pour obtenir des résultats reproductibles. Ainsi, des tests réguliers de mycoplasme devraient être effectués.
Les cellules doivent être à leur phase logarithmique (phase de croissance exponentielle avant d’atteindre la confluence ~ 70%) le jour de l’injection. Ceci permettra à greffe proportionnée et au développement approprié des poinçons distinctifs de la tumeur. Pour prévenir la variation du phénotype des cellules dans la xénogreffe, il est essentiel de maintenir la confluence pour l’injection constante entre les expériences. Le nombre de cellules injectées peut être adapté aux caractéristiques de chaque lignée cellulaire, car certaines peuvent nécessiter des densités d’injection plus élevées pour prospérer dans les embryons de poisson zèbre.
Considérations relatives à l’étiquetage des cellules Pour mieux visualiser les cellules tumorales humaines pour l’injection et l’analyse future, les cellules tumorales peuvent être marquées avec des colorants fluorescents. En raison des différences dans la taille cellulaire, le nombre total de cellules/cm2 dans les cultures adhérentes varie selon les lignées cellulaires. Cela aura un impact sur l’efficacité du protocole de coloration ainsi que sur le nombre de cellules récoltées pour injection. Les grandes cellules qui produisent de faibles nombres par fiole (c.-à-d. Hs578T) ou qui poussent en grappes (c.-à-d. BFTC905) nécessiteront la mise en commun de plusieurs fioles pour une seule expérience. Dans ce cas, la coloration des cellules ne doit pas être effectuée directement dans le ballon car cela entraînera l’utilisation de quantités excessives de colorant (coût élevé). D’autre part, les cellules qui sont très sensibles aux cycles excessifs de centrifugation ainsi que celles qui donnent un nombre élevé par fiole (c’est-à-dire HCT116) peuvent être colorées directement dans le ballon, puis détachées avec de l’EDTA/racleur de cellules (pour plus d’informations, voir le tableau 1).
Dans la mesure du possible, au lieu d’utiliser une approche enzymatique, utilisez l’EDTA pour détacher les cellules le jour de l’injection, afin que les cellules récupèrent leurs jonctions cellule-cellule plus rapidement et soient soumises à moins d’étapes de centrifugation. Néanmoins, si les cellules sont sensibles à l’EDTA, très adhérentes ou se développent en grappes, une méthode enzymatique peut être appliquée. L’optimisation de la concentration idéale pour l’injection ainsi que du milieu d’injection dépend des caractéristiques de chaque lignée cellulaire, il pourrait donc nécessiter quelques ajustements(tableau 1).
Étalonnage des micro-injections Contrairement à l’administration d’oligonucléotides ou de médicaments dans l’embryon de poisson zèbre, un graticule n’est pas utilisé pour calibrer l’aiguille lors du travail avec des lignées cellulaires pour les xénogreffes. Après un certain temps pendant l’injection, les cellules commenceront à se boucher et il est nécessaire de couper la pointe de l’aiguille pour augmenter son diamètre ou changer complètement l’aiguille. Cette procédure entrave l’étalonnage du graticule.
Pour résoudre ce problème, le nombre de cellules distribuées est régulé par la pression d’éjection et le temps nécessaire pour atteindre une taille similaire à l’œil embryonnaire en 1-3 impulsions. Ensuite, pour contrôler davantage la taille de la tumeur, à 1 dpi, les xénogreffes sont triées en fonction de la taille de la tumeur comme le montre la figure 6 B-B ». Comme représenté dans l’exemple de la figure 6C, cette méthode de tri est efficace pour réduire la variation des tailles de tumeurs : si nous les mettons toutes ensemble (+, ++, +++), le STEV est ~double de la classe ++ (~906 cellules à ~422 cellules) et la variation du coefficient est ~31,9% contre 14,5% dans la classe ++. Étant donné que la référence pour l’injection est le volume, le nombre total de cellules varie beaucoup entre les types de cellules - dépendant de la taille et de la forme des cellules. Par exemple, les grandes cellules avec beaucoup de cytoplasme comme le cancer du sein Hs578T, produisent des tumeurs beaucoup plus petites (~ 600 cellules). En outre, chaque lignée cellulaire nécessite un nombre différent de cellules. Par exemple, les lignées cellulaires du cancer de la vessie HT29 CRC et RT112 ont montré que plus le nombre de cellules injectées est élevé, plus la mortalité du poisson zèbre est élevée. Par conséquent, une période d’optimisation lors du développement des xénogreffes est nécessaire pour tester si la lignée cellulaire a des effets toxiques dans l’embryon ou nécessite des densités d’injection plus élevées / plus faibles.
Site d’injection L’une des anomalies les plus courantes lors de la génération de xénogreffes embryonnaires de poisson zèbre est le site d’injection. Le jaune est généralement le lieu de choix pour l’injection en raison de son accessibilité facile. Cependant, nous avons observé que les cellules injectées dans le jaune ont une plus grande tendance à mourir. Bien que techniquement plus difficile, nous recommandons d’injecter dans le PVS et aussi loin que possible du cœur. Au sein du PVS, les cellules peuvent s’agréger, recruter des vaisseaux et des cellules immunitaires, et migrer, invaser, extravaser et former une microméthastasie, si elles présentent des caractéristiques métastatiques8,11.
Efficacité de la greffe Des différences dans l’efficacité de greffe et la taille de tumeur parmi des variétés de cellule à 4 dpi sont prévues en raison de leurs degrés distincts de mort/survie/prolifération de cellules basiques mais aussi en raison de l’immunogénicité innée que chaque variété de cellule peut afficher9.
métastase La métastase comprend une cascade en plusieurs étapes d’événements qui peuvent être divisés en deux étapes arbitraires. Dans la première étape, les cellules tumorales doivent se détacher du site primaire, migrer et envahir les tissus adjacents, puis s’infiltrer dans la circulation sanguine. Dans un deuxième temps, les cellules tumorales doivent survivre en circulation, s’extravaser du sang ou des vaisseaux lymphatiques, et enfin coloniser sur des sites secondaires23. Pour distinguer ces événements tôt et tard et adresser le potentiel/la compétence des différentes cellules de tumeur pour exécuter ces étapes, nous avons conçu un essai simple.
En général, lorsqu’elles sont injectées dans le SPV, les cellules tumorales peuvent entrer directement en circulation, puis être piégées physiquement dans le tissu hématopoïétique caudal (CHT) (région de la queue). Cependant, selon les caractéristiques de chaque cellule tumorale - nous avons vu que certaines cellules tumorales restent au CHT 4 dpi et sont capables de former une microméthastasie tandis que d’autres cellules tumorales disparaissent (effacées après avoir été attrapées dans le CHT).
