Extraction, purification et profilage des gangliosides

Les gangliosides sont exprimés sur toutes les surfaces cellulaires des vertébrés et sont particulièrement abondants sur les cellules nerveuses. Ils régulent la signalisation cellulaire et la reconnaissance cellule-cellule. Ce protocole introduit l’isolement et l’analyse gangliosides.

Les techniques ont été sélectionnées pour maximiser les rendements en ganglioside à grande et à petite échelle tout en rationalisant la purification. Nous décrivons également des méthodes permettant d’effectuer relativement rapidement des analyses qualitatives et semi-quantitatives des gangliosides. L’étude des lipides, en particulier des lipides polaires comme les gangliosides, nécessite des outils et des techniques différents de ceux du travail avec des protéines ou des acides nucléiques.

Cette vidéo vous familiarise avec la façon de travailler avec ces molécules. Parce que les solvants tels que le chloroforme et le tétrahydrofurane dissolvent les plastiques courants, nous utilisons des bouteilles et des flacons en verre avec des bouchons doublés de téflon, des pipettes en verre, du verre, des microsyringes en acier inoxydable et des homogénéisateurs en verre téflon tout au long de ces procédures. Si vous ne le faites pas, les produits contiennent des polymères plastiques qui peuvent interférer avec les analyses.

Pour commencer, ajoutez 4,1 millilitres d’eau par gramme de poids humide tissulaire et homogénéisez-le avec 10 coups. Ajouter 13 millilitres de méthanol par gramme de tissu. Transférez-le à une température ambiante de 22 degrés Celsius et mélangez.

Transférez le tissu dans un tube à paroi épaisse, en verre et à bouchon vissé avec un bouchon à vis doublé de PTFE, et mélangez bien. Ajouter 6,5 millilitres de chloroforme par gramme de tissu, le coiffer et bien mélanger. Centrifuger à 450 fois g pendant 15 minutes.

Transférez ensuite le surnageant clair dans un tube frais à bouchon vissé et mesurez le volume en tant que volume d’extrait récupéré. Pour le partitionnement, ajoutez 0,173 fois le volume d’extrait d’eau récupéré au surnageant clair. Ensuite, plafonnez-le.

Vortex vigoureusement. Centrifuger à 450 fois g pendant 15 minutes. Transférer la phase supérieure, qui contient les gangliosides, dans un tube en verre frais avec un bouchon à vis doublé de PTFE.

Pour effectuer une chromatographie sur cartouche en phase inverse, utilisez une seringue en verre de cinq millilitres pour laver une cartouche d’extraction en phase solide tC18 avec trois millilitres de méthanol. Ajoutez ensuite trois millilitres de chloroforme-méthanol-eau dans un rapport de deux à 43 à 55. Chargez la phase supérieure de l’étape précédente sur la cartouche tC18 à l’aide de la même seringue en verre.

Collectez le flux et rechargez-le sur la colonne pour optimiser l’adsorption. Lavez la cartouche avec trois millilitres de chloroforme-méthanol-eau, puis avec trois millilitres de méthanol-eau. Éluez les gangliosides avec trois millilitres de méthanol dans un tube frais à bouchon vissé.

Évaporez-vous à sec sous un doux jet d’azote à une température inférieure ou égale à 45 degrés Celsius. Dissoudre dans le méthanol à un millilitre par gramme de poids humide des tissus d’origine. Placez 100 grammes de matière grise cérébrale dans un mélangeur et ajoutez un millilitre par gramme de poids humide du cerveau réfrigéré de 10 millimolaires tampon de phosphate de potassium de pH 6,8.

Homogénéiser ensuite à basse température pendant 20 secondes. Ajouter huit millilitres de tétrahydrofurane par gramme de poids humide du cerveau et homogénéiser à faible intensité pendant 10 secondes. Décanter dans des bouteilles de centrifugeuse en verre et centrifuger à 5 000 fois g pendant 15 minutes.

Collectez le surnageant, mesurez son volume, puis transférez-le dans un entonnoir séparateur de verre. Ajouter 0,3 millilitre d’éther éthylique par millilitre du surnageant. Agiter vigoureusement.

Ensuite, laissez-le reposer sans être dérangé pendant 30 minutes, au cours desquelles deux phases, une phase éther supérieure et une phase aqueuse inférieure, se séparent. Recueillir la phase inférieure, qui contient les gangliosides, dans une bouteille en verre avec un bouchon doublé de PTFE. À la phase supérieure de l’éther restant dans l’entonnoir de séparation, ajoutez 0,1 millilitre d’eau par millilitre de surnageant d’origine de l’étape précédente.

Agiter vigoureusement. Laissez les phases se séparer. Ensuite, collectez la phase aqueuse inférieure et combinez-la avec la phase inférieure précédemment collectée.

