Écouvillonner l’environnement urbain - Un pipeline pour l’échantillonnage et la détection du SARS-CoV-2 dans les réservoirs environnementaux

Cette étude présente un nouveau flux de travail pour détecter le SARS-CoV-2 sur des surfaces qui sont rarement nettoyées en milieu urbain, telles que les poignées de pompe à essence, les terrains de jeux et les distributeurs automatiques de billets. En cas de pandémie, les approvisionnements sont rares. Nous utilisons des matériaux, des réactifs et des équipements facilement accessibles disponibles dans des laboratoires de base.

Nous utilisons une méthode d’extraction qui préserve l’ARN sans chaîne du froid, et une méthode de détection résistante aux inhibiteurs. Ce protocole présente un intérêt pour la santé publique. Il fournit un cadre pour l’évaluation des réservoirs viraux environnementaux pour la pandémie actuelle de COVID-19 et d’autres agents infectieux lors de futures épidémies mondiales.

Recruter des citoyens scientifiques à l’aide d’un appel à l’action direct et clair publié via les médias locaux et sociaux. Créez un handle de médias sociaux pour connecter le sujet à travers le contenu des médias sociaux. Créer un lien vers le PSM, en fournissant un plug-in multilingue pour permettre la navigation dans plusieurs langues pour que les personnes demandent à participer à l’effort d’échantillonnage environnemental en répondant aux questions liées à la biosécurité spécifiées dans un formulaire en ligne.

Inclure dans la section d’échantillonnage des protocoles graphiques et audiovisuels en anglais et en espagnol. Visualisez les données géospatiales à l’aide d’une interface de programmation d’applications géospatiales facilitée par un fournisseur de services informatiques cloud. Stocker les données soumises au SGIL par l’intermédiaire du SMP pour faciliter le stockage centralisé, le suivi des flux de travail de traitement et la gestion de la logistique.

Informations de préchargement telles que l’ID du kit d’échantillons, l’ID d’échantillon, la date, l’heure et les coordonnées du système de positionnement global pour permettre la conformité des types de données et minimiser l’erreur. Incluez un lien de demande de ramassage d’échantillons pour les participants, qu’ils peuvent utiliser une fois qu’ils ont recueilli tous les échantillons. Construire une trousse qui contient toutes les fournitures d’échantillonnage, y compris l’équipement de protection individuelle nécessaire, comme un masque et des gants, un protocole d’échantillonnage et des renseignements pertinents en matière de biosécurité.

L’écouvillonnage désinfecte rarement les surfaces des ménages et de l’environnement urbain en mouillant un écouvillon absorbant le polyester carré d’un centimètre avec un détergent et en écouvillonnant une surface de 10 centimètres au carré. Aidé par un cure-dent, submergez chaque écouvillon d’échantillon dans le tube pré-marqué contenant 200 microlitres de thiocyanate de guanidinium. Portez le masque fourni et une nouvelle paire de gants pour le prélèvement de chaque échantillon afin d’éviter la contamination croisée.

Après avoir terminé l’échantillonnage, utilisez le désinfectant pour les mains fourni. Conservez les tubes à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient transportés au laboratoire. Une fois que les échantillons arrivent en laboratoire, conservez-les à moins 80 degrés Celsius.

Pour accélérer le dépistage, traitez les échantillons dans des piscines. Si un pool est positif, extraire l’ARN de chaque échantillon indépendamment. Combinez les échantillons de chaque trousse d’échantillonnage en deux bassins en regroupant 50 microlitres de chacun des huit échantillons dans un tube de microcentrifugation et en économisant les échantillons restants à moins 80 degrés Celsius.

Ajouter 80 microlitres de chloroforme et de vortex pendant 15 secondes. Incuber ensuite pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Centrifuger à 13 000 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.

Transférer la couche aqueuse dans un nouveau tube à microcentrifugation. Conservez le reste de l’interface et le liquide rose dans le congélateur à moins 80 degrés Celsius. Ces fractions contiennent de l’ADN et des protéines.

Extraire l’ARN de la couche aqueuse récupérée à l’aide d’un protocole d’extraction brute d’ARN à base de thiocyanate de guanidinium. Préparer le mélange réactionnel RT-LAMP à température ambiante avec un volume excédentaire de 10% pour tenir compte de la perte de pipetage. Ajouter cinq microlitres d’ARN à la réaction de l’échantillon et cinq microlitres d’ARN plus 2,5 microlitres d’ARN synthétique SARS-CoV-2 à la réaction enrichie.

Ajouter 2,5 microlitres d’ARN synthétique sars-CoV-2 au témoin positif et cinq microlitres d’eau au témoin négatif. Mélangez bien et faites tourner les réactions vers le bas. Pour l’observation colorimétrique, un résultat négatif est indiqué par le rose et un résultat positif est indiqué par le jaune.

Après RT-LAMP, effectuez une électrophorèse sur gel. La répartition des sites de prélèvement d’échantillons est présentée ici. La majorité des trousses étaient complètes, et les données correspondantes ont été téléchargées dans le SGIL.

La limite de détection à une fréquence de 100% était de 500 copies par 25 microlitres de réaction. Dans le RT-LAMP colorimétrique, les échantillons positifs ont changé de couleur du rose au jaune en raison d’un décalage du pH de huit à 5,5. À faible nombre de copies, des échantillons ont été exécutés sur un gel d’agarose pour confirmer les points positifs avec le modèle en forme d’échelle résultant.

Les méthodes RT QPCR ont été testées avec des échantillons environnementaux. Tous les mélanges maîtres étaient sensibles aux inhibiteurs à de faibles concentrations de nombre de copies du témoin positif. À de faibles concentrations du modèle, les méthodes traditionnelles de RT PCR ont montré des faux positifs et des faux négatifs.

Enfin, une technique appelée amplification en cercle roulant a détecté de petites quantités de la séquence cible. Cependant, il a montré l’amplification de la sonde en l’absence d’un modèle d’ARN. Il est essentiel de publier un appel à l’action qui atteint tous les secteurs de la communauté afin que l’échantillonnage représente vraiment le risque d’exposition de tous les membres de cette communauté.

Ce cadre détecte le matériel génétique du SARS-CoV-2. Les études visant à tester la viabilité virale sont la prochaine étape.