Par conséquent, en comparant l’efficacité de la microméthastasie (à 4 dpi) lorsque les cellules ont été placées directement dans la circulation - CIRC (les cellules n’ont qu’à passer par les étapes tardives de la métastase) vs. quand non - PAS de CIRC (les cellules doivent passer par des étapes précoces et tardives pour pouvoir former une microméthastasie), nous pouvons évaluer leur potentiel métastatique précoce ou tardif. Nous avons observé des cellules tumorales qui peuvent former efficacement une microméthastasie dans le CHT dans les deux groupes (CIRC et NO CIRC), ce qui suggère que ces cellules ont la capacité de subir toutes les étapes de la cascade métastatique (SW480 et MDA-MB-468 par exemple)8,11. En revanche, d’autres cellules tumorales ont un très faible potentiel métastatique dans les deux groupes, ne faisant presque jamais de microméthastasie, même lorsqu’elles sont injectées dans la circulation (c’est-à-dire visibles dans le CHT à 24 hpi, mais à 4 dpi elles ne sont plus là, Hs578T par exemple)8. Cependant, nous avons clairement trouvé un autre groupe - celui qui n’est capable de former une microméthastasie que lorsqu’il est injecté dans la circulation (nous ne pouvons observer la microméthastasie que dans le groupe CIRC). Ceci suggère que ces cellules ont une faible efficacité en exécutant les premières étapes de la cascade métastatique mais d’autre part sont capables de survivre dans la circulation, extravasate et coloniser un site éloigné.
Immunomarquage et imagerie Avant la fixation, ce protocole d’injection peut être utilisé pour d’autres approches d’imagerie en direct comme la microscopie à contraste différentiel d’interférence différentiel (DIC) en direct, la microscopie à disque tournant, l’imagerie confocale en direct à haute résolution et la microscopie à feuille de lumière, etc.
Les cellules mortes et les débris cellulaires apparaissent brillants lorsqu’ils sont observés à travers le stéréomicroscope fluorescent et peuvent être confondus avec des cellules vivantes, en particulier si le but de l’étude est d’évaluer le potentiel métastatique des lignées cellulaires. Nous voudrions souligner l’importance d’exécuter la formation image confocale avec les marqueurs spécifiques de viabilité et DAPI pour évaluer l’état de survie de la tumeur et du micrometastasis. En outre, il est fondamental d’utiliser des anticorps humains spécifiques pour détecter les cellules humaines telles que les mitochondries anti-humaines ou le HLA anti-humain. Lors de la mise en œuvre du protocole, entraînez les yeux des expérimentateurs en comparant la coloration dans le stéréomicroscope avec les images confocales. Après un certain temps, les expérimentateurs peuvent clairement distinguer les débris des cellules vivantes dans le stéréomicroscope fluorescent.
Bien que d’autres méthodes pour quantifier le fardeau de tumeur tel que le secteur entier de fluorescence soient employées couramment, nous recommandons d’exécuter l’immunomarquage entier de montage et la formation image confocale comme méthode plus précise. Non seulement l’efficacité de la coloration des colorants lipophiles est très variable (c’est-à-dire que certaines cellules sont très bien colorées tandis que d’autres ne sont pas probablement dues à la teneur en lipides de leurs membranes), mais aussi plusieurs fois les colorants lipophiles forment des agrégats, et les cellules mortes ont tendance à être plus brillantes - créant plusieurs artefacts qui peuvent être confondus avec des cellules vivantes.
Les cellules peuvent être transduites avec des protéines fluorescentes pour faciliter leur suivi et pour éviter l’étiquetage des cellules. Cependant, assurez-vous que les cellules transduites et non transduites produisent les mêmes résultats dans les xénogreffes de poisson zèbre.
En outre, les macrophages peuvent phagocyter ces débris de cellules fluorescentes devenant fluorescentement marqués et migrer, générant des cellules métastatiques faussement positives. Ainsi, nous recommandons une série d’outils analytiques, qui bien sûr peuvent être étendus à de nombreuses autres lectures pour une interprétation plus précise du comportement tumoral:
<ul style="list-style-type: square;"><li>
Prolifération - quantification des figures mitotiques avec DAPI ou anticorps anti-pHH3Ser10 (Merck Millipore Cat. #06-570),</li>
	<li>
Mort cellulaire par apoptose- anticorps anti-activé Caspase3Asp175 (Cell Signalling Technologies Cat. #9661) ou équivalent,</li>
	<li>
Taille de la tumeur - comptage DAPI - les cellules tumorales humaines montrent une organisation de la chromatine très distincte, de sorte qu’elles se distinguent facilement des cellules du poisson zèbre et qu’il est toujours possible de vérifier avec le colorant (lorsque vous entraînez votre œil),</li>
	<li>
Pour les études métastatiques, pour détecter sans ambiguïté les cellules humaines, - HLA anti-humain (Abcam EP1395Y Cat. #ab52922), mitochondries anti-humaines (Merck Millipore Cat. #MAB1273- Clone 113-1).</li>
</ul>Pour une acquisition confocale avec un intervalle de 5 μm entre les tranches de la pile Z des cellules cancéreuses témoins HCT116 (taille nucléaire moyenne de 10-12 μm de diamètre) avec contre-altération DAPI, nous avons observé qu’environ 50% des cellules sont partagées entre deux tranches consécutives. Par conséquent, si chaque tranche est comptée, il existe un risque élevé de compter les mêmes cellules deux fois. Faire des allers-retours entre les tranches pour éviter les problèmes de quantification entraîne une technique longue et sujette aux erreurs. Pour faciliter la quantification du nombre total de cellules et permettre plus de reproductibilité entre chercheurs, nous avons créé la formule de taille de tumeur précédemment décrite dans ce protocole8.
Nous avons inclus un numéro de correction (1,5) pour tenir compte des cellules ~ 50% partagées entre les tranches. Nous avons constaté que l’erreur moyenne de comptage manuel de la tumeur entière entre les chercheurs était de 20%. Deux chercheurs utilisant la formule ont eu une erreur de 2%. L’utilisation de cette formule a un taux de précision de 93% et un taux de reproductibilité de 98%. Nous avons également testé des méthodes automatisées, mais elles ont démontré une erreur supérieure à 50% causée par les paramètres de seuil.
En raison des caractéristiques des cellules apoptotiques, la quantification des cellules de caspase 3 activées est plus difficile. Pour réduire le nombre d’erreurs et la variation des résultats, nous recommandons que les échantillons témoins et expérimentaux soient comptés par le même chercheur. De plus, lorsqu’il apprend cette technique, un nouveau chercheur doit compter les images qui ont déjà été quantifiées par des chercheurs plus expérimentés pour comparer les résultats et se former.
La durée du test peut être prolongée si nécessaire. Cependant, il est important de considérer que les larves de poissons zèbres ont besoin d’une alimentation vivante à partir d’environ 7 jours après la fécondation (5 jours après l’injection). De plus, les lignes directrices et les règlements sur le bien-être des animaux appliqués aux larves âgées de plus de 6 jours après la fécondation peuvent varier.
Ce protocole fournit des outils utiles pour permettre à un seul chercheur d’injecter environ 200 à 300 larves de poissons zèbres par heure; et les résultats de l’essai complet, y compris l’analyse et l’interprétation statistique, obtenus en trois semaines. Nous espérons que ce protocole pourra aider les chercheurs à devenir des experts dans la génération de xénogreffes de poisson zèbre. Ce n’est pas facile; vous devez pratiquer, mais vous y arriverez. Bonne chance!