Évaporez les phases inférieures combinées en une poudre sèche et pesez-la. Pour effectuer une chromatographie en phase inverse, prélavez une cartouche d’extraction en phase solide tC18 à grande échelle en faisant passer 50 millilitres de solvants à travers la colonne en utilisant le vide ou la pression pendant moins d’une minute par lavage. Chargez la phase supérieure de la séparation de phase post-saponification sur la colonne par vide ou pression.

Ensuite, collectez le flux entrant, rechargez-le et collectez à nouveau le flux pour une analyse ultérieure. Laver la colonne avec 30 millilitres chacun de chloroforme-méthanol-eau, suivi de méthanol-eau. Ensuite, éluez les gangliosides avec 50 millilitres de méthanol, puis à nouveau avec 10 millilitres de méthanol.

Collectez chaque lavage et élution séparément. Utilisez la chromatographie sur couche mince, ou TLC, pour confirmer que les gangliosides sont absents de l’écoulement et des lavages et élués lors de la première élution du méthanol. Évaporez les gangliosides élués en une poudre sèche et pesez-les.

Pour effectuer le TLC, versez le solvant courant dans une chambre TLC en verre de 10 x 10 centimètres avec un couvercle en acier inoxydable afin que la profondeur du solvant soit de 0,5 centimètre. Couvrez la chambre et laissez-la s’équilibrer pendant environ 10 minutes. Lavez une seringue Hamilton de 10 microlitres avec une aiguille biseautée à l’aide de méthanol.

Aspirez un microlitre de méthanol dans une seringue en verre pour remplir le volume mort de l’aiguille, puis un microlitre d’échantillon ou d’étalon. Repérez l’échantillon uniformément sur les lignes pré-marquées de cinq millimètres jusqu’à ce qu’il reste moins d’un microlitre de solvant méthanol dans la seringue. Laissez la plaque sécher à 22 degrés Celsius après que tous les échantillons ont été repérés.

Placez la plaque tachetée et séchée sur la chambre TLC prééquilibrée avec le bord inférieur immergé dans le solvant en cours d’exécution. Laissez le solvant en cours d’exécution avancer vers le haut de la plaque par action capillaire jusqu’à ce que le front du solvant atteigne à moins d’un centimètre du sommet de la plaque. Retirez et marquez le front du solvant sur le bord de la plaque avec un crayon.

Laissez les solvants s’évaporer complètement sans être dérangés ou sous un flux d’air doux. Dans une hotte à fumée chimique, placez la plaque TLC avec l’extrémité d’origine des gangliosides résolus à l’envers dans une boîte en carton découpée pour protéger les parois de la hotte des projections acides. Placez le réactif de pulvérisation de résorcinol dans un pulvérisateur TLC en verre.

Fixez-la à une source d’azote sous pression et vaporisez légèrement la plaque en diagonale dans les directions verticale et horizontale. Couvrez immédiatement la plaque avec une plaque de couverture en verre propre et sèche de mêmes dimensions et fixez la plaque de couverture en place avec des clips de liant. Chauffer la plaque couverte à 125 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Les gangliosides apparaîtront violet foncé sur un fond blanc. Pour effectuer la coloration lipidique, trempez la plaque TLC avec le côté d’origine des gangliosides résolus vers le bas dans un bécher contenant la tache d’anisaldéhyde. Immergez-vous vers l’avant pendant un peu plus de deux secondes.

Ensuite, laissez-le s’écouler. Chauffer la plaque TLC sur une plaque chauffante à basse température pour la développer. Ce protocole fournit des gangliosides en quantité et en pureté suffisantes pour la détermination qualitative et quantitative.

La résolution TLC d’un microlitre fournit suffisamment de matériel pour la détection du résorcinol et résout tous les principaux gangliosides cérébraux pour les souris de type sauvage et génétiquement modifiées. Bien que les gangliosides mélangés préparés ne soient pas exempts d’autres lipides majeurs, ils sont d’une pureté suffisante pour la détermination par spectrométrie de masse, soit sous forme de gangliosides purifiés natifs en mode négatif, soit après pré-méthylation en mode positif. La purification à grande échelle comprend l’extraction, la saponification et la résolution HPLC pour fournir des gangliosides cérébraux majeurs purifiés adaptés aux expériences biologiques et à d’autres modifications chimiques et enzymatiques.

Un profil HPLC exemplaire et une analyse TLC ultérieure sont présentés. Le traitement alcalin, ou saponification, est nécessaire pour hydrolyser et éliminer les phospholipides contaminants, mais hydrolysera également les modifications naturelles des gangliosides tels que les acides sialiques O-acétylés, ce qui peut être important dans certains contextes. Des rapports de solvant précis pour l’extraction, le partage des solvants et la résolution TLC sont essentiels pour améliorer la récupération, la pureté et les analyses.

Du cancer au métabolisme en passant par le fonctionnement du cerveau, les gangliosides sont des modificateurs physiologiques et des cibles thérapeutiques. L’isolement, la purification et les analyses des gangliosides sont les pierres angulaires de la découverte biomédicale et du développement thérapeutique.