Le poisson zèbre (Danio rerio) émerge comme un puissant organisme modèle de vertébrés pour étudier le développement et les maladies. Le poisson zèbre partage des caractéristiques génétiques hautement conservées (~ 70% d’homologie génétique et ~ 84% de gènes liés à la maladie) et morphologiques des organes de base avec les humains1,2. Cette conservation permet l’utilisation du poisson zèbre pour modéliser plusieurs maladies humaines, dont le cancer3,4.
La manipulation et l’entretien du poisson zèbre sont beaucoup plus faciles et plus rentables que les souris en raison de leur petite taille, de leur fécondité élevée toute l’année et de leur fertilisation externe3,5. Les embryons de poissons zèbres ne nécessitent pas d’alimentation vivante pendant leurs 5-7 premiers jours de vie et ont été utilisés comme modèle efficace pour le développement, l’infection et le cancer1,4,6,7. Les embryons de poissons zèbres éclosent 48 heures après la fécondation (hpf) et sont des animaux nageurs libres avec tous les organes formés, un cœur battant et un système circulatoire fonctionnel, le foie, le cerveau, la moelle rénale, etc.1,3. De plus, à ce stade de développement, seule l’immunité innée est en jeu, l’immunité adaptative se développe encore, permettant une greffe générale efficace des cellules humaines sans avoir besoin d’utiliser des mutants immunodéprimés7,8. Néanmoins, il est important de noter que toutes les cellules humaines ne se greffent pas également9 et que, par exemple, pour les cellules leucémiques, il a été démontré que les phagocytes (neutrophiles et macrophages) doivent être épuisés pour une greffe efficace10.
La tractabilité génétique du poisson zèbre et la transparence optique de ses premiers stades embryonnaires permettent une imagerie intravitale unicellulaire à haute résolution et, par conséquent, l’établissement de techniques d’imagerie de pointe dans divers domaines de la biologie. En outre, dans le contexte du cancer, ces caractéristiques sont utiles pour des études en temps réel des premiers stades des interactions hôte-tumeur, comme l’étude du potentiel angiogénique et métastatique, ainsi que des interactions avec le système immunitaire inné8,9,11,12,13.
Bien que dans le court test de xénogreffe, il n’y ait pas de temps pour « l’évolution » métastatique- il est possible d’analyser la capacité métastatique des cellules tumorales (c’est-à-dire leur efficacité à passer par des étapes métastatiques comme l’invasion, l’intravasation, la survie en circulation, l’extravasation et la colonisation, et donc d’étudier ces processus in vivo eten temps réel8,11, 13,14).
Les caractéristiques de son cycle de vie placent le poisson zèbre comme un modèle unique de médecine personnalisée dans le cancer. Les essais peuvent être effectués dans un laps de temps plus court et les résultats obtenus en quelques semaines7,8,9,11,12,15,16. La célérité et la faisabilité de ces essais offrent aux médecins et aux chercheurs la possibilité d’obtenir des résultats translationnels qui peuvent être utiles pour les patients atteints de cancer, pour qui le temps est un besoin essentiel.
Malgré les tentatives croissantes de générer des xénogreffes réussies d’embryon de poisson zèbre, il y a toujours un besoin pour la normalisation du procédé d’injection aussi bien que l’évaluation de la viabilité de cellules et du comportement de tumeur après injection.
Dans ce protocole, nous fournissons aux chercheurs un guide étape par étape clair et détaillé pour l’injection de lignées cellulaires cancéreuses humaines dans des embryons de poisson zèbre et la fixation, l’immunomarquage, l’imagerie et la quantification ultérieurs du comportement des cellules tumorales.

<table><tbody><tr><td>Gélose pour bactériologie</td><td>VWR</td><td>97064-336</td><td>Plaque de gélose</td></tr><tr><td>anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal)</td><td>Cell Signalling Technologies</td><td>9661</td><td>Anticorps primaire pour immunocoloration à monture entière (Dilution 1:100)</td></tr><tr><td>HLA anti-humain (Rabbit monoclonal)</td><td>Abcam EP1395Y</td><td>ab52922</td><td>Anticorps primaire pour immunocoloration à monture entière (Dilution 1:100)</td></tr><tr><td>anti- 488 (monoclonal de lapin)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35552</td><td>Anticorps secondaire pour immunocoloration de monture entière (dilution 1:200)</td></tr><tr><td>anti- 594 (monoclonal de lapin)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35560</td><td>Anticorps secondaire pour immunocoloration de monture entière (dilution 1:200)</td></tr><tr><td>CellTracker Colorant rouge foncé</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34565</td><td>Colorant lipophile (dilution 1:1000)</td></tr><tr><td>CellTracker Vert CMFDA</td><td>Colorant ThermoFisher Scientific</td><td>C2925</td><td>Colorant lipophile (dilution 1:1000)</td></tr><tr><td>Conique Tube à centrifuger 50mL</td><td>VWR</td><td>525-0610</td><td></td></tr><tr><td>Conique Tube à centrifuger 15mL</td><td>VWR</td><td>525-0604</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td>Contrecoloration nucléaire et chromosomique</td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette à base laser P-2000</td><td>Sutter-Instrument</td><td></td><td>Micropipette Extracteur</td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation 1.5mL</td><td>Abdos</td><td>P10202</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope, bord coupé</td><td>RS France</td><td>BPB016</td><td>Lames pour montage</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>Milieu de montage</td></tr><tr><td>Pneumatique Picopump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td>Micro-injecteur</td></tr><tr><td>Verres de couverture rectangulaires, Menzel Gl&auml ; ser</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>631-9430</td><td>Couvre-objectifs pour montage</td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td>Plaque de gélose</td></tr><tr><td>Capillaires en verre à paroi mince</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td>Capillaires en borosilicate</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12605036</td><td>Solution de détachement enzymatique</td></tr><tr><td>Vaseline Vaseline</td><td></td><td></td><td>Vaseline Vaseline Teinture d’étanchéité</td></tr><tr><td>Vybrant CM-DiI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22888</td><td>Colorant lipophile (dilution 1:1000)</td></tr><tr><td>Solution de marquage cellulaire Vybrant DiO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22886</td><td>Colorant lipophile (dilution 1:1000)</td></tr><tr><td>ZEISS Axio Zoom.V16 pour la biologie</td><td>ZEISS</td><td></td><td>&nbsp ; Microscope stéréo zoom à fluorescence</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 710</td><td>Microscope confocal</td> <td>ZEISS</td><td></td></tr></tbody></table>

génération de xénogreffes larvaires de poisson zèbre et analyse du comportement tumoral

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Les xénogreffes larvaires de poisson zèbre sont largement utilisées pour la recherche sur le cancer afin d’effectuer des études in vivo et en temps réel sur le cancer humain. La possibilité de visualiser rapidement la réponse aux thérapies anticancéreuses (chimio, radiothérapie, et biologiques), à l’angiogenèse et aux métastases avec la résolution unicellulaire, place le modèle de xénogreffe de poisson zèbre comme un premier choix pour développer des études précliniques.

Le test de xénogreffe larvaire du poisson zèbre présente plusieurs avantages expérimentaux par rapport à d’autres modèles, mais le plus frappant est probablement la réduction de l’échelle de taille et, par conséquent, du temps. Cette réduction d’échelle permet l’imagerie unicellulaire, l’utilisation d’un nombre relativement faible de cellules humaines (compatibles avec les biopsies), les criblages de médicaments à débit moyen-élevé, mais surtout permet une réduction significative du temps de l’essai. Tous ces avantages rendent le test de xénogreffe de poisson zèbre extrêmement attrayant pour de futures applications de médecine personnalisée.

Beaucoup de protocoles de xénogreffe de poisson zèbre ont été développés avec une grande diversité de tumeurs humaines ; cependant, il n’existe toujours pas de protocole général et normalisé pour générer efficacement des xénogreffes larvaires de poisson zèbre. Ici, nous fournissons un protocole étape par étape, avec des conseils pour générer des xénogreffes et des directives pour l’analyse du comportement tumoral, l’immunofluorescence de montage entier et la quantification de l’imagerie confocale.

Ici, nous fournissons un protocole étape par étape, avec des conseils pour générer des xénogreffes et des directives pour l’analyse du comportement tumoral, l’immunofluorescence de montage entier et la quantification de l’imagerie confocale.

Génération de xénogreffes larvaires de poisson zèbre et analyse du comportement tumoral

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Les xénogreffes de poisson zèbre sont largement utilisées pour la recherche sur le cancer. Vous pouvez prendre des cellules tumorales humaines et les injecter dans de petites larves de poissons zèbres, ou même dans des adultes. Ici, ce que nous présentons est un protocole étape par étape du modèle de larve, où nous pouvons étudier plusieurs caractéristiques de cancer humain chez un animal vivant.Vous pouvez étudier la prolifération, vous pouvez étudier l’angiogenèse, vous pouvez étudier les métastases, et aussi les interactions au sein du microenvironnement tumoral. Et un gros avantage est que vous pouvez étudier cela dans un laps de temps très court. Juste quatre jours, par exemple.Un autre grand avantage est que vous pouvez étudier cela en direct avec une résolution unicellulaire, à l’aide d’un microscope confocal ou d’un microscope à feuille de lumière. Vous pouvez étudier comment les cellules migrent, comment les cellules interagissent les unes avec les autres, ou même comment elles se parlent. C’est donc un modèle très puissant pour étudier la biologie du cancer.Les xénogreffes de poisson zèbre peuvent être utilisées pour étudier la réponse aux thérapies anticancéreuses, comme la chimiothérapie, la radiothérapie ou même les thérapies ciblées avec des anticorps. Et enfin, aussi, ce protocole peut également être adapté pour utiliser des cellules dérivées du patient à partir d’un échantillon chirurgical, ou même de biopsies, puis générer les avatars de poissons zèbres. Configuration pour l’injection.Deux semaines avant l’injection, dilatez les cellules en culture. Commencez par l’excès de cellules et l’excès de poissons jusqu’à ce qu’ils deviennent compétents avec la technique, car de nombreuses cellules et poissons seront perdus pendant l’entraînement. Le tableau un des PDF ci-joint contient un guide détaillé des pourcentages optimaux de confluence in vitro pour l’injection de plusieurs lignées cellulaires.Trois jours avant l’injection, croisez le poisson zèbre du fond souhaité. 24 heures avant l’injection. Nettoyez les plaques d’embryons de poisson zèbre.Jetez tous les embryons morts et non développés et rafraîchissez le milieu E3. Dans la salle de culture cellulaire, jetez le milieu de culture cellulaire. Laver une fois avec PBS 1X pour enlever les cellules mortes et ajouter du milieu frais.Préparez les outils pour la procédure d’injection, tels que les aiguilles de microinjection, les plaques d’agarose et les épingles à cheveux pour aligner les embryons pour l’injection. Pour la préparation de la plaque, versez une couche d’agarose dissoute à 2% dans le couvercle d’une boîte de Pétri propre. Laissez-le polymériser et à l’aide d’une règle, faire trois à quatre lignes droites d’agarose pour l’alignement des embryons.Jour d’injection. Séparez les embryons éclos des œufs non éclos. L’ajout de pronase au milieu embryonnaire à ce stade peut stimuler l’éclosion.Placez les embryons dans l’incubateur à 28 degrés Celsius jusqu’à l’injection. Étiquetage cellulaire pour injection. Pour aider à la mise en place d’une technique d’étiquetage cellulaire reproductible, vérifiez les tableaux un et deux du protocole écrit pour une compilation d’une liste de lignées cellulaires et de plusieurs solutions d’étiquetage.Retirer le milieu de culture cellulaire et laver le ballon deux fois avec du PBS 1X. Étiquetez les cellules avec un colorant lipophile, en évitant l’exposition à la lumière, et incuber le ballon à 37 degrés. Vous pouvez également choisir d’étiqueter les cellules dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml lors du détachement.Retirez la solution d’étiquetage cellulaire et lavez les cellules avec du PBS 1X pour éliminer l’excès de colorant. Ajoutez l’agent de détachement correspondant et incuber les cellules à 37 degrés Celsius. Faciliter le processus de détachement en brossant le ballon avec un grattoir à cellules stériles et recueillir les cellules avec une pipette sérologique.Transférer les cellules dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml et centrifuger. Jeter le surnageant et suspendre à nouveau le granulé avec du milieu de culture cellulaire. Quantifier la viabilité cellulaire à l’aide d’une chambre de Neubauer avec exclusion du bleu trypan ou d’une autre méthode de choix.Centrifuger et re-suspendre les cellules dans le milieu d’injection. Les concentrations recommandées de cellules en milieu se trouvent dans le tableau un du manuscrit. À partir de ce moment, les cellules doivent être maintenues sur la glace.Procédures d’injection. Anesthésier les embryons en tricaine 1X pendant 5 minutes. Ensuite, transférez une petite quantité d’embryons anesthésiés sur une plaque d’agarose et alignez-les à l’aide d’une boucle en épingle à cheveux.Assurez-vous de maintenir la distance entre les embryons. Surtout entre le jaune de l’un et la tête du suivant. Pour prévenir la mortalité, assurez-vous que les embryons alignés ne se dessèchent pas dans la plaque d’agarose en ajoutant soigneusement une à trois gouttes de solution de tricaine 1X à la plaque.Appuyez légèrement sur le tube de microcentrifugation pour suspendre à nouveau les cellules. Chargez l’aiguille d’injection avec une suspension cellulaire à l’aide d’une pointe microchargeuse, en évitant les bulles d’air, car elles peuvent compromettre l’intégrité des embryons. Ouvrez la soupape de pression d’air, configurez le microinjecteur et placez soigneusement l’aiguille de microinjection dans le support.Couper l’aiguille de microinjection près de la pointe. Percez soigneusement le jaune de l’embryon, abaissant l’angle de l’aiguille et poussant prudemment jusqu’à ce que le bout de l’aiguille atteigne l’espace périivitellin. Une fois que la pointe est dans l’espace perivitelline, injecter les cellules.Essayez d’injecter un volume de cellules similaire à la taille de l’œil de l’embryon et aussi loin que possible du cœur pour prévenir l’œdème cardiaque. Ajustez la pression du micro-injecteur, si nécessaire. Transférer les embryons injectés dans une boîte de Petri propre avec une solution de tricaine 1X et les laisser reposer pendant cinq à 10 minutes.Cela donnera à la plaie le temps de se refermér. Retirez la solution de tricaine 1X et ajoutez du milieu frais E3. Ensuite, incuber les embryons à 34 degrés Celsius.Cette température permettra la survie à la fois des embryons de poisson zèbre et des cellules tumorales humaines. Essai métastatique. Si vous souhaitez étudier le potentiel métastatique de vos lignées cellulaires, environ une heure après l’injection, examinez les embryons injectés sur un stéréomicroscope à fluorescence et triez-les en deux groupes en fonction de l’absence ou de la présence de cellules cancéreuses en circulation.Un jour après l’injection. Sur un stéréomicroscope à fluorescence, analysez soigneusement chaque embryon et sélectionnez ceux qui ont des tumeurs correctement injectées. Triez les xénogreffes sélectionnées en fonction de la taille de la tumeur.Utilisez la taille de l’œil à des fins de comparaison. Jetez tous les embryons présentant une morphologie anormale, un œdème cardiaque ou jaune, des xénogreffes avec très peu de cellules cancéreuses ou ceux avec des cellules cancéreuses uniquement à l’intérieur du jaune. Distribuez les xénogreffes selon la disposition expérimentale souhaitée et commencez le test du médicament.Remplacez les médicaments et le milieu E3 tous les jours. Incuber les xénogreffes, en maintenant la température de 34 degrés Celsius jusqu’à la fin du test. Quatre jours après l’injection.Le dernier jour du test, anesthésiez les xénogreffes avec une solution de tricaine 1X et alignez-les soigneusement sur la plaque de gélose. Jetez toutes les xénogreffes mortes ou enflées. Ces xénogreffes ne sont pas considérées pour la quantification de l’engraftment.Sur un stéréomicroscope de fluorescence, analysez soigneusement chaque xénogreffe et évaluez l’absence ou la présence de tumeurs dans l’espace perivitelline. Selon la configuration expérimentale, sélectionnez les xénogreffes d’intérêt et euthanasiez-les avec de la tricaine 25X. Fixez-les dans du formaldéhyde à 4% pendant au moins 4 heures à température ambiante pour procéder à l’immunomarquage.Sinon, conservez la nuit à quatre degrés Celsius et le lendemain, remplacez le formaldéhyde par du méthanol à 100%. Les xénogreffes fixées dans du méthanol à 100% peuvent être stockées à 20 degrés indéfiniment. Immunomarquage de monture entière pour l’imagerie confocale.L’ensemble de la technique d’immunofluorescence de montage prend trois jours, répartis comme suit. Le premier jour est pour la perméabilisation des xénogreffes et l’incubation des anticorps primaires. Le deuxième jour, pour le lavage et l’incubation d’anticorps secondaires.Et le troisième jour, pour le lavage, la fixation des xénogreffes et le stockage dans le support de montage. Vous trouverez plus de détails sur cette procédure dans le PDF ci-joint. Montage de xénogreffes.Scellez les bords d’un slip de couvercle avec de la vaseline ou de la graisse de silicone, afin que le support de montage ne fuit pas. À l’aide d’une pipette Pasteur, transférer les xénogreffes sur le couvercle. Alignez-les soigneusement avec une épingle à cheveux.Ajoutez le support de montage à un autre glissement de couvercle. Joignez soigneusement les deux feuillets de couverture et placez-les sur une lame de microscope pour faciliter la manipulation. Imagerie confocale.Une lentille d’objectif d’immersion apochromatique de 25X avec correction d’eau est optimale pour l’imagerie des tumeurs avec une résolution de cellule unique. Acquérir les échantillons à l’aide de la fonction Z-Stack avec un intervalle de cinq microns entre chaque tranche. Ouvrez les données brutes dans le logiciel Fidji.Sélectionnez trois tranches représentatives de la tumeur du haut, du milieu et du bas, par z-stack, par xénogreffe. Ouvrez le plugin Cell Counter à partir du logiciel Fiji. Dans l’outil Compteur de cellules, cliquez sur Initialiser, sélectionnez un type de compteur, puis cliquez sur l’image pour démarrer manuellement le mode de comptage.Pour chaque clic, le compteur demande combien de cellules sont comptées. Pour obtenir le nombre total de cellules dans la tumeur, utilisez la formule suivante. Pour évaluer le nombre total ou le pourcentage de marqueurs, tels que les cellules immunitaires, les figures mitotiques, la caspase activée, entre autres, quantifier manuellement les cellules qui sont positives à l’étiquetage spécifique, marqueur ou transgène d’intérêt le long de toutes les tranches de la pile z avec le plugin Cell Counter.N’oubliez pas que certaines cellules seront situées entre deux tranches. Faites des allers-retours dans la pile z pour vous assurer qu’aucune cellule n’est comptée deux fois. Résultats représentatifs.Des xénogreffes de variété de cellule de cancer côlorectal HCT 116 ont été générées comme décrit dans le protocole. Des xénogreffes ont été distribuées aléatoirement dans les témoins non traités et la chimiothérapie FOLFIRI. L’immunofluorescence a été exécutée pour détecter les cellules apoptotic, utilisant l’anticorps caspase-3 anti-clivé et le DAPI pour counterstaining nucléique.La quantification de l’index mitotic, de l’apoptose, et de la taille de tumeur, a indiqué que FOLFIRI induit une diminution significative de mitose et une induction significative d’apoptosis, accompagnée d’une réduction de 54% de taille de tumeur. Ces dispositifs sont utiles dans les criblages phénotypiques à haut débit de drogue, aussi bien que pour tester les effets intrinsèques et physiologiques de cellules de plusieurs traitements de cancer dans un court laps de temps. Un autre grand avantage du modèle de xénogreffe de poisson zèbre est qu’il est possible d’étudier les interactions de différentes cellules tumorales et d’analyser comment chaque type de cellule peut influencer le comportement de l’autre.Différentes cellules cancéreuses humaines, différents clones de la même tumeur, ou de différentes tumeurs, peuvent être co-injectés. Dans cet exemple, deux variétés de cellule de cancer côlorectal dérivées du même patient ont été étiquetées avec différents colorants lipophiles et mélangées dans un rapport de un-à-un pour l’injection. Nous espérons que ce protocole pourra aider les chercheurs à devenir de véritables experts dans la génération de xénogreffes de poisson zèbre.Ce n’est pas facile. Vous devez pratiquer, pratiquer. N’abandonnez pas.Je suis sûr que vous y arriverez. Bonne chance.

generation-of-zebrafish-larval-xenografts-and-tumor-behavior-analysis

Research

Recherche

JoVE Journal

Cancer Research

Recherche sur le cancer

Cette vidéo décrit la technique de création d’un modèle de xénogreffe dérivé d’un patient poisson-zèbre. Dans le protocole d’échantillon, nous évaluons l’efficacité des médicaments Gemcitabine et Navitoclax sur le modèle de xénogreffe de tumeur pancréatique.

Xénogreffe dérivée d’un patient de poisson-zèbre (zPDX) : un modèle de cancer

Cette vidéo décrit une méthode de micro-injection pour l’administration de cellules cancéreuses du sein dans l’espace périvitellin d’embryons de poisson-zèbre transgénique. Après l’incubation, nous visualisons l’embryon au microscope fluorescent pour observer l’invasion, la dissémination et les métastases des cellules cancéreuses.

zPDX-Analyse de l’invasivité : étude du comportement invasif des cellules cancéreuses métastatiques dans les xénogreffes d’embryons de poisson-zèbre

Cette vidéo décrit le test de xénogreffe de poisson-zèbre pour évaluer la formation de tumeurs in vivo et étudier l’effet des agents thérapeutiques.

Dosage de la xénogreffe de poisson-zèbre : une méthode pour évaluer l’efficacité anticancéreuse des produits thérapeutiques sur la tumorigénicité chez le poisson-zèbre in vivo

La transplantation de cellules cancéreuses est un outil important pour l'identification des mécanismes du cancer et des réponses thérapeutiques. Les techniques actuelles dépendent des animaux immunitaire incompétents. Ici, nous décrivons une méthode pour transplanter des cellules tumorales de poissons zèbres en embryons immunologiquement compétents pour l'analyse à long terme du comportement des cellules tumorales et des réponses aux médicaments in vivo .

Transplantation de tumeurs cérébrales pédiatriques de poisson zèbre dans des hôtes immunisés pour une étude à long terme du comportement des cellules tumorales et de la réponse aux médicaments

Ce protocole décrit des procédures d'optimisation dans un modèle de xénogreffe de tumeur à base de virus à double fluorescence utilisant le poisson zèbre larvaire comme hôtes. Ce modèle hétérogène de xénogreffe imite la composition tissulaire du microenvironnement pancréatique de cancer in vivo et sert d'outil plus précis pour évaluer des réponses de drogue dans les modèles personnalisés de zPDX (xénogreffe patient-dérivé de zèbre).

Modèle de xénogreffe hétérogène dérivé par le patient du cancer du pancréas à l'aide de larves de poisson zèbre comme hôtes pour l'évaluation comparative des médicaments

Le but de cette méthode est de générer un modèle in vivo de l'angiogenèse tumorale en xénogreffer les cellules tumorales mammifères dans un embryon de poisson zèbre qui a des vaisseaux sanguins fluorescents étiquetés. En imagerie du xénogreffe et des vaisseaux associés, une mesure quantitative de la réponse angiogénique peut être obtenue.

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts In Vivo

Les modèles de xénogreffe de poisson zèbre permettent le dépistage des médicaments à haut débit et l’imagerie fluorescente des cellules cancéreuses humaines dans un microenvironnement in vivo. Nous avons mis au point un flux de travail pour le dépistage automatisé à grande échelle des médicaments sur des échantillons de leucémie dérivés du patient chez le poisson zèbre à l’aide d’une unité d’imagerie automatisée équipée d’un microscope à fluorescence.

Dépistage de drogue des xénogreffes dérivées de tumeur de patient primaire dans le poisson-zèbre

Les modèles précliniques visent à faire progresser les connaissances sur la biologie du cancer et à prédire l’efficacité des traitements. Cet article décrit la génération de xénogreffes dérivées de patients (zPDX) à base de poisson zèbre avec des fragments de tissu tumoral. Les zPDX ont été traités par chimiothérapie, dont l’effet thérapeutique a été évalué en termes d’apoptose cellulaire du tissu transplanté.

Mise en place de xénogreffes de poisson zèbre provenant de patients atteints d’un cancer du pancréas pour des tests de chimiosensibilité

Nous décrivons un protocole de xénotransplantation dans le jaune d’embryons de poisson-zèbre transparent qui est optimisé par une méthode de stadification simple et rapide. Les analyses post-injection comprennent la survie et l’évaluation de la charge de morbidité des cellules xénotransplantées par cytométrie en flux.

Une méthode simple, rapide et efficace pour l’analyse de la xénotransplantation tumorale dans les embryons de poisson-zèbre transparent

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour l’implantation automatisée de xénogreffes tumorales dans des larves de poisson-zèbre à l’aide d’un système d’injection robotisé de pointe. De plus, nous présentons des vidéos d’injection et des données de validation démontrant les performances réussies du système.

Automatisation de l’implantation tumorale chez les larves de poisson-zèbre pour la recherche et la médecine du cancer

Découvrez la génération de xénogreffes larvaires de poisson zèbre pour l'analyse comportementale des tumeurs humaines. Ce protocole standardisé permet l'étude in vivo de la prolifération, de l'angiogenèse et des réponses thérapeutiques.

Génération de xénogreffes larvaires de poisson zèbre et analyse du comportement tumoral

Explorer plus de vidéos